一种抗氧化及耐高温胁迫的非编码RNAOsiR及其用途的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种抗氧化及耐高温胁迫的非编码RNA osiR基因的及其用途。

背景技术：

细菌非编码RNA(non-conding RNA,ncRNA)，是一些大小在40-500个核苷酸范围内的分子量相对较小的非编码RNA分子，通常位于蛋白编码基因的间区，具有茎-环形成的复杂高级结构，大多数具有不依赖于ρ因子的终止子结构。近年来的研究发现，细菌中非编码RNA可以作为转录后调控因子，通过多种机制调控基因的表达，在生命活动中发挥着重要作用。

技术实现要素：

本发明发现了一种非编码RNA新基因，其表达受氧化胁迫诱导，参与细菌的抗氧化及耐高温胁迫过程，命名为osiR基因，该基因大小为251bp，Genbank ID：MF964218。非编码RNA osiR基因的DNA序列为SEQ ID NO:1，其转录的RNA序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明发现该RNA基因在工程菌株改造方面具有广泛的应用潜力，可特异响应氧胁迫信号，明显提高菌株的抗氧化能力，并能够显著提高宿主菌的高温胁迫抗性。

具体发明工作如下：

1.构建表达osiR基因的重组工程菌株

1)通过PCR克隆出的完整的osiR基因的DNA片段序列进行酶切，插入表达载体pRADZ3中，构建重组质粒pRADZ3-OsiR。

2)将导入osiR基因的重组质粒pRADZ3-OsiR转入受体大肠杆菌Trans10，获得工程菌株Trans-OsiR(详见实施例1)；

2、表达osiR基因重组工程菌株Trans-OsiR的胁迫抗性分析

1)利用不同浓度的H2O2进行冲击，研究重组工程菌株Trans-OsiR的氧化胁迫抗性(详见实例2)

2)利用48℃摇床培养，研究重组工程菌株Trans-OsiR的高温胁迫抗性(详见实例3)

实验结果表明：非编码RNA osiR基因能够显著提高宿主细胞抵抗氧化胁迫和高温胁迫的能力，在提高菌株胁迫抗性方面具有良好的应用前景。

序列表信息

SEQ ID NO.1：非编码RNA osiR基因的DNA序列。

SEQ ID NO.2：非编码RNA osiR基因转录后的RNA序列。

附图说明：

图1重组表达载体pRADZ3-OsiR构建示意图；

图2重组表达载体pRADZ3-OsiR双酶切验证图。M1:Trans 15K maker；M2:Trans 100bp maker；1:pRADZ3-OsiR未酶切；2:pRADZ3-OsiR双酶切；

图3表达OsiR的工程菌Trans-OsiR的氧化胁迫抗性图。Trans-OsiR为表达osiR的重组菌株；Trans-Z3为含有空载体的对照菌株；

图4表达OsiR的工程菌Trans-OsiR的高温胁迫抗性图。Trans-OsiR为表达osiR的重组菌株；Trans-Z3为含有空载体的对照菌株。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明本发明的方法，而不用于限制本发明的范围。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件。

穿梭质粒pRADZ3：本实验室保存；

大肠杆菌Trans10：为北京全式金公司市售产品。

实施例1表达osiR基因的大肠杆菌重组工程菌株的构建

一、实验材料

大肠杆菌Trans10：为北京全式金公司市售产品。

PCR模板DNA：耐辐射异常球菌基因组DNA

二、实验方法

1.根据已公布的耐辐射异常球菌基因组设计1对PCR特异性引物：

OsiR-F：5’CGGACTAGTGACATGTATTCGTCTGACC 3’

OsiR-R：5’CGCCATATGCCTGGCCGAGCTCACCGG 3’

2.通过PCR方法从耐辐射异常球菌基因组DNA中扩增出目的基因序列。

反应条件：95℃10min，[95℃30sec，58℃30sec，72℃0.5min]35个循环，72℃10min。

3.PCR产物经胶回收后，利用SpeI和NdeI酶进行双酶切。获得含有粘性末端的osiR基因，连接于pRADZ3载体上，构建大肠杆菌高表达载体pRADZ3-OsiR(图1)。将该表达载体转化大肠杆菌Trans10，构建表达osiR基因的重组工程菌株。挑去阳性克隆菌株，提取质粒DNA筛选不同的重组子，利用SpeI和NdeI酶进行双酶切及测序验证。

三、实验结果

利用PCR技术成功克隆了耐辐射异常球菌osiR基因，成功构建了表达osiR的重组大肠杆菌工程菌株。经PCR、酶切，测序验证插入序列正确，将该菌株命名为Trans-OsiR。含有pRADZ3空质粒的对照菌株命名为Trans-Z3。

四、实验结论

完成表达osiR的重组大肠杆菌工程菌株的构建。

实施例2表达osiR基因重组工程菌株Trans-OsiR的氧化胁迫抗性分析

一、实验材料

重组工程菌株：实施例1得到的表达osiR基因的Trans-osiR菌株

对照菌株：实施例1所述含空质粒的Trans-Z3菌株。

二、实验方法

1.培养

分别挑取固体平板上单菌落接种于含Amp的液体LB培养基中，37℃恒温摇床培养过夜

2.氧化胁迫(H2O2冲击)

将种子液转接于新的LB培养基，培养至OD600约0.6左右。各取1mL菌体加入终浓度为10、15、20mM H2O2冲击10min，

3.结果观测，与空白对比

每个处理进行倍比梯度稀释至10^-5。未经氧化处理的样品为空白对照。吸取每个处理的稀释梯度样品8μL点在LB固体平板上，37℃培养观测菌株的氧化胁迫抗性。

三、实验结果

如图3所示：

10mM H2O2氧化胁迫下，重组菌株Trans-OsiR与对照菌株Trans-Z3相比，其生存率提高了10倍。

15mM和20mM浓度的H2O2氧化胁迫下，重组菌株Trans-OsiR与对照菌株Trans-Z3相比，其生存率提高了2个数量级，约100倍。

四、实验结论

H2O2氧化冲击实验结果显示，非编码RNA基因osiR的表达显著提高宿主大肠杆菌的氧化胁迫抗性。

实施例3表达osiR基因重组工程菌株Trans-OsiR的高温胁迫抗性分析

一、实验材料

重组工程菌株：实施例1得到的表达osiR基因的Trans-OsiR菌株

对照菌株：实施例1所述含空质粒的Trans-Z3菌株。

二、实验方法

1.培养

分别挑取固体平板上单菌落接种于含Amp的液体LB培养基中，37℃恒温摇床培养过夜。

2.48℃高温胁迫

将种子液转接于新的LB培养基，培养至OD600约0.8左右。各取5mL菌液放置于48℃摇床冲击4h。

3.结果观测，与空白对比

每个处理进行倍比梯度稀释至10^-5。未经氧化处理的样品为空白对照。吸取每个处理的稀释梯度样品8μL点在LB固体平板上，37℃培养观测菌株的高温胁迫抗性。

三、实验结果

如图4所示：

48℃高温胁迫下，重组菌株Trans-OsiR与对照菌株Trans-Z3相比，其生存率提高了2个数量级，约100倍。

四、实验结论

48℃高温冲击实验结果显示，非编码RNA基因osiR的表达显著提高宿主大肠杆菌的高温胁迫抗性。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 一种抗氧化及耐高温胁迫的非编码RNA OsiR及其用途

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 251

<212> DNA

<213> 耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）

<400> 1

atgtattcgt ctgacctcga cctcaccacc aaagccctca tgcgcgaaca ggcccttcac 60

gagccgcagg ccatgacctc atgggaagct catgaccgcc gcgaaagccg cagcgtgcgc 120

cgcgccctga actggctgga acgccgcctg cgccggagcg cttgaggccg catcatttgc 180

ccacgcagaa gttgcgaaac acagcgtcca ccacatcttc ctgcacgtcc tgaccggtga 240

gctcggccag g 251

<210> 2

<211> 532

<212> RNA

<213> 耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）

<400> 2

auguauucgu cugaccucga ccucaccacc aaagcccuca ugcgcgaaca ggcccuucac 60

gagccgcagg ccaugaccuc augggaagcu caugaccgcc gcgaaagccg cagcgugcgc 120

cgcgcccuga acuggcugga acgccgccug cgccggagcg cuugaggccg caucauuugc 180

ccacgcagaa guugcgaaac acagcgucca ccacaucuuc cugcacgucc ugaccgguga 240

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