一种GI.1型札幌病毒基因组扩增引物和扩增方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种GI.1型札幌病毒基因组扩增引物和扩增方法。

背景技术：
：

札幌病毒(Sapovirus,SaV)是目前全球急性胃肠炎的重要肠道病毒之一，尤其在婴幼儿中普遍存在，对于高危人群还存在致死的危险。除感染人类外，SaV还从多种动物中获得检出，也是养殖业中导致动物腹泻的常见病原。随着分子生物学技术在病毒检测领域的快速发展与应用，SaV的危害得到了广泛的认识，其感染与流行水平成为了各国关注的公共卫生安全问题。目前仍没有有效的病毒疫苗以及治疗手段。

SaV属于杯状病毒科(Caliciviridae)札幌病毒属，它具有一个大小为7.1-7.7kb的单链正义RNA基因组，包括了2个开放阅读框(open reading frames,ORFs)。其中，病毒的ORF1编码一个前体蛋白和一个主要衣壳蛋白VP1。前体蛋白经蛋白酶分解后可形成六个非结构蛋白。VP1是组成病毒衣壳的基本元件，蛋白大小为60kDa左右，可以分成四个结构域，分别为N端可变区、N端区、中间可变区、以及C端区。其中，中间可变区是病毒基因组上最易变异的区域，是病毒免疫原性的主要决定区。病毒ORF2能够编码一种小衣壳蛋白VP2，但它的功能目前还不清楚。此外，对于来自蝙蝠以及某些人源的SaV，其病毒基因组上还存在ORF3。

作为RNA病毒，SaV具有丰富的遗传多样性。根据衣壳蛋白VP1全长序列进行分类，SaV能够分成GI-GV共5个基因群(Genogroup)，其中GI、GII、GIV和GV可以感染人类。不同基因群可以进一步分成不同的基因型(Genotype)，例如人源GI和GII可各分成7个基因型，GV包括2个基因型，GIV仅为1个，病毒重组现象在SaV进化过程中普遍存在的。目前GI.1是在SaV相关急性胃肠炎中检出率最高的基因型，然而关于该型别的基因组信息仍非常有限，尤其是在获得长片段或病毒全长基因组方面。目前GenBank中已报道的基因组仅三十余条。因此，在未来的SaV研究中，需要在病毒流行监测过程中进一步加强病毒遗传信息的积累工作，有必要提供一种针对GI.1型SaV基因组的扩增引物和扩增方法，为积累GI.1型SaV基因组序列资源提供了一个有力的研究工具。

技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种GI.1型札幌病毒基因组扩增引物和扩增方法。

本发明人在前期食源性病毒研究积累的基础上，针对SaV基因组特征开发了一种“4+1+1”的分段扩增策略，通过在保守区域设计扩增引物和测序引物，从而建立起一种灵敏度高、操作简单、时效性好以及易推广的病毒基因组扩增方法。

具体地，本发明提供的GI.1型札幌病毒基因组扩增引物，包括六对扩增引物和一条5'端测序引物：

引物对1：SaV-I.1-1F：5'-GTGATTGGTTAGATGGYTTCC-3'；

SAV-I.1-1R：5'-GCRATCCCAATCATYGTYTC-3'；

引物对2：SAV-I.1-2F：5'-CCCARGCAAACAACATYAG-3'；

SAV-I.1-2R：5'-CCACTCRTCATACTCATC-3'；

引物对3：SAV-I.1-3F：5'-TGTGAGGTGGTTGCMGA-3'；

SAV-I.1-3R：5'-AGCTCATCYTTAAGTGCCA-3'；

引物对4：SAV-I.1-4F：5'-GCATGTGAGYTGCTTGA-3'；

SLV5749：5'-TGTCATACCACCAGGGGTTGA-3'；

引物对5：SLV5317：5'-CTCGCCACCTACRAWGCBTGGTT-3'；

SAV-I.1-5R：5'-ACYAACCAACTCATTGGA-3'；

引物对6：SAV-I.1-6F：5'-CACCAAGCAATAYTGTACTCG-3'；

SAV-I.1-6R：5'-TGTCYRAAACCCACCCGAA-3'；

测序引物：SAV-I.1-seq1R：5'-CCATTTCTTGTTGYACTGCC-3'；

R代表A/G，Y代表C/T，M代表A/C，W代表A/T，B代表C/G/T。

本发明还提供一种GI.1型札幌病毒基因组扩增方法，具体为：分别以上述的引物对SaV-I.1-1F/SaV-I.1-1R、SaV-I.1-2F/SaV-I.1-2R、SaV-I.1-3F/SaV-I.1-3R、SaV-I.1-4F/SLV5749、SLV5317/SaV-I.1-5R、SaV-I.1-6F/SaV-I.1-6R作为扩增引物的上下游引物，以GI.1型札幌病毒的RNA为模板进行RT-PCR扩增，分别得到扩增产物，然后采用以上每对扩增引物对和5'端测序引物SaV-I.1-Seq1R分别对相对应的扩增产物进行核酸序列测序，再通过拼接比对，获得GI.1型札幌病毒基因组序列。

进一步地，所述的RT-PCR，其反应体系为：含有2×one-step RT-PCR mixture 10μL，10μmol/L上游引物和10μmol/L下游引物各0.6μL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0.8μL，RNA模板2μL，其余由双蒸水补足至20μL；反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃75s，共30次循环后，最后72℃延伸7min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明针对常见的GI.1型札幌病毒基因型，开发了一种“4+1+1”的分段扩增策略，能够有效覆盖目标病毒的整个基因组；通过应用于实际检出样本的扩增、测序及序列拼接，从而获得GI.1型札幌病毒基因组序列。本发明具有效率高、操作简单、易推广等特点，一个工作日内即可获得GI.1型札幌病毒样本的基因组序列，可广泛应用于医疗卫生、检验检疫等具有札幌病毒检测需求的机构以及相应的科研领域。

附图说明：

图1为GI.1型札幌病毒基因组扩增策略与相应引物的设计位置。

图2为适用于GI.1型札幌病毒基因组扩增用引物的RT-PCR退火温度优化，电泳顺序为M，1-28，其中M为DNA Ladder，1-4、5-8、9-12、13-16、17-20、21-24、25-28分别为基因组扩增引物SaV-I.1-1F/SAV-I.1-1R、SAV-I.1-2F/SAV-I.1-2R、SAV-I.1-3F/SAV-I.1-3R、SAV-I.1-4F/SLV5749、SLV5317/SaV-I.5R、SAV-I.1-6F/SAV-I.1-6R及检测引物SLV5317/SLV5749在不同退火温度(依次为45℃、50℃、55℃、60℃)下扩增产物的电泳结果。

图3为适用于GI.1型札幌病毒基因组扩增的RT-PCR引物浓度优化，图A-图F分别为引物SaV-I.1-1F/SAV-I.1-1R、SAV-I.1-2F/SAV-I.1-2R、SAV-I.1-3F/SAV-I.1-3R、SAV-I.1-4F/SLV5749、SLV5317/SaV-I.5R、SAV-I.1-6F/SAV-I.1-6R的优化结果，电泳顺序为M，1-9，其中M为DNALadder，1-3为0.2μL引物分别扩增以RNA原液、RNA原液稀释10倍、RNA原液稀释100倍为模板的电泳结果，4-6为0.6μL引物分别扩增以RNA原液、RNA原液稀释10倍、RNA原液稀释100倍为模板的电泳结果，7-9为1.0μL引物分别扩增以RNA原液、RNA原液稀释10倍、RNA原液稀释100倍为模板的电泳结果。

图4为GI.1型札幌病毒基因组扩增用引物的RT-PCR灵敏度评价，电泳顺序为M，1-35，其中M为DNA Ladder，1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35分别为基因组扩增引物SaV-I.1-1F/SAV-I.1-1R、SAV-I.1-2F/SAV-I.1-2R、SAV-I.1-3F/SAV-I.1-3R、SAV-I.1-4F/SLV5749、SLV5317/SaV-I.5R、SAV-I.1-6F/SAV-I.1-6R和检测引物SLV5317/SLV5749在病毒RNA不同稀释度(依次为10¹-10⁵倍稀释)下扩增产物的电泳结果。

图5为实际样本中GI.1型札幌病毒基因组的扩增效果，电泳顺序为M，1-18，其中M为DNALadder，1-6为实际样本L13进行扩增GI.1型札幌病毒基因组6个片段的电泳结果，7-12为实际样本L30进行扩增GI.1型札幌病毒基因组6个片段的电泳结果，13-18为实际样本L509进行扩增GI.1型札幌病毒基因组6个片段的电泳结果。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1GI.1型札幌病毒基因组的扩增策略及相应引物的设计

GI.1型札幌病毒基因组大小约7.4kb，包括两个ORF，其中ORF1长约6.8kb，ORF2长约0.5kb。以一代桑格脱氧核苷酸测序法为基础，设定每个扩增片段大小范围为1.3kb-1.6kb，相邻片段间存在100bp以上的重叠区域，其中ORF1中不含VP1区域分为4个片段，VP1和ORF2均各为1个片段。此外，为获得基因组5'端完整序列，在基因组5'端设计扩增长度在100-800bp的片段，相应引物命名为SAV-I.1-seq1R。具体基因组分段策略及相应引物位置可见图1。

在以上限制条件下，采用Oligo软件设计相应的引物，具体引物信息见表1。其中，引物核苷酸序列中的R代表A/G，Y代表C/T，M代表A/C，W代表A/T，B代表C/G/T。

表1：GI.1型札幌病毒基因组扩增引物及测序引物信息

^a引物位置参考的GI型札幌病毒代表序列GenBank登录号为X86560。

实施例2适用于GI.1型札幌病毒基因组扩增用引物的RT-PCR退火温度优化

(1)病毒样本处理及核酸提取：通过PBS溶液(DEPC处理)稀释收集的待处理样品(GI.1型札幌病毒阳性样本L13)至10％(w/v)浓度，振荡混匀，于12000×g下离心10min，收集上清液140μL，并通过RNA提取试剂盒抽提样本中病毒RNA共60μL。

(2)基因组分段扩增法：即分6段扩增，所使用的引物对如下：SaV-I.1-1F/SAV-I.1-1R、SAV-I.1-2F/SAV-I.1-2R、SAV-I.1-3F/SAV-I.1-3R、SAV-I.1-4F/SLV5749、SLV5317/SaV-I.5R、SAV-I.1-6F/SAV-I.1-6R，每次RT-PCR反应选择一对引物。采用20μL的一步法RT-PCR反应体系，含有2×one-step RT-PCR mixture 10μL，10μmol/L上游引物和10μmol/L下游引物各0.6μL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0.8μL，样本RNA模版2μl，其余由ddH2O补足。

反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，45-60℃30s，72℃75s，共30次循环后，72℃最后延伸7min。

退火温度分别选择为45℃、50℃、55℃、60℃。

以检测引物SLV5317/SLV5749作为对照，按照上述体系和反应条件进行。

(3)电泳：取扩增产物5μL，1.0％的琼脂糖凝胶(含0.05％Gold View核酸染料)进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对SaV-I.1-1F/SAV-I.1-1R、SAV-I.1-2F/SAV-I.1-2R、SAV-I.1-3F/SAV-I.1-3R、SAV-I.1-4F/SLV5749、SLV5317/SaV-I.5R、SAV-I.1-6F/SAV-I.1-6R的顺序，GI.1型札幌病毒基因组扩增条带依次为1631bp、1541bp、1409bp、1634bp、1783bp、730bp。电泳结果如图2，结果表明，六对基因组扩增引物具有较宽的退火温度范围，为减少在实际样本中的非特异扩增，最终选择55℃为应用退火温度。

实施例3适用于GI.1型札幌病毒基因组扩增的RT-PCR引物浓度优化

(1)病毒样本处理及核酸提取：通过PBS溶液(DEPC处理)稀释收集的待处理样品(GI.1型札幌病毒阳性样本L13)至10％(w/v)浓度，振荡混匀，于12000×g下离心10min，收集上清液140μL，通过RNA提取试剂盒抽提样本中病毒RNA共60μL，并采用无核酸酶的ddH2O进行10×梯度的稀释处理，分别选取RNA原液(原液的浓度是10³RTPCRU)、RNA原液稀释10倍和RNA原液稀释100倍作为扩增模板。需要注意的是，本发明中札幌病毒的含量采用了RTPCRU单位来定义，即为采用检测引物SLV5317/SLV5749，通过标准的RT-PCR方法对10×梯度稀释的病毒液进行检测，则稀释至到恰能检出时的病毒浓度为一个RTPCRU。

(2)基因组分段扩增法：即分6段扩增，所使用的引物对如下：SaV-I.1-1F/SAV-I.1-1R、SAV-I.1-2F/SAV-I.1-2R、SAV-I.1-3F/SAV-I.1-3R、SAV-I.1-4F/SLV5749、SLV5317/SaV-I.5R、SAV-I.1-6F/SAV-I.1-6R，每次RT-PCR反应选择一对引物。采用20μL的一步法RT-PCR反应体系，含有2×one-step RT-PCR mixture 10μL，10μmol/L上游引物和10μmol/L下游引物分别按不同条件加入0.2μL、0.6μL、1.0μL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0.8μL，不同稀释度样本RNA模版2μl，其余由ddH2O补足。

反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃75s，共30次循环后，72℃最后延伸7min。

(3)电泳：取扩增产物5μL，1.0％的琼脂糖凝胶(含0.05‰Gold View核酸染料)进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对SaV-I.1-1F/SAV-I.1-1R、SAV-I.1-2F/SAV-I.1-2R、SAV-I.1-3F/SAV-I.1-3R、SAV-I.1-4F/SLV5749、SLV5317/SaV-I.5R、SAV-I.1-6F/SAV-I.1-6R的顺序，GI.1型札幌病毒基因组扩增条带依次为1631bp、1541bp、1409bp、1634bp、1783bp、730bp。电泳结果如图3，结果表明，不同引物对对引物浓度要求不一致，但最优条件均为或包括0.6μL，因此，最终选择0.6μL为扩增体系中引物的添加量。

实施例4 GI.1型札幌病毒基因组扩增用引物的RT-PCR灵敏度评价

(1)病毒样本处理及核酸提取：通过PBS溶液(DEPC处理)稀释收集的待处理样品(GI.1型札幌病毒阳性样本L13)至10％(w/v)浓度，振荡混匀，于12000×g下离心10min，收集上清液140μL，并通过RNA提取试剂盒抽提样本中病毒RNA共60μL，并采用无核酸酶的ddH2O进行10×梯度的适当稀释(依次为10¹-10⁵倍稀释)处理。

(2)基因组分段扩增法：即分6段扩增，所使用的引物对如下：SaV-I.1-1F/SAV-I.1-1R、SAV-I.1-2F/SAV-I.1-2R、SAV-I.1-3F/SAV-I.1-3R、SAV-I.1-4F/SLV5749、SLV5317/SaV-I.5R、SAV-I.1-6F/SAV-I.1-6R，每次RT-PCR反应选择一对引物。采用20μL的一步法RT-PCR反应体系，含有2×one-step RT-PCR mixture 10μL，上游引物和下游引物(10μmol/L)各0.6μL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0.8μL，样本RNA模版2μL，其余由ddH2O补足。

反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃75s，共30次循环后，72℃最后延伸7min。

以检测引物SLV5317/SLV5749作为对照，按照上述体系和反应条件进行。

(3)电泳：取扩增产物5μL，1.0％的琼脂糖凝胶(含0.05％Gold View核酸染料)进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对SaV-I.1-1F/SAV-I.1-1R、SAV-I.1-2F/SAV-I.1-2R、SAV-I.1-3F/SAV-I.1-3R、SAV-I.1-4F/SLV5749、SLV5317/SaV-I.5R、SAV-I.1-6F/SAV-I.1-6R的顺序，GI.1型札幌病毒基因组扩增条带依次为1631bp、1541bp、1409bp、1634bp、1783bp、730bp，电泳结果如图4，结果显示：与检测引物SLV5317/SLV5749对比，引物对SAV-I.1-2F/SAV-I.1-2R、SAV-I.1-3F/SAV-I.1-3R、SAV-I.1-6F/SAV-I.1-6R与检测引物SLV5317/SLV5749的灵敏度一致，而引物对SaV-I.1-1F/SAV-I.1-1R、SAV-I.1-4F/SLV5749、SLV5317/SaV-I.5R则超出检测引物SLV5317/SLV5749的灵敏度一个数量级。

实施例5实际检出样本中GI.1型札幌病毒基因组的扩增效果

(1)病毒样本处理及核酸提取：取GI.1型札幌病毒阳性样本L13、L30、L509，通过PBS溶液(DEPC处理)稀释待处理样品至10％(w/v)浓度，振荡混匀，于12000×g下离心10min，收集上清液140μL，并通过RNA提取试剂盒抽提样本中病毒RNA共60μL。

(2)基因组分段扩增法：即分6段扩增，所使用的引物对如下：SaV-I.1-1F/SAV-I.1-1R、SAV-I.1-2F/SAV-I.1-2R、SAV-I.1-3F/SAV-I.1-3R、SAV-I.1-4F/SLV5749、SLV5317/SaV-I.5R、SAV-I.1-6F/SAV-I.1-6R，每次RT-PCR反应选择一对引物。采用20μL的一步法RT-PCR反应体系，含有2×one-step RT-PCR mixture 10μL，上游引物和下游引物(10μmol/L)各0.6μL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0.8μL，样本RNA模版2μL，其余由ddH2O补足。

反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃75s，共30次循环后，72℃最后延伸7min。

(3)电泳：取扩增产物5μL，采用1.0％的琼脂糖凝胶(含0.05‰Gold View核酸染料)进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对SaV-I.1-1F/SAV-I.1-1R、SAV-I.1-2F/SAV-I.1-2R、SAV-I.1-3F/SAV-I.1-3R、SAV-I.1-4F/SLV5749、SLV5317/SaV-I.5R、SAV-I.1-6F/SAV-I.1-6R的顺序，GI.1型札幌病毒基因组扩增条带依次为1631bp、1541bp、1409bp、1634bp、1783bp、730bp大小附近范围内，电泳结果如图5，结果表明，三份样本均成功获得扩增，其中片段5存在少量300bp左右的非特异性扩增，但并不影响片段的测序效果。

(4)核酸测序与基因组拼接比对：分别采用以上六对扩增引物以及一条5'端测序引物SAV-I.1-seq1R对相对应扩增出的L13、L30、L509样本的扩增产物测序并拼接，分别获得三条基因组序列：样本L13基因组长度为7396bp，其基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；样本L30基因组长度为7398bp，其基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；样本L509基因组长度为7380bp，其基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。将以上三条基因组序列分别提交进行BLAST分析，结果表明，覆盖度以及相似率均大于90％的有11条序列，分别包括：KT327081/Zhejiang1/China/2014、KX980412/Hunan/China/2016、AY646854/Chanthaburi-74/Thailand、AY694184/Dresden/pJG-Sap01/DE、AY646853/NongKhai-50/Thailand、KJ858686/IJC04/Tchimpounga/2011、HM002617/Sapporo/MT-2010/1982、X86560/Sapporovirus-Manchester、AY237423/SapovirusN21、AY237422/SapovirusMc114、KP298674/Seoul/ROK62/2013/KOR。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

广东环凯微生物科技有限公司

<120> 一种GI.1型札幌病毒基因组扩增引物和扩增方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7396

<212> DNA

<213> 札幌病毒 GI.1 L13(sapovirus GI.1 L13)

<400> 1

gtgattggtt agatggtttc caagccattc aagccaatag ttctcaatgt cactttcgag 60

tggcaggtct tcaagcggtg ctacctcagg gtagcgccgc gtgaagcatt ttgtgagaac 120

ttgagtgaac ttcatcacta ttttgccagg cgtgtgaacg cctggctcaa gcatgccaca 180

aggaccctcc cagacaaata cacgtttgtc gaggagggtc tccttgacat gtttggtaca 240

aaggctcctg acagtgttca agaaggcaca ctgttccggg agctgttcgg ggttgaccaa 300

accgagcaat tcccgctgtc cctcgcagac ttggccaagt tgcaaggaga acttgttgac 360

gcgacccgca ccccaggaca cgcattgcgt caaaagtaca caatgaccac tatacaggac 420

ttgattgata agattaccaa ggttgtgcca gtacaggcta cgctcactga gatgcacgcg 480

cgcaggcaat tcgagcgtga acgagctgac ctgtttcatg aactcccatt agtggatgag 540

gatgctggtt cgcaacccaa aacttacttc tacaccatgt ggcgccaagt tgtgaagaag 600

ggtaaagcgt acttctgccc tctcgtcaag acgagtgcat ggcgcaccaa gatcagtgcc 660

ataacagaac ccatcaagga cttcttaatt gcgttttgcc aggcagtgca acaagaaatg 720

ggcgtcaacc cgcaatattt acaacttgcc tggctgcaga aactcaaacc caccacatta 780

accatcattc ttcaacaaca caagcacacc gtctcagggt ggctggccac tatgacagca 840

cttgtagaag tgtactcaaa tctgtttgat gacttacgca aatcctcagt tgccatcgtg 900

tcaagcattg gagccttctt tgacatttgt aaagattttg tgtcacaggt tgtagagctg 960

gtcaaaacga cattcactgc ccagggtccg acagacttgg ggtgggcagc agtgctggca 1020

ggggctgcaa tgattttgct aaaaatgtct gggtgcccag gcgtcattgg tatgtggaca 1080

aaagtactta aaatctgtgg gggcatcacc actatcacag cagcggcgcg tggagtgcgt 1140

tggctgaagg atctctatga ggaggctgaa ggacgtaggc tagcaaaaat gtacatggca 1200

cgcggtgccg ccctcattga acttgctgct agtcgtgagg ttacaggcat tgatgagctc 1260

aagggcctcc ttgattgttt taccatacta atcgaggagg gcactgaact catccacaag 1320

tttggcacta gcccactggc aggtctggta cgcacatatg tgtccgaact agaaactcag 1380

gcaaacaaca ttagatccac cattaagctt gataccccca gacgggtgcc cgttgtcatt 1440

atccttaccg gggcacctgg catcgggaaa actcgcttag cacaatatgt tggccagcga 1500

tttgggaaaa cctctaactt ctcagtagct gtggaccacc atgatggcta cacagggaac 1560

actgtttgca tatgggatga atttgatgtt gattccaagg gtgcgtttgt ggagacaatg 1620

attgggatcg caaatacggc acccttcccg ttaaattgtg acagggttga aaataaaggg 1680

cgtgtgttca cgtccgatta tgtcatttgt acatccaatt accctacatc cgtcatccca 1740

gacaacccaa gagctgcggc cttttaccgt agggtcctaa ctgttgatgt cagcgcgcca 1800

gatttggagg aatggaaaaa gaggaaccct ggcaaacgcc ctactccaga cttataccaa 1860

gatgattttt cccatcttaa attgatgcta agaccatatt tgggttacaa tccagacgga 1920

gacacacttg aaggtcccag agttgcccca acccaaataa gtatagcggg actgataacc 1980

ctaatggaaa gaaggtttaa ggaacaggct gggcccctgc agaacttgtg gttacaagtc 2040

ccaaagtcac ttgtggagca gtccacaaat atggtcaaaa cattcatgta cgccaaccgc 2100

gcagtgtgtg acgtgatacc taatcccgcc acccgtgaca tcaccgaaac tgcgttgtca 2160

aaaatctttg tgtgtggcac cgccccacca cctgagttcg ttggcaagca tatagtcatc 2220

actggcatag aggtgggtga tgcatccatt gccaactcac tactgtccat gttcaccacc 2280

accacacgac tgtctgccgc ggctcagagg gagtacatgt acagagtgtg gagtccactc 2340

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cacatccaag atcgaagtat aaacactcaa aacctcccat acatcaatag agtgatccca 2400

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agatccacca ttaagcttga tacccccaga cgggtgcccg ttgtcattat ccttaccggg 1440

gcacctggca tcgggaaaac tcgcttagca caatatgttg gccagcgatt tgggaaaacc 1500

tccaacttct cagtagctgt ggaccaccat gatggctaca cagggaacac tgtttgcata 1560

tgggatgaat ttgatgttga ttccaagggt gcgtttgtgg agacaatgat tgggatcgca 1620

aatacggcac ccttcccgtt aaattgtgac agggttgaaa acaaagggcg tgtgttcacg 1680

tccgattatg tcatttgtac atccaattac cctacatccg tcatcccaga caacccaaga 1740

gctgcggcct tttaccgtag ggtcctaact gttgatgtca gcgcgccaga tttggaggaa 1800

tggaaaaaga ggaaccctgg caaacgccct actccagact tataccaaga tgatttttcc 1860

catcttaaat tgatgctaag accatatttg ggttacaatc cagacggaga cacacttgaa 1920

ggtcccagag ttgccccaac ccaaataagt atagcgggac tgataaccct aatggaaaga 1980

aggtttaagg aacaggctgg gcccctgcag aacttatggt tacaagtccc aaagtcactt 2040

gtggagcagt ccacaaatat ggtcaaaaca ttcatgtacg ccaaccgcgc agtgtgtgac 2100

gtgataccta atcccgccac ccgtgacatc accgaaactg cgttgtcaaa aatctttgtg 2160

tgtggcaccg ccccaccacc tgagttcgtt ggcaagcata tagtcatcac tggcatagag 2220

gtgggtgatg catccattgc caactcacta ctgtccatgt tcaccaccac cacacgactg 2280

tctgccgcgg ctcagaggga gtacatgtac agagtgtgga gtccactcat ccacatccaa 2340

gatcgaagta taaacactca aaacctccca tacatcaata gagtgatccc agtgacatcc 2400

cactgggact ttttgagggg tctgcggcac caccttggtt tcacatctat tccaggcatg 2460

tggaaggcat ttcaaggttg gcgcacatca cagggcatag ttgactttgt ggcacatcat 2520

atggcagatg tcacattccc aagtaaccca gaatgcacca tttttcgcac accagatgca 2580

gatgtggtct tttacacttt tggctcatat gtatgttttg ccaccccagc acgggtgccg 2640

tatgttggca caccacccac caccatccac tccaacacac cccgatgcat gacttggggt 2700

gaaaccatag cactgttgtg tgaggtggtt gccgagtttg tccttcattt tggtcccgtg 2760

attctgtctg cagccaacat tgcctacctt atgaccaggg ggtcaaggac tgaggaggcc 2820

aagggcaaaa ccaaacatgg acgtggcatg cgccatggcc acagggccgg agtgagcctc 2880

tcagacgatg agtatgatga gtggcgtgac ttgatgcgtg attggaggcg tgacatgagt 2940

gtcaatgact tcctgatgct cagagagagg tctgcgcttg gaatggatga tgaggatgtg 3000

gccaggtaca gggcatggct tgagatccgc gccatgcgaa tggcaggggg tgcgtataca 3060

catgccacta tcattgggcg tggtggtgtg cgagatgaga tcatacgcac ggcgccacgc 3120

agagccccaa ctcggcccca acaacactat gaggaagagg ccccaacagc aattgtggag 3180

ttcacgcagg gcggtgacca cattggatac ggggttcaca ttggcaatgg caatgtggta 3240

accgtcaccc acgtggcatc aacgtctgac gagatcaatg gtagtgcctt taaaataaca 3300

cgcactgttg gagagacaac gtgggtgcaa gggccattct cacaattacc acacatgcaa 3360

ataggtagtg gctccccggt ttacttcacc acacggttgc acccagtttt cacaatatca 3420

gagggaatat ttgaaactcc aaacatcacc gtgaatgggt tccatgtcag aataatgaat 3480

ggttacccaa ctaagaaagg tgactgtggg ctgccctact tcaattctaa ccgccagttg 3540

gtggcgttgc atgctggcac ggacacacaa ggtgaaacaa aagtggctca acgtgttgtc 3600

aaggaggtca ccacccaaga tgaattccaa tggaagggtt tgccagtggt caagtctgga 3660

cttgacgttg ggggcatgcc cactgggact cggtaccaca ggtcccctgc gtggcccgaa 3720

gaacagcctg gtgagacaca cgccccagca ccttttggtg cgggagacaa gaggtacaca 3780

ttttcacaaa cggaaatgct ggtgaatgga ctaaaaccct atacggaacc cactgctggg 3840

ataccaccac agctcctgtc tcgtgcggtc acacatgtac ggtcgtacat agaaacaatc 3900

atcggcacac accggtctcc tgtactgaca taccatcaag catgtgagct gcttgaacgg 3960

accacttcat gtggtccgtt cgtgcagggt ctcaagggcg actactggga tgaagagcat 4020

cagcagtata ccggtgtgct ggctaaccac cttgaacagg cgtgggacaa ggctaacaaa 4080

gggatagcac caaggaacgc ctataaattg gcacttaaag atgagctcag gccaattgag 4140

aagaacaaag ctggcaaacg taggttgttg tggggctgtg atgctgccac cacactcata 4200

gccaccgcag ccttcaaggc cgtggctacc aggctgcaag tagtgacgcc aatgacaccg 4260

gttgctgttg gcatcaatat ggactctgtt cagatgcaag taatgaatga ctccttaaag 4320

ggaggtgtcc tttactgcct ggactactcc aaatgggatt ccacacaaaa tcctgcagta 4380

acagcagcgt cactagctat actggagaga tttgctgagc cccacccaat cgtgtcttgt 4440

gccattgagg cgctttcttc ccctgcagag ggctacgtga atgatatcaa gttcgtgaca 4500

cgcggcggtc taccatccgg gatgccattc acatctgttg tcaactccat taaccatatg 4560

atatatgtag cggcagccat tctgcaggcg tacgaaagcc acagtgtccc gtacactgga 4620

aatgttttcc aagtggaaac agtccacacg tatggcgatg attgcatgta cagtgtgtgc 4680

cctgccactg catcaatttt ccacactgtg cttgccaacc taacatcgta tggactcaag 4740

cccactgcag cagacaagag tgaagcaatc aagccaacca acacgccagt gtttttgaag 4800

aggacattta cacaaacccc gcatggagtc cgagcactgc tagacatcac ttctataact 4860

agacagtttt actggctgaa ggctaatagg acatcagacc cttctagccc acctgctttc 4920

gaccgacaag cacgcagtgc gcaactggag aacgcgctag cctatgcttc acaacatgga 4980

cctgttgtgt ttgacaccgt gcgccaaatt gccataaaga ctgcccaagg agagggattg 5040

gtgcttgtca acaccaatta tgaccaggct ctcgccacct acaatgcttg gttcataggt 5100

ggtacagtac ctgacccagt aggtcacact gaaggaaccc acaaaatagt gtttgagatg 5160

gagggcaatg gctccaattc agagccaaag cagagcaaca acccgatggt cgttgacccg 5220

cctggcacaa caggtccgac cacatcccac gttgttgttg ctaatccgga gcaacccaat 5280

ggggccgcac agcgcctgga gctggctgtt gccactggtg caatccaatc caatgtccct 5340

gaggcaatac gcaactgctt tgcagtcttt cgtacttttg cttggaacga caggatgccc 5400

acgggaactt ttcttggatc tatatcgctt catcccaaca ttaacccgta cactgctcac 5460

ctctctggga tgtgggccgg gtggggcggt agttttgagg tccggctatc gatctctggt 5520

tctggcgtgt tcgctgggcg catcattgct tctgtcatac caccaggggt tgatccctcg 5580

tccatcaggg acccaggcgt gttgcctcac gctttcgttg atgctcgcat cactgagcca 5640

gtttctttca tgatccctga tgttagagct gtggactacc ataggatgga cggtgctgaa 5700

cccacttgct cgttaggatt ttgggtttac caaccattgc tcaacccgtt ttccaccacc 5760

gccgtttcaa catgttgggt atcagtggag actaagccag gtggtgattt tgatttttgc 5820

ctattaaggc caccaggtca acaaatggag aacggggttt caccagaagg cctgttgccc 5880

aggcgcctag gttactcacg cggtaaccgt gttggtggct tggtggttgg catgatcctg 5940

gtggctgagc acaagcaggt taacagacac ttcaattcca attcagtcac tttcggttgg 6000

tccacggcac ctgtcaaccc aatggcagca gaaattgtga caaaccaggc acattcaaca 6060

tcacgccatg cttggctttc cattggtgct caaaacaagg gtccattgtt tcccggaata 6120

cctaaccact tccccgactc gtgtgcgtca acaattgtgg gggccatgga cacctccctt 6180

ggtggccggc catccactgg ggtatgtgga cctgccataa gcttccaaaa caatggtgat 6240

gtgtacgaaa atgacactcc ctcagtcatg tttgccactt atgacccact cacgtcaggt 6300

actggggttg ctctcaccaa cagtatcaat cctgcatccc tggcgttagt gcgcatatcc 6360

aacaatgact ttgacactag tggctttgcc aatgataaga acgtggtggt tcaaatgtca 6420

tgggagatgt acacaggcac caatcaaatt agaggtcagg ttacaccaat gtctggcact 6480

aactacacct tcacatctac aggtgcaaac acccttgtgt tgtggcagga gcgtatgctc 6540

agctacgatg gacaccaagc aatactgtac tcgtcacaat tggagaggac ggctgagtac 6600

ttccagaatg atatagtgaa tatacctgaa aactccatgg cagtgttcaa tgtggaaacc 6660

aactctgcat ctttccaaat tggcatcaga cctgatggtt acatggtaac aggtggctct 6720

attggtatta atgtaccgct tgaacctgaa acccgattcc aatacgttgg aattctccct 6780

ttgtccgcag ctttatctgg gcccagtggg aacatgggaa gggccagacg ggtgttccaa 6840

tgagttggtt ggtgggtgcc cttcagacct tcgggtcttt ggcggatgtt gctggcactg 6900

tctccaacat agtgtaccag cagcgccaag ccgctcagtt ggaaagacaa aatgaactaa 6960

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acctctccat caatggtcca gctgcccggg tgcaatcagc acttgatgca ggttttgatg 7080

aagtaagtgc acggcgcatt gctggttcag gtgaacgcgt gatatggggg aacttagatc 7140

gacccatcat gcacgctggc actatggata gcatacgcca gaccaaacat ttggattctc 7200

tgagtcattc tttggccaca ttcaaaaatg ggactccatt tgggaaaccc gcacctccaa 7260

cagcaaaact tgggaggcct caggccacaa ctgcacaaat caatattggc cacaaccctg 7320

gtagcaccag tgtctaaatn cacattttct tttctttgaa acggtcccac acgcgttcgg 7380