本发明涉及中药领域，具体涉及一种桑葚多糖经羧甲基化反应获得的羧甲基化桑葚多糖及其制备方法和其在制备保肝药物中的用途。
背景技术：
肝脏是腹腔内最大的实质性器官，担负人体的重要生理功能，是人体的重要解毒器官。大自然和人类工业生产过程中均存在一些对肝脏有毒性的化学物质，包括酒精、环境中的化学有毒物质及某些药物，可通过胃肠道门静脉或体循环进入肝脏进行转化，可引起肝脏不同程度的肝细胞坏死、脂肪变形、肝硬化和肝癌，严重威胁到人类健康。桑葚(morifructus)，是多年生木本植物桑(morusalbal)的成熟果穗，是我国第一批收录于国家卫生部“药食同源”名录的品种，同时也是我国优良的保健功能食品资源之一，具有增强免疫、调节血糖和血脂、护肝等作用。桑葚多糖是其主要活性成分之一，具有较好的保肝作用。发明人前期的工作(专利申请号201510431557.5)也提供了桑葚多糖的分离纯化方法以及在制备药物和保健品中的应用。多糖的生物活性与其结构密切相关，用适当的方法对多糖的结构进行分子修饰，能在一定程度上提高其生理活性、降低某些毒副作用或者赋予其新的生理活性。羧甲基化多糖(carboxymethylpolysaccharides，cp)是指多糖链中单糖分子上的一个或几个羟基被羧甲基基团取代而形成的一类结构复杂、活性多样的多糖衍生物。技术实现要素：本发明的目的是提供一种桑葚多糖经羧甲基化反应获得的羧甲基化桑葚多糖(c-mfp)及其制备方法，并研究羧甲基化桑葚多糖在制备保肝药物中的用途，用以开发一种新的保肝药物或保健品制剂。本发明采用如下的技术方案：一种羧甲基化桑葚多糖，它由重均分子量为20.93kda的桑葚多糖经羧甲基化修饰后所得。前述的羧甲基化桑葚多糖的重均分子量为26.18kda，取代度为0.6-0.8。前述的羧甲基化桑葚多糖的制备方法，包括如下步骤：(1)羧甲基衍生化反应：取纯化后的桑葚多糖，加入7-12倍体积的异丙醇搅拌混匀后加入10-30倍体积的naoh溶液，搅拌，再缓慢加入7-10倍桑葚多糖重量的氯乙酸，反应3-5h，待反应结束后冷却至室温，将溶液中和至中性，得到羧甲基化衍生物；(2)透析：将羧甲基化衍生物转移至透析袋中，先流水透析，再用蒸馏水透析，浓缩透析液；(3)醇沉和干燥：向浓缩后的透析液中加入乙醇，进行醇沉，离心，取沉淀物用甲醇/丙酮冲洗，真空冷冻干燥，即得羧甲基化桑葚多糖。更具体地，前述的羧甲基化桑葚多糖的制备方法包括如下步骤：(1)羧甲基衍生化反应：取300重量份的纯化桑葚多糖，加入7-12倍体积的异丙醇，在室温用磁力搅拌器搅拌30-60min后加入10-30倍体积的20％-30％naoh溶液，室温下搅拌1-3h，缓慢加入2100-3000重量份的氯乙酸，使其在55-65℃条件下反应3-5h，待反应结束后冷却至室温，用20％-30％hcl溶液中和至中性，得到羧甲基化衍生物；(2)透析：将羧甲基化衍生物转移至透析袋中，先流水透析12-36h，再用蒸馏水透析36-60h，减压浓缩透析液；(3)醇沉和干燥：向浓缩后的透析液中加入乙醇，使乙醇终浓度达到80％以上，离心，用甲醇/丙酮冲洗沉淀物1-3次，真空冷冻干燥，即得羧甲基化桑葚多糖。前述的羧甲基化桑葚多糖的制备方法中，所述的桑葚多糖按照如下方法进行提取：①提取：取适量桑葚，匀浆，加入3-5倍重量的水，在温度80-90℃条件下提取1-2次，每次1.5-2.5h，滤过，合并滤液，减压浓缩至原体积的2/7-2/9；②脱色：步骤①浓缩后的滤液加入适量的大孔树脂进行吸附脱色，在45-50℃下恒温振荡脱色20-40min，滤过，重复洗脱大孔树脂上的桑葚多糖，合并滤液，减压浓缩；③除蛋白：向步骤②浓缩后的滤液中加入蛋白酶，40-70℃下，酶解蛋白，加入1-2倍体积的三氯甲烷或二氯甲烷和1/5-1/2倍体积的正丁醇，振摇20-120min，静置，除去杂质蛋白，重复3-7次直至无沉淀析出，离心，取上清液；④醇沉：上清液中加入乙醇至乙醇终浓度为60％-90％，4℃静置12-36h，离心，取沉淀复溶，再次醇沉，重复2-3次，沉淀物用无水乙醇和丙酮各洗涤1-3次；⑤透析：将洗涤后的沉淀物装入预先处理的透析袋中，透析；或者采用膜过滤的方法过滤，透析/膜过滤的截留分子量≥1500，干燥，即得桑葚粗多糖。前述的羧甲基化桑葚多糖的制备方法中，桑葚粗多糖的纯化包括如下步骤：①纤维素离子层析配制8-12g·l-1的桑葚粗多糖溶液，转入纤维素离子交换树脂柱中，用蒸馏水洗脱，流速为2-3ml·min-1，收集洗脱液，减压浓缩，透析，真空冷冻干燥，得分级纯化的桑葚多糖；②凝胶柱层析将分级纯化的桑葚多糖溶于超纯水，溶液转入凝胶柱中，蒸馏水洗脱，流速为0.1-0.4ml·min-1，收集洗脱液，减压浓缩后，真空冷冻干燥，即得桑葚多糖。前述的羧甲基化桑葚多糖的制备方法中，所述纤维素离子交换树脂柱填料为deae-cellulose52或deae-cellulose32；优选为deae-cellulose52。前述的羧甲基化桑葚多糖的制备方法中，所述凝胶柱填料为sephadexg-50、sephadexg-100、sephadexg-150或sephadexg-200；优选为sephadexg-100。前述的羧甲基化桑葚多糖在制备保肝药物或保健品中的应用。前述的羧甲基化桑葚多糖在制备酒精性肝损伤药物或保健品中的应用。为验证所制得的羧甲基化桑葚多糖及其保肝作用效果，发明人进行了以下实验：1、羧甲基化桑葚多糖的红外分析和取代度的测定取2mg充分干燥的羧甲基化桑葚多糖，在玛瑙研钵中与干燥kbr充分混合(m∶m＝1∶100)后，研磨成粉末，压片后，用红外光谱仪扫描，扫描范围4000～400cm-1。由图2显示，与图1羧甲基化前样品的红外图谱相比，c-mfp在1617cm-1和1423cm-1处出现两个新的强吸收，说明mfp被部分羧甲基化成功，c-mfp在848.21cm-1处出现新的谱带，表明吡喃糖的α型c-h振动的特征吸收峰。值得注意的是，改性衍生物中仍然存在多糖的特征吸收峰。因此，本发明中天然多糖被成功修饰而不改变多糖本身的分子链结构。羧甲基化桑葚多糖的取代度的测定(1)样品处理：精密称取10mg羧甲基化多糖，经100℃干燥1h后，加入70％乙醇3ml，搅拌，放置5min，依次加入10ml蒸馏水，0.1％naoh溶液，混合后搅拌直到样品完全溶解。然后用0.1％hcl溶液滴定，以酚酞作指示剂，计算每克羧甲基多糖所需的hcl的毫摩尔数(a)。(2)取代度(degreeofsubstitution，ds)计算：取代度是指多糖分子中每个糖环上羟基被取代的程度。计算公式如下：式中：v0-加入的naoh溶液体积，ml；v1-空白测定所消耗hcl溶液体积，ml；v2-样品测定所消耗hcl溶液体积，ml；c0-加入的naoh溶液浓度，m；c-测定所用hcl溶液浓度，m；m-测定所用样品质量，g。经过测定分析，羧甲基化桑葚多糖分子量约为26.18kda，取代度为0.6-0.8。2、桑葚多糖及羧甲基化桑葚多糖对乙醇脱氢酶的激活作用仪器：酶标仪、恒温恒湿箱、十万分之一天平。材料和试剂：氧化型辅酶i(nicotinamideadeninedinucleotide，nad+)，乙醇脱氢酶(adh)，乙醇，焦磷酸钠缓冲盐。采用改良后的valle&hoch法检测adh活性，在测定板中依次加入ph为8.8的100μl焦磷酸钠缓冲液，75μlnad+，35μl乙醇，10μl桑葚多糖溶液、羧甲基化桑葚多糖溶液，混合，37℃下加盖孵育5min。立即加入10μladh，摇匀后立即测定340nm处的吸光度值(a340)，每隔10s读数一次，连续测定5min，记录数据。以蒸馏水代替乙醇溶液调零点，以不加药物组为空白组，以联苯双酯为阳性对照。采用以下公式计算adh活性和激活率。如图3所示，桑葚多糖及羧甲基化桑葚多糖对乙醇脱氢酶活性的影响实验结果表明，桑葚多糖经羧甲基化修饰后，对乙醇脱氢酶的激活作用明显提高，表明它具有良好的解酒护肝的应用前景。3、桑葚多糖及羧甲基化桑葚多糖的抗急性酒精性肝损伤作用研究为了进一步证实桑葚多糖及羧甲基化桑葚多糖具有保肝作用，建立了小鼠急性肝损伤模型。具体实验步骤如下：(1)仪器：酶标仪、恒温恒湿箱。(2)材料和试剂：谷草转氨酶(ast)、谷丙转氨酶(alt)、乳酸脱氢酶(ldh)、甘油三酯(tg)、总胆固醇(t-cho)、总胆红素(tbil)和低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、丙二醛(mda)、超氧化物歧化酶(sod)和谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)试剂盒。(3)实验步骤：①将90只体重为18-22g的健康雄性km小鼠，在室内温度为20±2℃，相对湿度50％，自然采光的条件下，饲养一周，以每组10只随机分为9组，分别为空白对照组(生理盐水)、病理模型组(etoh)、阳性对照组(etoh+0.21g·kg-1bw联苯双酯)、经纯化的桑葚多糖的高、中、低剂量组(etoh+123.6mg·kg-1mfp、etoh+61.8mg·kg-1mfp、etoh+30.9mg·kg-1mfp)、羧甲基化桑葚多糖的高、中、低剂量组(etoh+123.6mg·kg-1c-mfp、etoh+61.8mg·kg-1c-mfp、etoh+30.9mg·kg-1c-mfp)。按照不同组别每天首先口服给予生理盐水/联苯双酯/mfp/c-mfp，4h后口服给予生理盐水/酒精，所有组连续按上述样品及剂量灌胃7天，试验结束前小鼠禁食12h后，摘眼球取血，脱臼处死，迅速解剖取出肝脏，用冰生理盐水冲洗，滤纸吸干表面水分后称量，用于计算肝脏器指数。然后取肝左叶制备肝匀浆以备测定丙二醛、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶等肝脏生化指标。另外取出距肝大叶边缘化5cm处的约1.0×1.0×0.2cm3肝脏组织，放入10％中性甲醛溶液中固定，用于制作病理切片。②肝匀浆的制备：取小鼠肝组织，加入1∶9(w∶v)的生理盐水，冰水浴条件下，用组织匀浆机匀浆，低温离心10min，取上清液备用。③肝脏系数测定：肝脏器指数(％)＝肝脏质量(g)/小鼠体重(g)×100％④血清ast、alt、ldh、tg、t-cho、tbil和ldl-c的测定：将血样冰水静置后，离心，15min后取上层血清，严格按试剂盒说明书提供的方法测定各项血清生化指标。⑤肝组织匀浆mda、sod和gsh-px水平的测定：将10％肝组织匀浆稀释到适当的浓度后，严格按试剂盒说明书的方法测定各项肝脏生化指标。⑤组织病理学切片的制作：解剖小鼠后，迅速取出肝脏，用预冷的生理盐水漂洗，除去血液，滤纸拭干，每组切取小鼠肝脏的同一部位后用10％福尔马林固定24h，用流水过夜冲洗组织块，脱水，透明，包埋，切片，苏木素-伊红染色，自然风干后封片，将载玻片放置在光学显微镜下观察肝组织切片的病理形态学变化。(4)桑葚多糖及羧甲基化桑葚多糖的抗急性酒精性肝损伤作用研究结果①mfp和c-mfp对急性酒精性肝损伤小鼠的体重变化实验前后，空白组小鼠体重平均增长5.1％，模型组小鼠体重明显减少(p＜0.01)。mfp各剂量组和c-mfp各剂量组及阳性对照组小鼠的体重减小但不明显，其中c-mfp的中剂量、高剂量组优于阳性对照组。②mfp和c-mfp对急性酒精性肝损伤小鼠的肝脏指数影响由表1可以看出9组小鼠肝脏指数均无显著影响，可初步判断桑葚多糖及羧甲基化桑葚多糖对小鼠无显性毒性。其中c-mfp高剂量组的肝脏指数下降最强。表1mfp和c-mfp对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏系数的影响组别肝/体(g·g-1)空白组0.041±0.0067病理模型组0.044±0.0027阳性对照组0.044±0.0033mfp高剂量组0.045±0.0043mfp中剂量组0.043±0.0054mfp低剂量组0.049±0.0052c-mfp高剂量组0.037±0.048c-mfp中剂量组0.044±0.0035c-mfp低剂量组0.044±0.0053(3)mfp和c-mfp对急性酒精性肝损伤小鼠血清的肝功能影响由表2可见，模型组血清中ast、alt、ldh、tg、ldl-c、t-ch和tbil水平显著高于空白对照组，说明造模成功。桑葚多糖、羧甲基化桑葚多糖各剂量组与模型组相比，ast、alt、ldh、tg、ldl-c和tbil水平逐渐降低，且低、中、高剂量呈现出梯度降低各指标水平，说明多糖浓度与活力呈一定的量效关系。mfp中、高剂量组和c-mfp高剂量的tg水平，低于阳性对照组，提示可显著降低急性酒精性肝损伤小鼠血清中tg水平。与模型组相比，c-mfp高、中、低剂量组均能显著降低血清ldl-c水平(p＜0.01)。综上所述，mfp和c-mf对急性酒精性肝损伤小鼠血清的肝功能影响，能有效改善肝细胞的受损情况，并能有效降低血清中的脂肪含量。由表2可见，模型组血清中ast、alt、ldh、tg、ldl-c、t-ch和tbil水平显著高于空白对照组，说明造模成功。桑葚多糖、羧甲基化桑葚多糖各剂量组与模型组相比，ast、alt、ldh、tg、ldl-c和tbil水平逐渐降低，且低、中、高剂量呈现出梯度降低各指标水平，说明多糖浓度与活力呈一定的量效关系。mfp中、高剂量组和c-mfp高剂量的tg水平，低于阳性对照组，提示可显著降低急性酒精性肝损伤小鼠血清中tg水平。与模型组相比，c-mfp高、中、低剂量组均能显著降低血清ldl-c水平(p＜0.01)。综上所述，mfp和c-mfp对急性酒精性肝损伤小鼠血清的肝功能影响，能有效改善肝细胞的受损情况，并能有效降低血清中的脂肪含量。④mfp和c-mfp对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织的肝功能影响如表3，急病理模型组小鼠肝脏的mda水平与空白对照组相比极显著地升高(p＜0.01)，说明肝细胞损伤严重，预给药mfp和c-mfp低剂量的高、中剂量时，小鼠肝细胞的mda水平均显著的下降了(p＜0.05)。其中，其中c-mfp高剂量组小鼠肝细胞的mda下降比例优于阳性对照联苯双酯。另外，联苯双酯和c-mfp高、中剂量均能显著增强sod活性和gsh的含量，其中，c-mfp高剂量组的效果最显著(p＜0.01)。说明mfp和c-mfp对酒精性肝损伤，具有清除活性氧自由基、阻止自由基对细胞结构的破坏的作用。综合mfp和c-mfp对ast、alt、ldh、tg、ldl-c、t-cho、tbil、mda、sod和gsh-px这9种小鼠血清和肝脏中肝功能指标的检测，结果表明，c-mfp更具有对急性酒精性肝损伤的保护作用。表2mfp和c-mfp对急性酒精性肝损伤小鼠血清中生化指标的影响注：*与空白组相比，p＜0.05，**与空白组相比，p＜0.01；δ与模型组相比，p＜0.05，δδ与模型组相比，p＜0.01。表3mfp和c-mfp对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏中生化指标的影响注：*与空白组相比，p＜0.05，**与空白组相比，p＜0.01；δ与模型组相比，p＜0.05，δδ与模型组相比，p＜0.01。⑤急性酒精性肝损伤小鼠肝组织的病理切片分析各实验组的小鼠肝组织病理切片见图4，按从左至右、从上至下的顺序与表3中各实验组相对应，空白对照组肝细胞结构完整，细胞核清晰可见，细胞质均匀无组织学异常。相反，病理模型组有明显的形态学该表：细胞已严重变形，且细胞模糊不清，肝细胞肿胀。阳性对照组与急性酒精性肝损伤模型组相比，联苯双酯可以有效的减轻酒精对肝细胞病变的症状，对肝细胞有明显的保护效果。mfp高剂量组的小鼠肝细胞已无明显的细胞肿胀，且细胞边缘清晰可见。c-mfp高剂量组的小鼠肝细胞细胞完整度好，细胞基本无破裂，且细胞周围的脂质物质明显减少。mfp和c-mfp各剂量组，均对急性酒精性肝损伤有一定的治疗作用，其存在一定的计量依赖关系。c-mfp的高剂量组对于急性酒精性肝损伤有较好的作用，是解酒护肝的潜在药物。综上所述，药理实验证明，羧甲基化多糖c-mfp能很大提高adh的活性，表明它具有良好的解酒护肝的应用前景；药理实验还表明，桑葚多糖、羧甲基化桑葚多糖各剂量组与模型组相比，ast、alt、ldh、tg、ldl-c和tbil水平逐渐降低，且低、中、高剂量呈现出梯度降低各指标水平，说明多糖浓度与活力呈一定的量效关系，并且，预给药mfp和c-mfp的小鼠，其肝细胞的mda水平均显著的下降了(p＜0.05)，其中，c-mfp高剂量组小鼠肝细胞的mda下降比例优于阳性对照联苯双酯。另外，c-mfp高、中剂量均能显著增强sod活性和gsh的含量，说明mfp和c-mfp对酒精性肝损伤，具有清除活性氧自由基、阻止自由基对细胞结构的破坏的作用。同时，c-mfp具有清除活性氧自由基的作用也使得c-mfp具有制备成抗氧化药物的前景。另外，mfp高剂量组的小鼠肝细胞已无明显的细胞肿胀，且细胞边缘清晰可见。c-mfp高剂量组的小鼠肝细胞细胞完整度好，细胞基本无破裂，且细胞周围的脂质物质明显减少。mfp和c-mfp各剂量组，均对急性酒精性肝损伤有一定的治疗作用，其存在一定的计量依赖关系，可能是解酒护肝的潜在药物。本发明针对纯化得到的桑葚多糖进行了羧甲基化结构修饰，得到羧甲基化了的桑葚多糖。研究发现此羧甲基化桑葚多糖具有很强保肝作用，这些结果对桑葚多糖的深度开发利用提供依据，也对新的保肝药物的研发提供了科学基础。附图说明：图1为羧甲基化前桑葚多糖样品的红外图谱。图2为羧甲基化桑葚多糖样品的红外图谱。图3桑葚多糖及羧甲基化桑葚多糖对乙醇脱氢酶活性的影响。图4桑葚多糖及羧甲基化桑葚多糖作用于急性酒精性肝损伤模型小鼠肝组织的病理切片图。具体实施方式实施例1羧甲基化桑葚多糖的制备方法(1)羧甲基衍生化反应：取300重量份的重均分子量为20.93kda的桑葚多糖，加入7倍体积的异丙醇，在室温用磁力搅拌器搅拌30min后加入10倍体积的20％naoh溶液，室温下搅拌1h，缓慢加入2100重量份的氯乙酸，使其在55℃条件下反应3h，待反应结束后冷却至室温，用20％hcl溶液中和至中性，得到羧甲基化衍生物；(2)透析：将上述羧甲基化衍生物，转移至透析袋中，流水透析12h，再用蒸馏水透析36h，减压浓缩透析液；(3)醇沉和干燥：向上述浓缩后的透析液中加入乙醇，使乙醇终浓度达到80％以上，离心，用甲醇/丙酮冲洗沉淀物1次，真空冷冻干燥，即得羧甲基化桑葚多糖。实施例2羧甲基化桑葚多糖的制备方法(1)羧甲基衍生化反应：取300重量份的重均分子量为20.93kda的桑葚多糖，加入10倍体积的异丙醇，在室温用磁力搅拌器搅拌45min后加入20倍体积的25％naoh溶液，室温下搅拌2h，缓慢加入2500重量份的氯乙酸，使其在60℃条件下反应4h，待反应结束后冷却至室温，用25％hcl溶液中和至中性，得到羧甲基化衍生物；(2)透析：将上述羧甲基化衍生物，转移至透析袋中，流水透析24h，再用蒸馏水透析48h，减压浓缩透析液；(3)醇沉和干燥：向上述浓缩后的透析液中加入乙醇，使乙醇终浓度达到80％以上，离心，用甲醇/丙酮冲洗沉淀物2次，真空冷冻干燥，即得羧甲基化桑葚多糖。其中桑葚多糖可以按照如下步骤制备：(1)桑葚粗多糖提取①提取：取适量桑葚，匀浆，加入3倍重量的水，在温度80℃条件下提取1次，每次1.5h，滤过，合并滤液，减压浓缩至原体积的2/7；②脱色：步骤①浓缩后的滤液加入适量的大孔树脂进行吸附脱色，在45℃下恒温振荡脱色20min，滤过，重复洗脱大孔树脂上的桑葚多糖，合并滤液，减压浓缩；③除蛋白：向步骤②浓缩后的滤液中加入蛋白酶，40℃下，酶解蛋白，加入1倍体积的三氯甲烷和1/5倍体积的正丁醇，振摇20min，静置，除去杂质蛋白，重复3次直至无沉淀析出，离心，取上清液；④醇沉：上清液中加入乙醇至乙醇终浓度为60％，4℃静置12h，离心，取沉淀复溶，再次醇沉，重复2次，沉淀物用无水乙醇和丙酮各洗涤1次；⑤透析：将洗涤过后的沉淀物装入预先处理的透析袋中，透析；或者采用膜过滤的方法过滤，透析/膜过滤的截留分子量≥1500，干燥，即得桑葚粗多糖；(2)桑葚粗多糖的纯化①纤维素离子层析配制8g·l-1的桑葚粗多糖溶液，转入装有纤维素离子交换树脂柱deae-cellulose52中，用蒸馏水洗脱，流速为2ml·min-1，收集洗脱液，减压浓缩，透析，真空冷冻干燥，得分级纯化的桑葚多糖；②凝胶柱层析将经deae-cellulose52分级纯化后的桑葚多糖溶于超纯水，溶液转入凝胶柱sephadexg-50中，蒸馏水洗脱，流速为0.1ml·min-1，收集洗脱液，减压浓缩后，真空冷冻干燥，即得桑葚多糖。其中凝胶柱还可选用sephadexg-100、sephadexg-150或sephadexg-200。实施例3羧甲基化桑葚多糖的制备方法(1)羧甲基衍生化反应：取300重量份的重均分子量为20.93kda的桑葚多糖，加入12倍体积的异丙醇，在室温用磁力搅拌器搅拌60min后加入30倍体积的30％naoh溶液，室温下搅拌3h，缓慢加入3000重量份的氯乙酸，使其在65℃条件下反应5h，待反应结束后冷却至室温，用30％hcl溶液中和至中性，得到羧甲基化衍生物；(2)透析：将上述羧甲基化衍生物，转移至透析袋中，流水透析36h，再用蒸馏水透析60h，减压浓缩透析液；(3)醇沉和干燥：向上述浓缩后的透析液中加入乙醇，使乙醇终浓度达到80％以上，离心，用甲醇/丙酮冲洗沉淀物3次，真空冷冻干燥，即得羧甲基化桑葚多糖。其中桑葚多糖可以按照如下步骤制备：(1)桑葚多糖提取①提取：取适量桑葚，匀浆，加入5倍重量的水，在温度90℃条件下提取2次，每次2.5h，滤过，合并滤液，减压浓缩至原体积的2/9；②脱色：步骤①浓缩后的滤液加入适量的大孔树脂进行吸附脱色，在50℃下恒温振荡脱色40min，滤过，重复洗脱大孔树脂上的桑葚多糖，合并滤液，减压浓缩；③除蛋白：向步骤②浓缩后的滤液中加入蛋白酶，70℃下，酶解蛋白，加入2倍体积的二氯甲烷和1/2倍体积的正丁醇，振摇120min，静置，除去杂质蛋白，重复7次直至无沉淀析出，离心，取上清液；④醇沉：上清液中加入乙醇至乙醇终浓度为90％，4℃静置36h，离心，取沉淀复溶，再次醇沉，重复3次，用无水乙醇和丙酮各洗涤3次；⑤透析：将洗涤过后的沉淀物装入预先处理的透析袋中，透析；或者采用膜过滤的方法过滤，透析/膜过滤的截留分子量≥1500，干燥，即得桑葚粗多糖；(2)桑葚粗多糖的纯化①纤维素离子层析配制12g·l-1的桑葚粗多糖溶液，转入装有纤维素离子交换树脂柱deae-cellulose32中，用蒸馏水洗脱，流速为3ml·min-1，收集洗脱液，减压浓缩，透析，真空冷冻干燥，得分级纯化的桑葚多糖；②凝胶柱层析将经deae-cellulose32分级纯化后的桑葚粗多糖溶于超纯水，溶液转入凝胶柱sephadexg-200中，蒸馏水洗脱，流速为0.4ml·min-1，收集洗脱液，减压浓缩后，真空冷冻干燥，即得桑葚多糖。其中凝胶柱还可选用sephadexg-50、sephadexg-100或sephadexg-150。实施例4羧甲基化桑葚多糖的制备方法(1)羧甲基衍生化反应：取300重量份的重均分子量为20.93kda的桑葚多糖，加入10倍体积的异丙醇，在室温用磁力搅拌器搅拌45min后加入20倍体积的25％naoh溶液，室温下搅拌2h，缓慢加入2600重量份的氯乙酸，使其在60℃条件下反应4h，待反应结束后冷却至室温，用25％hcl溶液中和至中性，得到羧甲基化衍生物；(2)透析：将上述羧甲基化衍生物，转移至透析袋中，流水透析24h，再用蒸馏水透析48h，减压浓缩透析液；(3)醇沉和干燥：向上述浓缩后的透析液中加入乙醇，使乙醇终浓度达到80％以上，离心，用甲醇/丙酮冲洗沉淀物2次，真空冷冻干燥，即得羧甲基化桑葚多糖。其中桑葚多糖可以采用现有技术进行提取，得到桑葚粗多糖，然后按照如下步骤对桑葚粗多糖进行纯化：①纤维素离子层析配制10g·l-1的桑葚粗多糖溶液，转入装有纤维素离子交换树脂柱deae-cellulose52中，用蒸馏水洗脱，流速为3ml·min-1，收集洗脱液，减压浓缩，透析，真空冷冻干燥，得分级纯化的桑葚多糖；②凝胶柱层析将经deae-cellulose52分级纯化后的桑葚粗多糖溶于超纯水，溶液转入凝胶柱sephadexg-100中，蒸馏水洗脱，流速为0.25ml·min-1，收集洗脱液，减压浓缩后，真空冷冻干燥，即得桑葚多糖。其中凝胶柱还可选用sephadexg-50、sephadexg-150或sephadexg-200。实施例5羧甲基化桑葚多糖的制备方法(1)羧甲基衍生化反应：取300重量份的重均分子量为20.93kda的桑葚多糖，加入10倍体积的异丙醇，在室温用磁力搅拌器搅拌60min后加入25倍体积的30％naoh溶液，室温下搅拌2h，缓慢加入2200重量份的氯乙酸，使其在55℃条件下反应4h，待反应结束后冷却至室温，用20％hcl溶液中和至中性，得到羧甲基化衍生物；(2)透析：将上述羧甲基化衍生物，转移至透析袋中，流水透析36h，再用蒸馏水透析48h，减压浓缩透析液；(3)醇沉和干燥：向上述浓缩后的透析液中加入乙醇，使乙醇终浓度达到80％以上，离心，用甲醇/丙酮冲洗沉淀物3次，真空冷冻干燥，即得羧甲基化桑葚多糖。其中桑葚多糖可以按照如下步骤进行提取：①提取：取适量桑葚，匀浆，加入4倍重量的水，在温度85℃条件下提取2次，每次2h，滤过，合并滤液，减压浓缩至原体积的16/63；②脱色：步骤①浓缩后的滤液加入适量的大孔树脂进行吸附脱色，在48℃下恒温振荡脱色30min，滤过，重复洗脱大孔树脂上的桑葚多糖，合并滤液，减压浓缩；③除蛋白：向步骤②浓缩后的滤液中加入蛋白酶，55℃下，酶解蛋白，加入2倍体积的sevag试剂(v正丁醇∶v三氯甲烷＝1∶4)，振摇70min，静置，除去杂质蛋白，重复5次直至无沉淀析出，离心，取上清液；④醇沉：上清液中加入乙醇至乙醇终浓度为75％，4℃静置24h，离心，取沉淀复溶，再次醇沉，重复2次，用无水乙醇和丙酮各洗涤2次；⑤透析：将洗涤过后的沉淀物装入预先处理的透析袋中，透析；或者采用膜过滤的方法过滤，透析/膜过滤的截留分子量≥1500，干燥，即得桑葚粗多糖；然后将提取得到的桑葚粗多糖采用现有技术进行纯化，进一步得到桑葚多糖。实施例6羧甲基化桑葚多糖的应用按质量比8∶0.4∶8∶0.3称取羧甲基化桑葚多糖(实施例1制得)、糊精、蔗糖和羧甲基纤维素钠，混匀，制成颗粒剂。用于预防或治疗急性酒精性肝损伤，每日服用量：1～2g。实施例7羧甲基化桑葚多糖的应用按质量比8∶0.4∶0.2∶0.3称取羧甲基化桑葚多糖(实施例2制得)、淀粉、蔗糖和羧甲基纤维素钠，混匀，制成片剂，0.3～0.5g/片。用于预防或治疗亚性酒精性肝损伤，每日服用量：3～5片。实施例8羧甲基化桑葚多糖的应用按质量比8∶0.4∶6∶0.3称取羧甲基化桑葚多糖(实施例4制得)、糊精、蔗糖和羧甲基纤维素钠，混匀，制成颗粒剂。用于预防或治疗药物性肝损伤，每日服用量：1～2g。实施例9羧甲基化桑葚多糖的应用按质量比8∶0.4∶0.1∶0.3称取羧甲基化桑葚多糖(实施例3制得)、淀粉、蔗糖和羧甲基纤维素钠，混匀，制成片剂，0.3～0.5g/片。用于解酒护肝，每日服用量：3～5片。当前第1页12