本发明涉及螺旋藻开发技术领域，尤其涉及一种螺旋藻多糖提取物及其制备方法和增强免疫功能的应用。
背景技术
螺旋藻是一种多细胞丝状微藻，属蓝藻门，其特征是其丝状体或毛状体的螺旋状。螺旋藻的形态会因环境不同而发生变化，现阶段对螺旋藻的研究主要集中在2个类型：一种是钝顶螺旋藻；另一种是极大螺旋藻。螺旋藻化学成分中尤其引人注目的是仅占2.0％～5.0％的螺旋藻多糖，从螺旋藻中可以通过分离提取的方法得到螺旋藻多糖。螺旋藻多糖是一种水溶性的多糖，具有促进细胞生长、提高免疫力、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老等功能，对核酸内切酶活性和dna的修复合成有增强作用，是一种重要的天然生物活性物质，这为其在功能性保健品中的应用展示了广阔的前景。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种螺旋藻多糖提取物及其制备方法和增强免疫功能的应用，为螺旋藻的深层次开发利用及临床应用提供依据。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
螺旋藻多糖提取物的制备方法，采用水煎醇沉法制备，具体按以下操作进行：称取螺旋藻干粉，加入焦磷酸钠溶液破壁；调藻粉液ph＝10，80℃水浴8h，调藻粉液ph＝5，加入木瓜蛋白酶，于50℃作用1.5h后，将酶灭活，最后于80℃水浴3h；离心，上清液浓缩，加入95％乙醇，沉淀过夜，离心，弃上清，沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤，干燥，研磨，即得螺旋藻多糖提取物。
破壁按固液比1∶20加入质量浓度0.1％的焦磷酸钠溶液进行。
木瓜蛋白酶按螺旋藻干粉质量的0.15％加入。
离心的转速为3000r/min、时间为10min。
浓缩到原上清液的1/4体积。
加入95％乙醇使上清液中乙醇终浓度为80％。
上述制备方法得到的螺旋藻多糖提取物。
上述螺旋藻多糖提取物在制备增强免疫功能的药物或保健品中的应用。
为深度发掘螺旋藻的药用价值，发明人建立了一种螺旋藻多糖提取物的制备方法，采用水煎醇沉法制备，具体按以下操作进行：称取螺旋藻干粉，加入焦磷酸钠溶液破壁；调藻粉液ph＝10，80℃水浴8h，调藻粉液ph＝5，加入木瓜蛋白酶，于50℃作用1.5h后，将酶灭活，最后于80℃水浴3h；离心，上清液浓缩，加入95％乙醇，沉淀过夜，离心，弃上清，沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，干燥，研磨，即得螺旋藻多糖提取物。测定表明，该法获得的螺旋藻多糖提取物得率高(10.64％)、总含量高(25.35％)，且不含淀粉、氨基酸或蛋白质。其免疫功能实验证明，使用该螺旋藻多糖提取物可提高机体免疫器官指数及白细胞水平，增强免疫功能。因此，本发明得到的螺旋藻多糖提取物具有丰富的营养价值，无毒副作用，可用于增强免疫功能的药物或保健品，为螺旋藻的深层次开发利用及临床应用提供依据。
附图说明
图1是螺旋藻多糖含量测定标准曲线。
图2是螺旋藻多糖组脾脏切片图(10×10)。
图3是螺旋藻组脾脏切片图(10×10)。
图4是生理盐水组脾脏切片图(10×10)。
图5是螺旋藻多糖组脾切片图(10×40)。
图6是螺旋藻组脾脏切片图(10×40)。
图7是生理盐水组脾脏切片图(10×40)。
图8是螺旋藻多糖组胸腺切片图(10×10)。
图9是螺旋藻组胸腺切片图(10×10)。
图10是生理盐水组胸腺切片图(10×10)。
图11是螺旋藻多糖组胸腺切片图(10×40)。
图12是螺旋藻组胸腺切片图(10×40)。
图13是生理盐水组胸腺切片图(10×40)。
具体实施方式
实施例1螺旋藻多糖提取物的制备
采用水提醇沉法，具体按以下操作进行：称取螺旋藻干粉，按固液比1∶20加入质量浓度0.1％的焦磷酸钠溶液破壁；调藻粉液ph＝10，80℃水浴8h，调藻粉液ph＝5，按藻粉质量的0.15％加入木瓜蛋白酶，于50℃作用1.5h后，将酶灭活，最后于80℃水浴3h；3000r/min离心10min，上清液浓缩到1/4体积，加入95％乙醇使终浓度为80％，沉淀过夜，3000r/min离心10min，弃上清，沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，干燥，研磨，即得螺旋藻多糖提取物(以下简称螺旋藻多糖)。
参照上法制备三次，结果见表1。
表1螺旋藻多糖提取率
用法：螺旋藻多糖按100mg/kg体重饮水给药，1次/d，连续给药7天。
实施例2螺旋藻多糖理化性质测定
(1)碘-碘化钾反应
取适量的螺旋藻多糖溶液(1mg/ml)，然后加入数滴0.1mol/l碘-碘化钾溶液，观察颜色变化。碘遇淀粉变蓝色，糖遇淀粉不显色。如果样品中含有淀粉，则反应液呈蓝色。以蒸馏水做阴性对照，淀粉溶液(1mg/ml)做阳性对照。如果碘-碘化钾反应呈阴性，说明螺旋藻多糖中不含淀粉。结果见表2。
表2碘-碘化钾反应结果(碘液颜色：棕黄色)
(2)茚三酮反应
取适量的螺旋藻多糖溶液(1mg/ml)，然后加入0.5ml的0.1％茚三酮乙醇溶液，混匀，煮沸2min，冷却后，观察颜色变化。以蒸馏水做阴性对照，0.5％甘氨酸溶液作为阳性对照。茚三酮与氨基酸或蛋白质反应生成紫色物质，糖与茚三酮反应不显色。如果反应液显紫色，则表明样品中含有氨基酸或蛋白质。如果茚三酮反应呈阴性，说明螺旋藻多糖中不含氨基酸和蛋白质。结果见表3。
表3茚三酮反应结果
螺旋藻多糖提取物的碘-碘化钾反应、茚三酮反应呈阴性，说明螺旋藻多糖不具有淀粉结构，不含蛋白质。
(3)molish反应
取适量的螺旋藻多糖溶液(1mg/ml)，然后加入2滴molish试剂，摇匀，将试管倾斜，沿试管壁缓慢加入1ml浓硫酸，静置数分钟，观察溶液界面的颜色变化，以蒸馏水作阴性对照，淀粉液作阳性对照。如果molish反应呈阳性紫色环，说明螺旋藻多糖中含糖。结果见表4。
表4molish反应结果
螺旋藻多糖的molish反应呈阳性，说明螺旋藻多糖具有糖的一般性质。
实施例3螺旋藻多糖提取物含量测定
螺旋藻多糖含量采用蒽酮-硫酸法测定。准确称取葡萄糖5mg，用蒸馏水定容至50ml，摇匀。每个试管中分别加入标准糖溶液0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml，各管再以蒸馏水补至1.0ml混匀，然后加入2g/l蒽酮试剂(100mg蒽酮溶于50ml浓硫酸中)4.0ml，用锡箔纸盖住试管口，迅速放入冰水浴中冷却，然后浸于沸水浴中煮沸10min，取出用自来水冷却，室温放置10min，于620nm波长处测光密度，以1.0ml蒸馏水按同样方法显色作为空白，以葡萄糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标制作标准曲线，并求回归方程。
精密称取50mg螺旋藻多糖，用蒸馏水定容至50ml，摇匀。准确吸取1.0ml按上述实验方法显色，测定光密度，以标准曲线(回归方程)计算多糖的含量，结果见表5和图1。
表5螺旋状多糖中总糖含量测定结果(蒽酮-硫酸法)
其中，1～7管：葡萄糖含量分别为0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.06、0.08；8管：总糖含量为1.00g/l的螺旋藻粗多糖。由表5、图1计算可得，螺旋藻多糖的总糖含量为25.35％。
实施例4螺旋藻多糖提取物对小鼠免疫功能影响的研究
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1螺旋藻多糖提取物，按实施例1制备。焦磷酸钠，购自天津博迪化工股份有限公司，生产标准号：hg3-1288-80。木瓜蛋白酶，购自上海国药集团化学试剂公司，生产批号：wm20070618。
1.1.2试验动物
昆明种小鼠，体重16～20g，清洁级，购于广西中医药大学，实验室常规饲养3天供实验用。
1.2方法
1.2.1动物处理
将26只小鼠随机分成三组，分别为生理盐水对照组(6只)、螺旋藻100mg/kg组(10只)、螺旋藻多糖100mg/kg组(10只)。饲养三天以适应环境，然后于开始给药的1-7天连续灌胃给药，如表6所示。
表6给药方法
1.2.2各指标的测定
第8天时，先将小鼠称重，然后眼球采血，测白细胞数，并作血涂片进行白细胞分类计数。采血后将小鼠断椎处死，取出脾脏和胸腺并称重，计算脏器指数。各指标的计算方法如表7所示。
表7各指标计算方法
1.2.3脾脏和胸腺组织结构观察
称重后的脾脏和胸腺放于10％甲醛中固定10天后，用刀片切取一块，投入福尔马林溶液中固定1d，经过流水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，切片(厚度为4μm)，附片，苏木精(he)染色，光学显微镜下观察。
2.结果
2.1小鼠的增重结果
表8小鼠体重变化
如表8所示，给小鼠灌胃螺旋藻多糖和螺旋藻后，灌胃剂量均为100mg/kg体重的第ii组(螺旋藻多糖组)和第iii组(螺旋藻组)小鼠的增重量明显增加，与第i组(对照组)比较，分别增加了45％、27.97％，而第ii组又比第iii组增加了13.39％。
2.2白细胞计数结果
表9小鼠血液白细胞总数结果
如表9所示，给小鼠灌胃螺旋藻多糖和螺旋藻后，第iii组(螺旋藻组)小鼠的白细胞总数明显增加，与第i组(对照组)比较，增加了13.84％。
2.3白细胞分类计数结果
表10小鼠血液白细胞分类计数结果(％，数据以
如表10所示，给小鼠灌胃螺旋藻多糖和螺旋藻后，第ii组(螺旋藻多糖组)和第iii组(螺旋藻组)小鼠的淋巴细胞明显增加，与第i组(对照组)比较，分别增加了35.74％、30.99％，而第ii组又比第iii组增加了3.63％；其他类白细胞差异不显著。
2.4小鼠胸腺、脾脏指数测定结果
表3-9小鼠胸腺、脾脏指数(数据以
如表11所示，给小鼠灌胃螺旋藻多糖和螺旋藻后，第ii组(螺旋藻多糖组)和第iii组(螺旋藻组)小鼠的胸腺指数明显增加，与第i组(对照组)比较，分别增加了15.48％、1.05％，而第ii组又比第1ii组增加了14.57％。
2.5小鼠胸腺、脾脏组织切片观察结果
螺旋藻多糖组和螺旋藻组与生理盐水组比较，无明显区别，都表现为脾脏白髓、红髓分界清楚，淋巴小结明显(图2-图4)，淋巴细胞增多，巨细胞增多(图5至图7)；而胸腺都表现为胸腺小体与皮质界限明显(图8至图10)，淋巴细胞密集(图11至图13)。
3.讨论
3.1螺旋藻多糖的分离提取
多糖是极性大分子化合物，常用的提取方法有：热水浸提法、稀碱浸提法、酸浸提法和酶法。前三种为化学方法，酶法为生物方法。一般植物多糖提取多采用热水浸提法。现在，提取多糖还多采用酶法，常用的酶有纤维素酶、果胶酶、蛋白酶及其复合酶。然而，以上方法提取的多糖中常含有无机盐、大分子蛋白质、木质素、色素及醇不溶的小分子有机物等杂质，必须分别除去，将这些杂质除去的过程，一般称为多糖的分离。工业化生产中一般采取透析法、离子交换、凝胶过滤或超滤法除去这些杂质。对于大分子杂质，可用酶法、乙醇、丙酮溶剂沉淀法或络合物法除去。由于原料组成中均含有一定量的蛋白质，因此在多糖的提取工艺中，脱除蛋白质是分离多糖的重要步骤，常用的方法有：sevag法，三氟三氯乙烷法，三氯乙酸法，酶法或酶法与sevag法结合，等电点沉淀法。
本发明采用焦磷酸钠破壁与木瓜蛋白酶法相结合，结果显示，该方法多糖平均得率为10.64％，提取率大大提高，而且提取物不具有淀粉结构，不含蛋白质。
3.2螺旋藻多糖对小鼠免疫功能的影响
3.2.1螺旋藻多糖对小鼠体重的影响
本实验结果表明，螺旋藻多糖和螺旋藻对小鼠体重有明显升高趋势，并且螺旋藻多糖组小鼠的体重比螺旋藻组的高。因此，该多糖灌胃给药可促进小鼠食欲，使体重增加。
3.2.2螺旋藻多糖对小鼠白细胞数的影响
白细胞，通常也称为免疫细胞。白细胞增多是指外周血中白细胞总数或某一类型的白细胞绝对数超过正常值。白细胞由粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等组成。主要功能是对外来的感染起防御作用。正常情况下，骨髓中的粒细胞与外周血中的粒细胞保持动态平衡。当发生急慢性感染、创伤、中毒或肿瘤等情况时，骨髓中的粒细胞释放增多，使外周血中白细胞增加。另外，益气健脾药能提高机体免疫功能；滋阴补血药可保护骨髓功能，增加外周血液的白细胞、血红蛋白及血小板。其中，能升高白细胞中药有效成分就包括多糖。淋巴细胞的主要功能是参与体液免疫、细胞免疫和分泌淋巴因子。
本实验结果显示，螺旋藻组小鼠的白细胞数比空白对照组的高，而螺旋藻多糖组小鼠的白细胞比空白对照组的低，可能与实验药品被污染导致小鼠发生炎症致使白细胞增多有关，具体原因有待进一步研究。
另一方面，螺旋藻多糖和螺旋藻对小鼠淋巴细胞均有明显升高趋势，并且螺旋藻多糖组小鼠的淋巴细胞比螺旋藻组的高。因此，螺旋藻多糖能提高正常小鼠的淋巴细胞数量，表明该多糖灌胃给药可提高正常小鼠机体的免疫功能。
3.2.3螺旋藻多糖对小鼠脾脏、胸腺指数的影响
机体中的免疫系统是由免疫器官和免疫细胞组成。免疫器官又分中枢免疫器官和外周免疫器官，胸腺和脾脏分别是这两类免疫器官的重要组成之一，胸腺和脾脏的重量，尤其是免疫器官重量指数可比较客观地反应机体免疫器官的发育状况，当机体的整体免疫功能增强时，其重量有所增加。
本实验结果表明，螺旋藻粗多糖和螺旋藻对小鼠胸腺重量指数均有明显升高趋势，并且螺旋藻多糖组小鼠的胸腺重量指数比螺旋藻组的高。但两实验组的脾脏重量指数均比空白对照组的低，可能与实验动物个体差异较大和样本数量较少有关，具体原因有待进一步研究。因此，螺旋藻多糖能提高正常小鼠胸腺指数，表明该多糖灌胃给药能促进正常小鼠胸腺淋巴细胞的增殖，提高机体免疫作用。
3.2.4螺旋藻多糖对小鼠免疫器官的影响
螺旋藻多糖组和螺旋藻组与生理盐水组比较，无明显区别，都表现为脾脏白髓、红髓分界清楚，淋巴小结明显，淋巴细胞增多，巨细胞增多；而胸腺都表现为胸腺小体与皮质界限明显，淋巴细胞密集。
4.结论
(1)采用焦磷酸钠破壁与酶法相结合获得螺旋藻多糖，为灰白色粉末，平均得率为10.64％，总糖含量为25.35％。
(2)螺旋藻多糖能提高小鼠机体免疫器官指数及白细胞水平，从而增强动物机体免疫功能。
综上，本发明得到的螺旋藻多糖提取物可用于增强免疫功能的药物或保健品。