一种皱盖假芝胞外多糖的制备方法及应用与流程

本发明涉及一种胞外多糖的制备方法，尤其涉及一种皱盖假芝胞外多糖的制备方法及制备得到的胞外多糖及应用。

背景技术

皱盖假芝是我国民间传统药用真菌，我国的真菌类专业书籍都有记载其药用特性，但语焉不详。直至近几年，皱盖假芝子实体粗多糖证明具有较强且广谱的抗肿瘤细胞增殖功效。同时，经急性和亚慢性毒理测试证明，皱盖假芝子实体粗多糖无明显毒性。随后，研究人员从皱盖假芝子实体粗多糖中分离出一段分子量小于6kd的多糖组分，并证实该组分的抗肿瘤细胞增殖效果优于分离纯化前的粗多糖。

目前，关于皱盖假芝子实体粗多糖的纯化方法，主要采用了柱层析的方法制备得到。

技术实现要素：

针对以上不足，本发明提供一种以皱盖假芝深层发酵后的不含菌丝体的发酵残液为原料，采用较温和的不需酸碱度调整、非高温加热的提取方法，以获得具有抑制肿瘤细胞增殖的胞外多糖。

本发明通过以下方案达到上述目的：

第一方面，提供一种皱盖假芝胞外多糖的制备方法，包括：采用培养12-16天的皱盖假芝液体培养物抽滤，得到滤液为胞外多糖粗液，将胞外多糖粗液真空减压浓缩，得到胞外多糖浓缩粗液，按照胞外多糖浓缩粗液与乙醇的体积比1:3-1:5加入乙醇，搅拌均匀，0-4℃静置24-48h，离心去除上清，向沉淀中加入水，45-55℃水浴30-60min，离心去除沉淀，取上清进行透析48-72h，透析膜分子截留量3-5kda，对透析后上清冷冻干燥，得到皱盖假芝胞外多糖。

优选的，所述皱盖假芝液体培养物为培养16天的皱盖假芝液体培养物。

优选的，所述皱盖假芝液体培养物通过将皱盖假芝菌种接入到液体培养基中，24-28℃下静置24小时，再在24-28℃下避光培养12-16天，得到皱盖假芝液体培养物。

进一步优选的，所述皱盖假芝液体培养物通过将皱盖假芝菌种接入到液体培养基中，24-28℃下静置24小时，再在24-28℃下避光培养16天，得到皱盖假芝液体培养物。

在上述培养中，液体培养基可以为市售的真菌市售培养基，例如以重量百分比计，包括蛋白胨0.5％、酵母浸出粉0.2％、葡萄糖2.0％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％的液体培养基，ph为5.5。

优选的，所述胞外多糖粗液为新鲜制备得到的胞外多糖粗液，可以理解为不经冷冻冷藏的胞外多糖粗液。

优选的，所述抽滤为采用200目尼龙滤网和滤纸进行抽滤。

优选的，所述胞外多糖粗液真空减压浓缩至原体积的1/5-1/20，例如1/10。

优选的，所述胞外多糖浓缩粗液与乙醇的体积比1:4。

进一步优选的，所述乙醇为无水乙醇。

优选的，所述沉淀中加入水为占皱盖假芝液体培养物4-6％的体积百分比水。

优选的，向沉淀中加入水，50℃水浴30-60min。

优选的，在水浴期间多次充分震荡。

在一个优选的实施例中，包括：将皱盖假芝菌种接入到液体培养基中，24-28℃下静置24小时，再在24-28℃下避光培养12-16天，得到皱盖假芝液体培养物，采用皱盖假芝液体培养物抽滤，得到滤液为胞外多糖粗液，将新鲜制备得到的胞外多糖粗液真空减压浓缩，得到胞外多糖浓缩粗液，按照胞外多糖浓缩粗液与无水乙醇的体积比1:4加入无水乙醇，搅拌均匀，0-4℃静置24-48h，离心去除上清，向沉淀中加入占皱盖假芝液体培养物5％的体积百分比水，50℃水浴30-60min，水浴期间多次充分震荡，离心去除沉淀，取上清进行透析48-72h，透析膜分子截留量3-5kda，对透析后上清冷冻干燥，得到皱盖假芝胞外多糖。

发明人发现，以不含有菌丝体的皱盖假芝深层发酵残液，得到不需酸碱度调整、非高温加热的提取方法，方法温和，并且从液料比、提取温度等因素中，优化皱盖假芝胞外多糖的提取技术。

在第二方面，提供一种上述制备方法制备得到的皱盖假芝胞外多糖。

在第三方面，提供一种上述皱盖假芝胞外多糖在抗肿瘤方面的应用。

优选的，所述应用包括抑制肿瘤细胞增殖。

优选的，所述肿瘤细胞为人乳腺癌细胞株mt1。

在第四方面，提供一种上述皱盖假芝胞外多糖在制备抗肿瘤药物和/或抑制肿瘤细胞增殖药物方面的应用。

优选的，所述肿瘤细胞为人乳腺癌细胞株mt1。

与现有技术相比，本发明方法首次从假芝发酵残液中分离得到具有抑制肿瘤细胞生长的胞外多糖，并且本发明方法能够以最快速地去除原有培养基残留成分，如蛋白质、单糖等的影响，多糖含量高，进一步经过原料培养物时间、乙醇体积比、水浴温度时间、以及透析参数等进一步提高多糖的含量纯度等。

附图说明

图1是试验例1的胞外多糖(400μg/ml)抑制mt1增殖的试验结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1：

一种皱盖假芝胞外多糖的制备方法：

(1)皱盖假芝深层发酵：制备液体培养基，以重量百分比计算，包括蛋白胨0.5％、酵母浸出粉0.2％、葡萄糖2.0％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％，ph调节至5.5，按每500ml三角瓶装入200ml液体培养基进行分装，采用湿热蒸汽灭菌法灭菌，培养基冷却后，接入皱盖假芝菌种(菌种代号i51)，25℃下静置24小时，再在25℃下、160rpm转速下避光摇瓶培养16d。

(2)皱盖假芝胞外粗多糖的分离：取200目尼龙滤网和滤纸，对培养基装量200ml的皱盖假芝深层发酵物进行抽滤，所得滤液为胞外多糖粗液。

(3)皱盖假芝胞外粗多糖的纯化：取新鲜制得的(不经冷冻保藏)胞外多糖粗液，真空减压浓缩至原体积1/10，得到胞外多糖浓缩粗液，按胞外多糖浓缩粗液：无水乙醇为1:4的体积比加入无水乙醇，充分搅拌均匀，置4℃下静置24h，然后离心去除上清，向沉淀加入10ml纯化水，置50℃水浴30min，水浴期间多次充分震荡，水浴结束后离心去除沉淀，取上清进行透析48h，透析膜分子截留量3-5kda，对透析后上清进行冷冻干燥，冷冻干燥后干粉即为纯化后的皱盖假芝胞外多糖。

试验例1

将实施例1制备得到的皱盖假芝胞外多糖，以硫酸苯酚法测得多糖含量为26.26±6.25％。

试验例2

将实施例1制备得到的皱盖假芝胞外多糖，加入细胞培养基1640，配置成含400μg/ml皱盖假芝胞外多糖的溶液，并对人乳腺癌细胞株mt1进行生长抑制实验，以mtt法检测抑制效果，结果如图1所示。

从图1可以看出，null为没有接入菌种的培养基胞外多糖样品、i51为皱盖假芝胞外多糖样品，由此可见添加皱盖假芝胞外多糖后的mt1细胞生长受到抑制。经差异显著性分析，其细胞存活率显著低于不含皱盖假芝胞外多糖的样品(p＜0.05)。

对比例1

发明人经过实验证实，皱盖假芝培养时间8-16天内，其胞外多糖提取物的量由60±2mg升至77±4mg，因此，本发明方法中优选培养16天的皱盖假芝液体培养物作为原料。

以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。