一种感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法与流程

本发明涉及生物分析领域，具体而言，涉及一种感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法。

背景技术

砂糖桔是广东重要的柑桔品种，由于近年来柑桔黄龙病的不断蔓延扩散，黄龙病已严重威胁广东省整个砂糖桔产业安全，而根据政府数据统计，发病较为严重是清远英德和云浮等地区。发病砂糖桔属于典型黄龙病症状，叶片为“斑驳型黄化症状”，不均匀的黄绿相间；果实为“红鼻子果”，果实果柄部分桔红色，其余部分青色。

柑桔黄龙病(citrushuanglongbing)是制约全球柑桔产业发展的的毁灭性病害。研究认为柑桔黄龙病分为两个种，亚洲韧皮杆菌(candidatusliberibacterasiatricus)，非洲韧皮杆菌(ca.l.africanus)。由于韧皮杆菌的不可继代培养性，阻碍了其致病机理及防控研究工作进步发展，当前也没有防治柑桔黄龙病的确切高效方法。

植物与植物内细菌群落属于动态发生过程，而一种发病病原菌的出现往往伴随着不同程度的微生态失调或菌群失衡。但由于绝大多数植物群落存在无法分离培养的难题，所以目前关于柑桔侵染黄龙病后的细菌群落组成所知甚少，不利于有效的防治柑桔黄龙病。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，通过这种检测方法，可在不分离培养植物菌落的前提下对感染黄龙病的沙糖橘进行分析，方法的准确度高，容易实施。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，其包括：

以第一引物对作为砂糖桔黄龙病病原菌的分子检测引物，对待测样品基因组进行pcr扩增，确定患病植株dna样品；

构建患病植株dna样品的16srdna文库；

采用高通量测序技术对患病植株dna样品进行检测并对患病植株dna样品中的菌落组成进行分析。

与现有技术相比，本发明的有益效果例如包括：

本发明提供的这种检测方法，通过将对黄龙病有较高特异性的第一引物对作为引物，采用常规pcr的分子检测法，筛选出感染黄龙病砂糖桔的患病植株dna样品；再通过高通量测序分析患病植株dna样品中的菌落组成，即可得出患病植株中的细菌菌群组成，进而为沙糖橘的黄龙病防治提供理论指导。此外，这种检测方法，可在不分离培养植物菌落的前提下对感染黄龙病的沙糖橘进行分析，方法的准确度高，容易实施。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为沙糖橘果园的30个砂糖桔样本dna电泳结果；

图2为3对引物在10个样品的pcr产物电泳结果；

图3为沙糖橘果园正常生长样品和斑驳型黄化症状样品的pcr产物电泳结果；

图4为30个样本的16srdnapcr产物电泳结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本实施方式提供一种感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，其包括：

步骤s1:以第一引物对作为砂糖桔黄龙病病原菌的分子检测引物，对待测样品基因组进行pcr扩增，确定患病植株dna样品；

进一步的，第一引物对的碱基序列如seqidno:1～2所示，其中，seqidno:1的序列为：gcgcgtatccaatacgagcggca；seqidno:2的序列为：gcctcgcgacttcgcaacccat。

步骤s2：构建患病植株dna样品的16srdna文库；

进一步的，构建患病植株dna样品的16srdna文库的步骤包括：

以第二引物对为引物，对患病植株dna样品进行16srdnapcr扩增。

其中，第二引物对的基因如seqidno:3～4所示：序列seqidno:3为aacmggattagataccckg；序列seqidno:4为agggttgcgctcgttg。

再对扩增后的16srdna的各项指标进行检测，符合构建标准的入选16srdna文库。

其中，16srdna文库的构建标准包括：

a.入选16srdna文库中的dna样品主带在10kb以上；

b.入选16srdna文库中的dna样品的od(260/280)值为1.6～1.8，od(260/230)值大于2。

优选地，16srdnapcr扩增的20μl反应体系包括：

正向引物(5μm)0.8μl，反向引物(5μm)0.8μl，fastpfu聚合酶0.4μl，模板dna10ng，2.5mmdntps2μl，5×fastpfu缓冲液4μl，补双蒸水至20μl。

更为优选的，16srdnapcr扩增的反应程序包括：退火温度为54～56℃，延伸温度为70～74℃。

步骤s3：采用高通量测序技术对患病植株dna样品进行检测并对患病植株dna样品中的菌落组成进行分析。

进一步的，经高通量测序技术测试得到的原始数据经数据拆分、引物序列的除去、拼接以及嵌合体的除去后，得到用于分析菌落组成的有效数据。

优选地，有效数据中的碱基质量值大于20bp和30bp的碱基百分比均大于93％。

优选地，拼接步骤包括：将碱基数目低于20bp的read进行过滤处理；将成对reads拼接组装一条序列；以及根据序列首尾两端的barcode进行样品区分，同时进行序列方向调整。

更为优选的，将对reads拼接组装时的参数为：最小重叠区域的长度为10bp；拼接序列的重叠区域允许的最大错配比率小于0.2。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：

实施例

本实施例提供一种感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，并通过患病植株中的细菌菌群组成与健康植株的细菌菌群组成之间的对比，探究出各种细菌菌群与柑桔黄龙病病原菌的相互关系。

该方法具体包括：

一、砂糖桔样品基因组总dna的提取：

1.1提取步骤：

(1)剪取0.1g叶中脉，剪碎后置于2.0ml的离心管中，用均质仪打碎；

(2)往装有0.1g韧皮部样品的2.0ml离心管中加入200μl已于65℃水浴加热25min的bufferpcb，置于生物样品均质仪(bioprep-24)中高速震荡研磨6次，每次30s；

(3)再加入400μl65℃预热的bufferpcb和12μlβ-巯基乙醇。震荡混匀，置于65℃恒温金属浴中水浴25min，每5min混匀一次；

(4)加入20μlrnasea(10mg/ml)，并室温酶解2min，以去除混杂的rna；

(5)加612μl的氯仿并震荡混匀，12,000rpm离心5min，小心吸取上清水相至一个干净灭菌的1.5ml的离心管中(切勿吸取到固液界面的蛋白层)；

(6)加入等体积bufferbd，颠倒混匀3～5次，再加等体积的无水乙醇，充分混匀后用移液器将其全部加入到吸附柱中，室温静置2min，10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；

(7)将吸附柱重新放回收集管中，加入500μlpwsolution，10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；

(8)将吸附柱放回收集管中，加入500μlwashsolution，10,000rpm，离心1min，倒掉收集管中废液；

(9)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm空管离心2min；

(10)取出吸附柱，将放入一个新的1.5ml离心管中，用移液枪在吸附膜中央加入50μltebuffer，静置3min，12,000rpm离心2min；

(11)此时管中的溶液即为dna溶液，将其置于-20℃保存；

(12)分别取4μldna溶液和1μl6×loadingbuffer分混混匀，在1％的琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统中观察所抽提的dna质量，为后续试验做准备。

1.2提取结果：

通过植物基因组dna抽提试剂盒进行柑桔叶中脉基因组总dna的抽提，电泳结果显示如图1所示，全部样品的总dna都获得明显条带，没有出现明显的dna降解现象，点样孔干净没有蛋白污染，说明砂糖桔基因组dna抽提质量合格。

二、第一引物对的灵敏度分析

2.1引物的选择：

选择3对引物进行黄龙病检测，选出灵敏性最高的引物，再对采集样本进行黄龙病检测，这三对引物的序列如表1所示：

表1砂糖桔黄龙病检测引物

2.2引物灵敏性的比较过程：

以感染柑桔黄龙病的总dna为阳性对照，所有样品均进行2次不同抽提的pcr反应。扩增反应完成后，取5μlpcr扩增产物于1％琼脂糖凝胶上120v电泳30min，最后于凝胶成像系统下观察结果。如在535bp(p1/p2)、400bp(p3/p4)、1167bp(oi1/oi2c)处出现条带，则表明该样品为柑桔黄龙病阳性样品。

引物p1/p2、p3/p4和oi1/oi2c的pcr反应体系为：pcr反应的总体积为25μl，其中：引物各1μl(10pm/l)，待测砂糖桔模板dna1μl(～50ng)，ddh2o10μl，最后加入2×taqpcrmastermix(3×106u/l)12μl。

引物p1/p2和p3/p4的pcr反应条件为：94℃5min后，94℃1min，55℃1min，72℃1min(30个循环)；72℃10min。oi1/oi2c的pcr反应条件为：96℃1min后，94℃30s，55℃30s，72℃1min(35个循环)，72℃4min。

2.3对引物的灵敏度分析结果：

选取果园中为带黄龙病症状、pcr确诊为黄龙病病原菌阳性的10个砂糖桔样本dna，进一步以常规pcr比较3对引物pcr结果(如图2所示，其中a为引物p1/p2；b为引物p3/p4；c为引物oi1/oi2c)。在相同模板、扩增条件下，引物p1/p2的pcr结果显示均无条带；p3/p4引物的扩增条带明显但个别样品(样品1’,样品5)没有明显条带。oi1/oi2c引物的扩增条带明显，所有样品均获得扩增。因此，后续的研究均采用该引物(即oi1/oi2c引物)作为砂糖桔黄龙病病原菌的分子检测引物。

三、筛选患病植株dna样品和健康植株dna样品：

经田间诊断法初步判断结果，果园中样品1-15为正常生长叶片，样品16-30为斑驳型黄化症状。以引物oi1/oi2c对上述所有的样品进行pcr扩增检测。

结果如图3所示，与田间诊断相比，pcr检测准确性大大提高，不仅可以检测出有患病症状的植株，也可检测出患病但未表现症状的植株，具有极高的灵敏性。

四、样品16srdna文库构建：

4.1.实验方法：

为了保证后续试验结果的准确性以及数据分析的可靠性，需要利用低循环pcr扩增并保证循环数统一，通过16srdnapcr扩增构建测序文库，检测目的条带大小是否正确，浓度是否合适，能否进行后续实验。选择16srdna扩增和测序区域为：799f-1115r，设计引物为799f/1115r(5'-aacmggattagataccckg-3'/5'-agggttgcgctcgttg-3')。本试验选取具有代表性且测序所需的样品进行实验，确保在最低的循环数中绝大多数的样品能够扩增出浓度合适的dna产物。

pcr采用transstartfastpfudnapolymerase,20μl反应体系：5×fastpfubuffer4μl,2.5mmdntps2μl,forwardprimer(5μm)0.8μl,reverseprimer(5μm)0.8μl,fastpfupolymerase0.4μl,templatedna10ng，补ddh2o至20μl。

pcr反应程序为：

a.1×(5minat95℃)

b.27×(30secat95℃；30secondsat55℃；45secat72℃)

c.5minat72℃，10℃untilhaltedbyuser

要保证后续的扩增子测序多样性分析顺利进行，样本扩增的16srdna各项指标必须合格。若主带达到10kb以上，dna无蛋白质、色素等杂质污染，总量达到一定的要求，则可进行后续试验；若不达标，则需要进行dna纯化，尽量使主带达到20kb以上，保证dna无蛋白质、色素等杂质的污染，检测方法见表2。

表2样品检测方法

4.2.实验结果：

为了保证实验数据的准确性和可靠性，首先把待所有待测样品进行dna纯化，使其达到进行16srdna扩增子测序的要求，其中16srdna文库构建标准如下：1)dna样品主带在10kb以上；2)dna无蛋白、色素等杂质污染(od(260/280)＝1.6～1.8，od(260/230)>2为合格)。

16srdnapcr扩增结果显示(图4)，所有样品整体上较好，每个样品在400bp处都有明显条带。经优化后pcr扩增条件进行扩增获得每个样品的pcr产物，其结果见表3.3，发现样品1、4～7、11、17～21、23、25、29pcr产物目的条带大小正确，浓度合适，可进行后续实验，虽然其它样品浓度偏低，但pcr产物目的条带大小正确，也可以为后续实验做准备。

五、高通量测序及数据分析

5.1.实验过程：

(1)在illuminahiseq测序平台上完成测序；

(2)illuminahiseq测序平台获得的下机数据为原始数据(rawdata)，然后进行rawdata进行预处理，具体处理步骤如下：

a.数据拆分：通过perl脚本除去barcode序列和pcr扩增引物序列；

b.pereads拼接：把质量较低的read除去(read碱基数目低于20bp)进行过滤处理；根据pereads之间的叠加(overlap)区域，将成对reads拼接组装一条序列，(组装参数：最小overlap长度为10bp；拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2)；根据序列首尾两端的barcode进行样品区分，同时进行序列方向调整，(参数

c.tags去嵌合体序列：经过以上处理后得到的tags序列与数据库(golddatabase,http://drive5.com/uchime/uchime_download.html)进行比对检测嵌合体序列，并去除嵌合体序列，获得最终的有效数据(effectivetags)。

(3)采用微生物操作分类单元(otu)对所得到的有效数据进行分析，并对物种种群分析。

5.2.分析结果：

(1)数据的预处理：

利用illuminahiseq测序平台完成的下机数据(原始数据)经过初步数据处理，其中包括数据的拆分、引物序列的除去、pereads的拼接、tags质量评估与筛选、以及嵌合体的除去，最终获得有效数据(effectivetags)。

本实验获得总共1,157,151个高质量序列，每个样品的中值读数为38,870(序列范围：30,079-44,743)每个样品的effectivetags的平均长度中值读数为299.52(序列范围：296.54-300.02)。effectivetags中碱基质量值大于20bp(测序错误率小于1％)和30bp(测序错误率小于0.1％)的碱基百分比分别为96％和93％以上，结果显示测序数据质量非常高。

(2)otu聚类及物种群落分析

物种组成及多样性信息采用全部effectivetags序列进行聚类分析(默认选取identity为97％)，并形成otu。选取otu的代表性序列，与核糖体rna数据库进行比对获得物种注释信息。基于物种注释信息，去除注释为叶绿体、线粒体以及不能注释到界级别的otu及其包含的tags。根据结果可以发现使用同一性大于或等于97％的微生物有效序列进行otu聚类得到了高质量数据，每个样品得到超过200个otus，几乎没有无法注释到界级别或注释为叶绿体及线粒体的otutags数，表明实验数据的可信度高，可以进行后续分析。

基于otu的绝对丰度及注释信息，对每个样品在各分类水平(界kingdom，门phylum，纲class，目order，科family，属genus，种species)上的序列数目占总序列数的比例进行统计，可以有效的评估样本的物种注释分辨率(注释到属的比例越高表示样本的otu注释效果越好)及样本的物种复杂度(注释到属的比例越低表示样本的物种复杂度越高)，结果显示30个样品全部都能注释到属，且比例较高，注释到种的比例相对较低。

各分类水平的物种在每个样本中的相对丰度(主要展示了门和属级别的物种相对分布情况)统计。在门水平上，发现健康和感病样品中丰度最高的5种没有区别，分别为变形菌门(proteobacteria)、放线菌门(actinobacteria)、蓝藻门(cyanobacteria)、拟杆菌门(bacteroidetes)、酸杆菌门(acidobacteria)。其中变形菌门(proteobacteria)在健康和感病样品中的丰度都是最高，其次是放线菌门(actinobacteria)，而软壁菌门(tenericutes)只在感病样品出现。在属水平上，健康和感病样中丰度分布有区别，其中健康样品中丰度前5分别为甲基杆菌(methylobacterium)(24.48％)、盐单胞菌属(halomonas)(10.27％)、鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas)(6.71％)、放线孢菌属(actinomycetospora)(4.91％)、短小杆菌属(curtobacterium)(2.36％)；感病样品丰度前5分别为甲基杆菌(methylobacterium)(21.24％)、鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas)(9.32％)、盐单胞菌属(halomonas)(5.75％)、韧皮部杆菌属(ca.l.asiaticus)(5.58％)、放线孢菌属(actinomycetospora)(1.50％)，而ca.l.asiaticus、clostridium、turicibacter这三个属在健康样品丰度接近于0，而感病样品中韧皮部杆菌属(ca.l.asiaticus)丰度排名第4，仅次于甲基杆菌属(methylobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas)、盐单胞菌属(halomonas)。综上所述，比较健康与感病样品的菌群多样性发现在门水平上没有区别，而在属水平上发现菌群的种类和丰度均发生改变。

最后通过otu系统进化分析、物种群落结构分析、alphadiversity分析、betadiversity分析、样品组间统计分析得出以下结论：

对感病和健康砂糖桔的16srdna深度测序后，经过物种分类学统计分析可知：

(1)在门水平上，发现健康和感病样品中丰度最高的5个门没有区别，分别为变形菌门(proteobacteria)、放线菌门(actinobacteria)、蓝藻门(cyanobacteria)、拟杆菌门(bacteroidetes)、酸杆菌门(acidobacteria)。其中变形菌门(proteobacteria)在健康和感病样品中的丰度都是最高，其次是放线菌门(actinobacteria)，而软壁菌门(tenericutes)只在感病样品出现。

(2)在属水平上，健康和感病样中丰度分布有区别，其中健康样品中丰度前5分别为甲基杆菌属(methylobacterium)、盐单胞菌属(halomonas)、鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas)、放线孢菌属(actinomycetospora)、短小杆菌属(curtobacterium)；

(3)感病样品丰度前5分别为甲基杆菌(methylobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas)、盐单胞菌属(halomonas)、韧皮部杆菌属(ca.liberibacterasiaticus)、放线孢菌属(actinomycetospora)。而韧皮部杆菌属(ca.liberibacterasiaticus)、梭菌属(clostridium)、葡萄球菌属(turicibacter)这3个属在健康样品丰度接近于0。值得注意的是，黄龙病病原菌为韧皮部杆菌属(ca.liberibacterasiaticus)，感病样品属水平丰度验证了常规pcr的检测结果。

(4)梭菌属clostridium和葡萄球菌属turicibacter两个属出现于感病样品，这与黄龙病病原菌改变植物体内微生态环境相关，比如营养组分，而适宜梭菌属(clostridium)和葡萄球菌属(turicibacter)生长。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。