本发明涉及干细胞培养
技术领域：
，具体地说，涉及一种人参皂苷rg1自体脂肪干细胞体外培养方法。
背景技术：
干细胞(stemcell)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。脂肪干细胞(adipose-derivedstemcells，adscs)、adsc多能细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。主要恢复组织细胞的修复功能，促进细胞的再生，恢复年轻面容的同时，身体机能也得到充分改善，有效改善亚健康、早衰等疾病，由内而外真正的有效抵抗衰老。目前，传统制备方法所制备出的脂肪干细胞，分化能力差、功能单一、细胞增殖率低。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供了一种人参皂苷rg1自体脂肪干细胞体外培养方法，包括如下步骤：取人腹部脂肪组织；利用i型胶原酶对所述人腹部脂肪组织进行消化，得到消化组织；对所述消化组织进行原代细胞分离和接种培养，得到干细胞；取所述干细胞加入至诱导培养基中，进行传代培养；并且，对传代培养的培养液24小时后换液1次，以后每3天换液1次；其中，所述培养基中包括人参皂苷rg1；在6-8天细胞生长融合达到第一预设百分率时，经胰蛋白酶消化，进行二次传代培养；取经过二次传代培养的第三代脂肪间充质干细胞进行培养，在生长至培养瓶底的第二预设百分率的面积时，收获人参皂苷rg1自体脂肪干细胞。进一步的，所述“取人腹部脂肪组织”之后，还包括：对所述人腹部脂肪组织利用磷酸缓冲盐进行冲洗。进一步的，所述人腹部脂肪组织的取样量为20ml。进一步的，所述培养基中人参皂苷rg1的浓度为10-6mol/l-10-8mol/l。进一步的，所述第一预设百分率为80％-90％。进一步的，所述第二预设百分率为70％-80％。进一步的，所述胰蛋白酶的浓度为0.20％-0.28％。进一步的，所述“在6-8天细胞生长融合达到第一预设百分率时，经胰蛋白酶消化，进行二次传代培养”之后，还包括：通过倒置相差显微镜下观察在二次传代培养中原代及传代脂肪间充质干细胞形态及生长状况。本发明提供的一种人参皂苷rg1自体脂肪干细胞体外培养方法，通过对人腹部脂肪组织进行消化、分离、接种和培养，并且经过加入包含有人参皂苷rg1的诱导培养基中二次传代培养，从而在二次传代培养后的第三代脂肪间充质干细胞经过培养，从而得到人参皂苷rg1自体脂肪干细胞。本发明所提供的方法所制备人参皂苷rg1自体脂肪干细胞可大大提高干细胞的增殖率，分化能力强并且除脂肪干细胞本身所具有的功能外还具有人参皂苷的rg1的缓解疲劳、抗衰老、改善学习记忆、保护心血管功能、免疫调节作用等作用。具体实施方式为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明的权利要求做进一步的详细说明，可以理解的是，以下仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围之内。本发明提供了一种人参皂苷rg1自体脂肪干细胞体外培养方法，包括如下步骤：s1，取人腹部脂肪组织；s2，利用i型胶原酶对所述人腹部脂肪组织进行消化，得到消化组织；s3，对所述消化组织进行原代细胞分离和接种培养，得到干细胞；s4，取所述干细胞加入至诱导培养基中，进行传代培养；并且，对传代培养的培养液24小时后换液1次，以后每3天换液1次；其中，所述培养基中包括人参皂苷rg1；s5，在6-8天细胞生长融合达到第一预设百分率时，经胰蛋白酶消化，进行二次传代培养；s6，取经过二次传代培养的第三代脂肪间充质干细胞进行培养，在生长至培养瓶底的第二预设百分率的面积时，收获人参皂苷rg1自体脂肪干细胞。上述，人腹部脂肪组优选为健康成年人腹部多余的脂肪组织。上述，需要说明的是，间充质干细胞是多能干细胞的一种，具有多向分化的潜能，在体外诱导的条件下可以分化为肌肉、神经、骨、软骨、脂肪、心肌和类肝组织等多种组织和细胞。在长期传代后仍然具有增殖复制能力，是一种理想的组织器官工程的种子细胞。目前在临床上也有越来越多的人使用间充质干细胞应用于组织器官的修复和免疫系统调节。人参皂苷(ginsenoside)是一种固醇类化合物，三萜皂苷。主要存在于人参属药材中。人参皂苷被视为是人参中的活性成分，因而成为研究的目标。因为人参皂苷影响了多重的代谢通路，所以其效能也是复杂的，而且各种人参皂苷的单体成分是难以分离出来的。需要说明的是，人参皂苷都具有相似的基本结构，都含有由30个碳原子排列成四个环的甾烷类固醇核。他们依糖苷基架构的不同而被分为两组：达玛烷型和齐墩果烷型。达玛烷类型包括两类：人参二醇型-a型，苷原为20(s)-原人参二醇。包含了最多的人参皂苷，如人参皂苷rb1、rb2、rb3、rc、rd、rg3、rh2及糖苷基pd；人参三醇型-b型，苷原为20(s)-原人参三醇。包含了人参皂苷re、rg1、rg2、rh1及糖苷基pt。齐墩果烷型：齐墩果酸型-c型，苷原为齐墩果酸。总皂苷不溶血，a型抗溶血而b型、c型溶血。其中，人参皂苷rg1具有可快速缓解疲劳、改善学习记忆、延缓衰老，具有兴奋中枢神经作用、抑制血小板凝集作用。上述，在s1取人腹部脂肪组织的步骤中，可以包括：s11，剪切得到成年健康的多余腹部脂肪组织，置入无菌袋中，送入实验室防止污染；s12，在超净工作台内，取出腹部脂肪组织，用75％的酒精泡2min(50-100ml离心管)。s13，用酒精处理完，迅速移入装有pbs(磷酸盐缓冲液)或生理盐水的容器中浸泡清洗2次，每次2min即可。本发明提供的一种人参皂苷rg1自体脂肪干细胞体外培养方法，通过对人腹部脂肪组织进行消化、分离、接种和培养，并且经过加入包含有人参皂苷rg1的诱导培养基中二次传代培养，从而在二次传代培养后的第三代脂肪间充质干细胞经过培养，从而得到人参皂苷rg1自体脂肪干细胞。本发明所提供的方法所制备人参皂苷rg1自体脂肪干细胞可大大提高干细胞的增殖率，分化能力强并且除脂肪干细胞本身所具有的功能外还具有人参皂苷的rg1的缓解疲劳、抗衰老、改善学习记忆、保护心血管功能、免疫调节作用等作用。进一步的，所述s1“取人腹部脂肪组织”之后，还包括：s7，对所述人腹部脂肪组织利用磷酸缓冲盐进行冲洗。进一步的，所述人腹部脂肪组织的取样量为20ml。进一步的，所述培养基中人参皂苷rg1的浓度为10-6mol/l-10-8mol/l。进一步的，所述第一预设百分率为80％-90％。进一步的，所述第二预设百分率为70％-80％。进一步的，所述胰蛋白酶的浓度为0.20％-0.28％。优选的，所述胰蛋白酶的浓度为0.25％。进一步的，所述s5，“在6-8天细胞生长融合达到第一预设百分率时，经胰蛋白酶消化，进行二次传代培养”之后，还包括：s8，通过倒置相差显微镜下观察在二次传代培养中原代及传代脂肪间充质干细胞形态及生长状况。此外，目前，国内对人参总皂苷提取的比较多，但提取人参皂苷单体的较少，因为技术难度比较高，目前国内具备生产人参皂苷单体条件的企业极少，所以单体皂苷的成本尤其是人参皂苷rg1的成本很高，而且市售的人参皂苷rg1的纯度达不到细胞培养级别无法适应干细胞培养，杂质的存在为干细胞的培养、检测及使用造成一定的干扰，给后期大批量生产和研发造成巨额的成本，为解决该问题，本发明中在步骤s1之前，提供一种人参皂苷rg1的提取方法，包括：1、取人参的干燥根50kg，通过粉碎机进行粉碎，过20-40目筛网，得到投料原料；2、将投料原料浸泡于常温常压的70％乙醇中5小时，其间每个1小时充分搅拌20分钟；3、浸泡后，将投料原料及70％乙醇的浸泡药液一起通过高压微波提取设备中进行高压微波提取，功率200-500w，提取时间为1-1.5小时，提取后，过滤得到滤液，再将药渣加入6倍的70％乙醇，通过高压微波提取设备进行二次提取1小时，过滤后合并两次滤液；4、减压真空条件下浓缩合并的滤液，再浓度达到1.10-1.30时，停止浓缩，得到浸膏；5、将所述浸膏通过带式干燥法，在真空条件下并且温度设置为70-85℃，进行带式干燥，粉碎过筛后得到人参皂苷rg1提取物粉末；6、将所述人参皂苷rg1提取物粉末于少量乙醇溶解，并通过高速逆流色谱hsccc进行第一次纯化，配置萃取溶剂为乙酸乙酯-正丁醇-水＝30:10:1，将萃取溶剂过液静置后，输入hsccc中，波长设定为540nm，进行高速萃取纯化，取得纯化液；7、将所述纯化液浓缩后，通过葡聚糖凝胶lh-20进行纯化，lh-20为分子筛，溶剂为甲醇，流速为2-5ml/min，得到分子筛过滤液；8、将所述分子筛过滤液经过制备液相，利用反向硅胶进行分离，波长为540nm，得到人参皂苷rg1单体。本发明中，采用高压微波提取设备对人参的干燥根的投料原料进行粗分离，方法简单速度快，提取率高；并且通过带式干燥法进行干燥大大减少了药液中有效含量的损失；进而采用高速逆流色谱、葡聚糖凝胶和高效液相色谱法进行纯化分离，从而最终得到人参皂苷rg1单体，纯度达到98％以上，纯度高，且方法简单、使用溶剂少降低了时间成本、耗材成本和人工成本，并且在制备自体脂肪干细胞中自制人参皂苷rg1单体，大大降低了原料成本。实施例1-3中所采用的人参皂苷rg1自体脂肪干细胞体外培养方法，包括如下：1、取人参的干燥根50kg，通过粉碎机进行粉碎，过20-40目筛网，得到投料原料；2、将投料原料浸泡于常温常压的70％乙醇中5小时，其间每个1小时充分搅拌20分钟；3、浸泡后，将投料原料及70％乙醇的浸泡药液一起通过高压微波提取设备中进行高压微波提取，功率200-500w，提取时间为1-1.5小时，提取后，过滤得到滤液，再将药渣加入6倍的70％乙醇，通过高压微波提取设备进行二次提取1小时，过滤后合并两次滤液；4、减压真空条件下浓缩合并的滤液，再浓度达到1.10-1.30时，停止浓缩，得到浸膏；5、将所述浸膏通过带式干燥法，在真空条件下并且温度设置为70-85℃，进行带式干燥，粉碎过筛后得到人参皂苷rg1提取物粉末；6、将所述人参皂苷rg1提取物粉末于少量乙醇溶解，并通过高速逆流色谱hsccc进行第一次纯化，配置萃取溶剂为乙酸乙酯-正丁醇-水＝30:10:1，将萃取溶剂过液静置后，输入hsccc中，波长设定为540nm，进行高速萃取纯化，取得纯化液；7、将所述纯化液浓缩后，通过葡聚糖凝胶lh-20进行纯化，lh-20为分子筛，溶剂为甲醇，流速为2-5ml/min，得到分子筛过滤液；8、将所述分子筛过滤液经过制备液相，利用反向硅胶进行分离，波长为540nm，得到人参皂苷rg1单体；9、取健康成人多余的人腹部脂肪组织，包括：9.1、剪切得到成年健康的多余腹部脂肪组织20ml，置入无菌袋中，送入实验室防止污染；9.2，在超净工作台内，取出腹部脂肪组织，用75％的酒精泡2min(50-100ml离心管)；9.3用酒精处理完，迅速移入装有pbs(磷酸盐缓冲液)或生理盐水的容器中浸泡清洗2次，每次2min即可得到人腹部脂肪组织；10、对所述人腹部脂肪组织再次利用磷酸缓冲盐进行浸泡冲洗；11、利用i型胶原酶对所述人腹部脂肪组织进行消化，得到消化组织；12、对所述消化组织进行原代细胞分离和接种培养，得到干细胞；13、取所述干细胞加入至诱导培养基中，进行传代培养；并且，对传代培养的培养液24小时后换液1次，以后每3天换液1次；其中，所述培养基中包括人参皂苷rg1，其浓度为10-6mol/l-10-8mol/l；14、在6-8天细胞生长融合达到第一预设百分率时，经胰蛋白酶消化，进行二次传代培养；15、通过倒置相差显微镜下观察在二次传代培养中原代及传代脂肪间充质干细胞形态及生长状况；16、取经过二次传代培养的第三代脂肪间充质干细胞进行培养，在生长至培养瓶底的第二预设百分率的面积时，收获人参皂苷rg1自体脂肪干细胞。表1实施例1-3中人参皂苷rg1自体脂肪干细胞体外培养方法参数设置实施例1：本实施例采用如上述人参皂苷rg1自体脂肪干细胞体外培养方法中的步骤，并且，采用如表1中的参数设置进行制备。实施例2：本实施例采用如上述人参皂苷rg1自体脂肪干细胞体外培养方法中的步骤，并且，采用如表1中的参数设置进行制备。实施例3：本实施例采用如上述人参皂苷rg1自体脂肪干细胞体外培养方法中的步骤，并且，采用如表1中的参数设置进行制备。增殖率对比实验：实验原理：mtt分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，mtt噻唑蓝为基础。mtt为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素c的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将mtt还原)。还原生成的formazan结晶可在含50％的n，n-二甲基甲酰胺和20％的十二甲基磺酸钠(ph4.7)的mtt溶解液中溶解，利用酶标仪测定490nm处的光密度od值，以反映出活细胞数目。也可以用dmso来溶解。试剂：10％胎小牛血清、mtt溶液、dmso；仪器、耗材：96孔板、离心机、酶联免疫监测仪；实验样品：对照样1-市售脂肪干细胞、对照样2-人参皂苷rd诱导的骨髓间充质干细胞、实施例1-3中所制备得到的人参皂苷rg1自体脂肪干细胞；实验步骤：1、接种细胞用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞(分别加入不同的实验样品，每个样品做至少2个副孔)接种到96孔板，每孔体积200ul。2、培养细胞同一般培养条件，培养3－5天。3、呈色培养3－5天后，每孔加mtt溶液(5mg/ml用pbs配)20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150uldmso，振荡10分钟，使结晶物充分融解。4、比色选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。表2实施例1-3和对照样1-2的细胞增殖率结果增殖率％实施例1151.22实施例2155.28实施例3161.17对照样1101.31对照样2138.87实验结果：通过mtt法对实施例1-3和对照样本1-2进行测定细胞增殖率。其中，实施例1-3在达到10-6mol/l-10-8mol/l浓度rg1刺激下干细胞的增殖倍数要比对照样本1高出50％以上。并且实施例1-3的细胞增殖率均高于对照样本2，证明利用本发明中所提供的人参皂苷rg1自体脂肪干细胞体外培养方法所制备的人参皂苷rg1自体脂肪干细胞具有很高的细胞增殖率。同时rg1还具有成骨诱导活性，可于早期促进自体脂肪间充质干细胞向成骨分化。应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。申请人声明，本发明通过上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程。并且即不意味着本发明应依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页12