本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种农杆菌介导的大白菜转基因的方法。
背景技术：
大白菜(brassicarapassp.pekinensis)原产于中国，属于十字花科芸薹属(brassica)中重要蔬菜作物之一，在我国生产消费中占据重要地位。近年来由于育种工作者的不断努力，大白菜育种已经取得很大成就，但随着人口数量的不断增长，提高大白菜产量，改良大白菜品质仍是当前重要任务。
随着部分模式植物基因组测序的完成，功能基因的研究愈发受到重视，通过分析和鉴定植物基因功能、发掘有益基因并应用于育种实践中，已成为发展趋势所在。因此建立一种简单高效的大白菜转基因方法，对大白菜分子育种及基因功能研究具有重要意义。
技术实现要素：
本发明提供了一种简单高效的农杆菌介导的大白菜转基因的方法，所述方法用含有待转基因的农杆菌侵染液侵染大白菜籽苗的带有1-2mm子叶柄的带柄子叶，所得的基因转化的效率高；此外，所述方法中多种培养基的组成成分和浓度配比基本一致，培养基无需反复更换、改变浓度，极大的简化了转基因操作过程，所得方法简便高效。
本发明的一个目的是提供一种农杆菌介导的大白菜转基因方法，所述方法包括：用含有待转基因的农杆菌侵染液侵染大白菜籽苗的带柄子叶。
具体的，所述大白菜籽苗的带柄子叶的制备方法包括：将大白菜种子培养4天，获得籽苗，再将籽苗从子叶柄部切下，切去生长点，并带有1-2mm子叶柄。
具体的，所述种子在培养前，要进行消毒处理；再具体的，所述消毒处理包括将大白菜成熟的种子在超净工作台用体积浓度为75％的酒精浸泡30s，然后转入质量浓度为10％的naclo溶液中消毒1min，再转入质量浓度为10％的naclo溶液中消毒15min，灭菌水冲洗3～5遍。
具体的，所述籽苗为无菌籽苗。
具体的，所述培养使用的培养基包括含20g/l蔗糖和7g/l琼脂粉的1/2ms培养基。
具体的，所述侵染包括侵染15分钟。
具体的，所述侵染后，还包括：取出带柄子叶在灭菌的滤纸上晾干后，接种到含0.5mg/l萘乙酸、5mg/l6-苄氨基嘌呤、4mg/l硝酸银、7g/l琼脂粉和30g/l蔗糖，ph5.8的ms培养基中，25℃暗培养3天，获得转基因外植体。
具体的，所述方法还包括：将所述转基因外植体培养成转基因芽，然后再培养成转基因植株；
所述转基因芽的培养方法包括：将所述转基因外植体接种到筛选培养基中，25℃每天光照16h的条件下培养1～2个月即得；
所述转基因植株的培养方法包括：将所述转基因芽继代到ms中，待芽伸长至1cm以上，具体为2厘米，再接到筛选生根培养基中进行生根培养，然后挑选根系发达的植株移栽到灭菌的栽培基质中，浇透水并覆盖塑料膜，25℃每天光照16h的条件下培养至植株生长健壮后去掉塑料膜即得。
具体的，所述筛选培养基包括含200mg特美汀、25mg潮霉素、0.5mg/l萘乙酸、5mg/l6-苄氨基嘌呤、4mg/l硝酸银、7g/l琼脂粉和30g/l蔗糖，ph5.8的ms培养基；
所述筛选生根培养基包括含有200mg特美汀、25mg潮霉素、0.5mg/l萘乙酸、7g/l琼脂粉和30g/l蔗糖的ms培养基；
所述基质包括草炭和蛭石，比例为蛭石：草炭＝1:3。
具体的，所述含有待转基因的农杆菌侵染液的制备方法包括：
将含有待转基因的载体或质粒通过冻融法转到农杆菌中，获得农杆菌工程菌；将所述农杆菌工程菌的单菌落，接种到含卡那霉素50mg/l和庆大霉素50mg/l，ph7.0的lb液体培养基中，28℃、220r/min的条件下培养至菌液od600值为0.5，然后取2ml的菌液离心，6000r/min的转速离心10min,弃上清后加入等体积的含100μm乙酰丁香酮和30g/l蔗糖的ms液体培养基混匀后，再以6000r/min的转速离心10min,弃上清后加入等体积的含100μm乙酰丁香酮和30g/l蔗糖的ms液体培养基混匀，再用20ml含100μm乙酰丁香酮和30g/l蔗糖的ms液体培养基稀释十倍，即得侵染液。
具体的，所述冻融法包括：-80℃保存的农杆菌感受态置于冰上融化，每50μl感受态加入3μl质粒，用手轻触管底，冰上静置5min，液氮速冻5min,37℃水浴5min，冰浴5min，然后加入450μl无抗液体lb培养基，28℃190-200r/min培养1-2h后，涂布于抗性lb平板上，28℃培养48h。
本发明的另一个目的是提供一种培养基，所述培养基包括下述1)-3)中至少一种：
1)含0.5mg/l萘乙酸、5mg/l6-苄氨基嘌呤、4mg/l硝酸银、7g/l琼脂粉和30g/l蔗糖，ph5.8的ms培养基；
2)含200mg特美汀、25mg潮霉素、0.5mg/l萘乙酸、5mg/l6-苄氨基嘌呤、4mg/l硝酸银、7g/l琼脂粉和30g/l蔗糖，ph5.8的ms培养基；
3)含有200mg特美汀、25mg潮霉素、0.5mg/l萘乙酸、7g/l琼脂粉和30g/l蔗糖的ms培养基。
本发明的再一个目的是提供本发明任一所述方法的应用。具体的，所述应用包括在制备转基因大白菜中的应用。
本发明的再一个目的是提供本发明任一所述培养基的应用。具体的，所述应用包括在制备转基因产品中的应用。所述产品包括转基因植物，具体的，包括转基因大白菜。
本发明提供的一种，至少具有以下优点：
(1)本发明提供了一种简单高效的农杆菌介导的大白菜转基因的方法，所述方法中多种培养基的组成成分和浓度配比基本一致，培养基无需反复更换、改变浓度，极大的简化了转基因操作过程，所得方法简便高效。例如抗性芽筛选培养基的各成分浓度为0.5mg/l萘乙酸、5mg/l6-苄氨基嘌呤、4mg/l硝酸银、7g/l琼脂粉和30g/l蔗糖、200mg特美汀、25mg潮霉素，共培养培养基无须加特美汀和潮霉素，生根培养基无须加6-苄氨基嘌呤和硝酸银，其他成分完全一致，培养基无需反复更换、改变浓度，操作方便高效。
(2)用含有待转基因的农杆菌侵染液侵染大白菜籽苗的带有1-2mm子叶柄的带柄子叶，基因转化的效率高，最高转化率为13.5％，平均转化效率8％。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为抗性植株的bra012543基因pcr检测扩增的电泳图，其中m1表示markerdl15000，m2表示markerdl2000，a表示重组质粒阳性对照，b表示野生型大白菜阴性对照，c表示dd水阴性对照，1—8表示抗性植株。
图2为部分转基因植株的us染色检测图，其中a表示野生型大白菜对照，b、c、d为阳性转基因植株。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
克隆载体为35s-asc质粒载体。35s-asc质粒载体以pgem-t为骨架改造获得，具体制备方法为：首先按照pgem-teasy系统(promegacat.#a3600)将拟南芥act7(at5g09810.1)基因(genbankaccessionno.nc_003076.8(3052062..3054691))插入pgem-t载体，获得环形稳定的pgem-act7载体；然后利用in-fusion克隆技术(takarain-fusionhdcloningkits,codeno.639636)将pbin35sred(载体上的camv启动子多克隆位点和nos终止序列连接到pgem-act7中的apaⅰ和sacⅰ酶切位点之间即得。
质粒pcambia1305.1，购自优宝生物科技有限公司。用于克隆转化的大肠杆菌感受态细胞为trans5α，购自北京全式金生物技术公司。
菌种为根癌农杆菌gv3101购自北京华越洋生物技术有限公司。
下述实施例中lb培养基由10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物和10g的氯化钠加入蒸馏水并定容至1000ml组成。
下述实施例中所述的冻融法转化农杆菌的一般步骤为:-80℃保存的农杆菌感受态(gv3101)置于冰上融化，每50μl感受态加入3μl质粒，用手轻触管底，冰上静置5min，液氮速冻5min,37℃水浴5min，冰浴5min，然后加入450μl无抗液体lb培养基，28℃190-200r/min培养1-2h后，涂布于抗性lb平板上，28℃培养48h。
实施例1、农杆菌介导的大白菜转基因方法
(一)外植体的获得
将大白菜成熟的种子在超净工作台用体积浓度为75％的酒精浸泡30s，然后转入质量浓度为10％的naclo溶液中消毒1min，再转入质量浓度为10％的naclo溶液中消毒15min，灭菌水冲洗3～5遍，再接种到含20g/l蔗糖和7g/l琼脂粉的1/2ms培养基上培养4天，获得无菌籽苗，再将无菌籽苗从子叶柄部切下，保证切去生长点，并带有1-2mm子叶柄待侵染。
(二)目的基因的制备
扩增目的基因的引物序列为：
正向引物，如序列表中seqid№：1所示核苷酸序列：
5’-atggcgggacagtcgcga-3’
反向引物，如序列表中seqid№：2所示核苷酸序列：
5’-ctatgaatcaatgtttga-3’
以上述设计的引物和大白菜参考基因组测序材料“chiifu”基因组dna为模板，进行pcr扩增。将pcr扩增产物进行测序。测序结果表明，上述pcr扩增得到具有序列表中seqid№：3的核苷酸序列，共1716bp，其中编码区长1716bp，将该具有序列表中seqid№：3中第1-至第1716位的核苷酸序列的片段命名为bra012543。
(三)含有目的基因及gus基因的载体的制备
根据35s-asc质粒载体xbai酶切位点两端15bp为接头设计引物534-1，扩增bra012543，用1％的琼脂糖检测pcr产物，用takara胶回收试剂盒纯化目的基因并检测浓度。用xbai酶酶切35s-asc质粒载体使之线性化，回收后检测浓度。用
上述设计的534-1引物序列为：
正向引物，如序列表中seqid№：4所示核苷酸序列：
f：gataagcttggatccatggcgggacagtcgcgaaaatg
反向引物，如序列表中seqid№：5所示核苷酸序列：
r：tcattaaagcaggacctatgaatcaatgtttgaacttatc
上述设计的534-2引物序列为：
正向引物，如序列表中seqid№：6所示核苷酸序列：
f：gagctcggtacccggtcgacgaattaattccaatcccac
反向引物，如序列表中seqid№：7所示核苷酸序列：
r：caggtcgactctagatttaggtgacactatagaatatgca
(四)含有目的基因及gus基因的农杆菌工程菌的活化及外源基因的转化
将上述步骤(三)所制备得到的含有目的基因及gus基因的载体pcambia1305.1-bra012543利用冻融法转到根癌农杆菌gv3101中。
挑取一个含有bra012543基因及gus基因的农杆菌工程菌的单菌落，接种到含卡那霉素50mg/l和庆大霉素50mg/l的lb液体培养基(ph7.0)中，28℃、220r/min的条件下培养至菌液od600值为0.5，然后用移液枪吸2ml的菌液至离心管中，6000r/min的转速离心10min,弃上清后加入等体积的含100μm乙酰丁香酮(as)和30g/l蔗糖的ms液体培养基混匀后，再以6000r/min的转速离心10min,弃上清后加入等体积的含100μm乙酰丁香酮(as)和30g/l蔗糖的ms液体培养基混匀，再用20ml含100μm乙酰丁香酮(as)和30g/l蔗糖的ms液体培养基稀释十倍，获得侵染液，将上述步骤(一)中获得的外植体放入三角瓶内加入侵染液侵染15min，然后取出在灭菌的滤纸上晾干后接种到含0.5mg/l萘乙酸(naa)、5mg/l6-苄氨基嘌呤(6-ba)、4mg/l硝酸银(agno3)、7g/l琼脂粉和30g/l蔗糖的ms培养基(mc，ph5.8)中25℃暗培养3天即共培养。
(五)抗性芽的获得
将共培养三天的外植体接种到含200mg特美汀(tmt)、25mg潮霉素(hyg)、0.5mg/l萘乙酸(naa)、5mg/l6-苄氨基嘌呤(6-ba)、4mg/l硝酸银(agno3)、7g/l琼脂粉和30g/l蔗糖的ms培养基(ms，ph5.8)中25℃每天光照16h的条件下培养1～2个月，获得抗性芽。
(六)抗性植株的获得
将抗性芽继代到ms中，待芽伸长至2cm左右，再接到含有200mg特美汀(tmt)、25mg潮霉素(hyg)、0.5mg/l萘乙酸(naa)、7g/l琼脂粉和30g/l蔗糖的ms培养基(mr)进行生根培养，再挑选根系发达的植株移栽到灭菌的栽培基质(比例为蛭石：草炭＝1:3，n、p、k总含量>12g/kg,有机质含量>40％)中，浇透水并覆盖塑料膜，25℃每天光照16h的条件下培养至植株生长健壮后去掉塑料膜，获得抗性植株。
(七)转基因植株的检测
对上述步骤(六)所获得的抗性植株进行pcr检测和gus染色检测。
(1)pcr检测
取抗性植株的叶片，用常规ctab法提取基因组dna，以含bra012543基因的重组质粒dna做阳性对照，未转化植株dna及ddh2o做阴性对照，进行pcr检测。
反应体系为：takarapremixtap酶10μl、引物各1μl、dna模板3μl、加ddh2o至20μl。
上述反应体系中的引物序列为：
正向引物，如序列表中seqid№：1所示核苷酸序列：
5’-atggcgggacagtcgcga-3’
反向引物，如序列表中seqid№：2所示核苷酸序列：
5’-ctatgaatcaatgtttga-3’
上述反应体系中的dna模板为常规ctab法提取的待测样品的基因组dna。
扩增程序为：bra012543基因扩增程序为95℃预变性5min，95℃变性30s,60℃退火30s，72延伸1.5min，循环35次，72℃5min，4℃保温。
取pcr反应产物10μl，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，观察是否含有目的基因条带。检测结果如图1所示。图1结果表明8株抗性植株全部呈阳性，初步证明目的基因已经整合到抗性植株的基因组中。
(2)gus染色检测
取pcr检测为阳性的抗性植株的叶片，用预冷的90％丙酮预处理20-30min；用蒸馏水漂洗干净；加入配置好的gus染色工作液(购于中科瑞泰生物科技有限公司)至完全覆盖材料；锡箔纸包好常温过夜；用70％酒精洗脱浸泡至叶绿素全部除去，白色背景上的蓝色小点即为gus表达位点。检测结果如图2所示。图2结果表明gus基因已经整合到转基因植株中，进一步证明重组质粒已携带目的基因成功整合到转基因植株基因组中。
上述实施例1的验证结果证明，利用本发明提供的大白菜转基因方法，能成功将目的基因转入大白菜的基因组中。经多次重复试验，最高转化率为13.5％，平均转化效率8％(转化率为转基因阳性植株占外植体总数的比例)。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>沈阳农业大学
<120>一种农杆菌介导的大白菜转基因方法
<160>7
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
atggcgggacagtcgcga18
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
ctatgaatcaatgtttga18
<210>3
<211>1716
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
atggcgggacagtcgcgaaaatggatgattctagtggcgacgatatggattcaggctttc60
accgggacgaacttcgatttctcggcttactcttcggagttgaaatcggttctggggatt120
tcgcaggtgcagcttaactacctcgccgtggcttccgatctcgggaaggtgttcgggtgg180
tcgtcggggctcgcgctgatgtattttccgatttggacggtgcttttcgcggcggcgttt240
atggggttcgtcggttatggagtacagtggctcgtcataactaacttcatctctttgccg300
tatattgtggtgttcctctgttgcttactcgctggtctaagcatctgttggttcaacaca360
gtctgctttgtcctctgcatcagtaacttccctgcaaacagatcacttgctctttccctc420
accgtcagcttcaacggtgtaagcgcagctttatacactctcgcttacaacgcaatcaac480
ccaacctctccagagctctaccttctcttaaacgctcttatccctcttgtcatctctttc540
actgccatcatccctattcttcgccaaccgcctttcgagcctcttccaccagatggtgtt600
cgccgtgactctctcatgtttctaatcctcaacattctcgctgctttaaacggtgtttat660
ctccttctctttgagtcaaactcctctgctttaacctctgctcgtctcctcttcggtgga720
gctatcctcctcttgatcctccctttatgtattcccggtttagtcatcgcccggaactgg780
tatcttcgcacgatccacaccagttttcgtctcgaaggctccggtttcattcttgttgat840
cctgatgagcttgagttgcataaagggatgcttgcacatgaagccaatagagaaagctac900
cagttgctgaccgatgatgttgtgccaaacccggttaagactatagctgtggaggaaggt960
gatgctgatgagtcttcttgttgcaagaagcttatcacaagaggtcagcttgagctattg1020
ggaattgaacattctctgtggcagctcttaagcagagctgatttttggttctactatgtc1080
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cagtctttaggacaaagctcaaacaccacaactcttgtcacactttattcctctttctcg1200
ttctttggaagattactctctgcgacaccagactatatccgagcgaaggtttattttgca1260
agaaccgggtggctagcaatcgcgttattaccaacaccaatcgcgctcttcttgctcgca1320
tcatcaggaaccgcgtcagcactacaagttggaaccgctctgatgggtctaagctcagga1380
ttcatattcgcagcagcggtttccatcacatcagagctttttggaccaaacagtgttgga1440
gttaaccacaatatcttgatcacaaacataccaataggatcattgatctatggcttcttg1500
gctgcattggtctatgattcacatggtacgacagggatcaagtccatgacagactcggtc1560
gtgtgtatgggacgaggttgctatcacatgacgtttgtgtggtggggatgcttgtcggta1620
cttggactaggttcgagtcttgtcctgtttataagaactagaaaagcttatcaacggttt1680
gaacaagctcggataagttcaaacattgattcatag1716
<210>4
<211>38
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
gataagcttggatccatggcgggacagtcgcgaaaatg38
<210>5
<211>40
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
tcattaaagcaggacctatgaatcaatgtttgaacttatc40
<210>6
<211>39
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
gagctcggtacccggtcgacgaattaattccaatcccac39
<210>7
<211>40
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
caggtcgactctagatttaggtgacactatagaatatgca40