一种用于蛋白质转导的蛋白质载体及其制备方法和应用与流程

本发明属于细胞生物学领域，特别是涉及一种用于蛋白质转导的蛋白质载体及其制备方法和应用。

背景技术

在生物学和医学领域，常用蛋白质、抗体、酶、多肽等研究细胞内活动(细胞内物质运输、表达调控)以及进行细胞内治疗，但它们无法透过细胞膜，同时较难非破坏性地将这些外源大分子输入活细胞中，因而限制了它们的应用。

目前在实验及临床上，大多采用转染的方法将外源蛋白的dna转入细胞内，但是转染的方法只适用于少数特定的细胞，如hek293t细胞，应用范围有限，且对于一般细胞而言，转染效率非常低。

另外，有些研究者利用病毒携带外源蛋白进入细胞，虽然能使外源蛋白有效进入细胞，但是病毒可能对细胞产生毒害，且病毒基因可能会整合到细胞的基因组dna上，不安全因素较大。因此，寻求一种无毒无害、安全可靠、高效率可携带外源蛋白进入多种细胞的方法具有广阔的应用前景。

2006年，日本科学家山中伸弥(shinyayamanaka)利用病毒载体将四个转录因子(oct4，sox2，klf4和c-myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞和胚胎apsc多能细胞，从而提出了诱导多能干细胞(ips)，目前ips技术快速发展，有望应用于器官移植、建立疾病模型，了解发病机理、治疗某些基因遗传病等。目前对于诱导多能干细胞的形成大多也是采用导入dna的方法，但同样存在外源dna整合到基因组的风险，从安全性出发，更适合采用一种无毒且能直接将外源蛋白等诱导物导入细胞。

蛋白质类物质由于其低毒性、高活性，且特异性强，已经成为生物及医药产品中的重要一部分。但是由于其无法直接跨过细胞膜，利用胞吞作用进入细胞效率很低，使其在生物技术研究、医用给药方面的应用极大受限。霍乱弧菌产生的ct是当今研究最多且最深入的黏膜佐剂之一，具有很强的黏膜佐剂活性。它是一种ab5型蛋白毒素，由1个a亚基(cta)和5个b亚基(ctb)组成。cta亚基具有毒性，而ctb亚基无毒，可以与真核生物细胞膜上的gm1神经节苷脂相结合，从而促进与之相连的cta亚基进入细胞。中国专利申请cn201410578270.0公开了一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质，其获得ctb5/egfp-cta2-tat嵌合蛋白，也是通过模拟ct结构的跨膜作用，将外源药物靶向导入脑部。该发明为得到目的蛋白，构建了pet-22b-egfp-cta2-tat与pet-28a-ctb两个表达载体，利用两个质粒的不相容抗性表达获得目的蛋白。但是目的蛋白含有cta，可能具有潜在的毒理作用，存在一定的安全隐患和风险。此外，该发明只说明目的蛋白可将药物靶向导入脑部，对于其能否进入其他部位或者细胞并未有说明，应用领域具有局限性。

基于上述现有技术中存在亟需解决的问题，一种新的既能安全可靠地直接将外源蛋白导入细胞，又能应用于药物的靶向给药的载体的设计与开发十分迫切。本发明开发了一种用于蛋白质转导的蛋白质载体，该蛋白质载体结构简单，安全无毒，适合多种蛋白、多肽等的转导，为研究细胞内活动(细胞内物质运输、表达调控)以及进行细胞内治疗提供一种新的、安全有效的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于蛋白质转导的蛋白质载体。

本发明的另一目的是提供该蛋白质载体的制备方法

本发明的再一目的是提供该蛋白质载体的用途。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于蛋白质转导的蛋白质载体，其特征在于，该蛋白载体的氨基酸载体如seqidno.1所示的mctb-egfp构成。

一种用于蛋白质转导的蛋白质载体，其特征在于该蛋白质载体由一个氨基酸序列如seqidno.2所示的mbp亚基，一个氨基酸序列如seqidno.3所示的ctb亚基以及一个氨基酸序列如seqidno.4所示的egfp亚基构成。

麦芽糖结合蛋白(mbp)是大肠杆菌麦芽糖转运系统的成员之一，主要负责麦芽糖的摄取及分解代谢。mbp融合蛋白原核表达载体表达效率高、易于纯化。本发明采用mbp能够促进蛋白质载体与其融合表达的外源蛋白的溶解性。

霍乱弧菌产生的霍乱毒素(ct)是一种ab5型蛋白毒素，它由1个a亚基(cta)和5个b亚基(ctb)组成，常作为黏膜佐剂广泛应用于动物模型构建。但ct中的cta具有毒性，而ctb无毒。单独的ctb为包涵体表达，不具有生物学活性，一般均需将ctb和cta同时表达，使其形成ct才具有生物学活性，本发明利用mbp与ctb连接，既将ctb从ct中分离出来，大大简便了实验操作，又使ctb为可溶性表达，具备生物学活性，解决了现有技术中的蛋白质载体对细胞存在潜在毒副作用的问题。

一种用于蛋白质转导的蛋白质载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)采用pcr法或基因合成法获得mbp、egfp以及ctb的编码序列dna；

(2)将上述dna插入pgex-4t-1中，替换pgex-4t-1质粒中原有的gst标签，获得重组质粒pex-4t-mbp-ctb-egfp；

(3)将重组质粒pex-4t-mbp-ctb-egfp导入大肠杆菌bl21，在iptg诱导下表达重组蛋白；

(4)纯化，得到蛋白质载体mctb-egfp。

进一步地，所述步骤(1)具体为：利用pcr法从pmal-c2x质粒中获得mbp基因片段，利用pcr法从pcmv-c-egfp质粒中获得egfp基因片段，利用基因合成得到同源片段1-ctb-同源片段2基因。

进一步地，所述步骤(2)具体为：对mbp亚基进行pcr扩增，通过同源重组的方法将mbp片段克隆至质粒pgex-4t-1中，且替换掉质粒中原有的gst标签，获得重组质粒pex-4t-mbp；对egfp亚基进行pcr扩增，通过mrei酶切位点连入pex-4t-mbp载体中，获得重组质粒pex-4t-mbp-egfp；对ctb亚基进行扩增，利用ctb基因两端的同源片段，采用同源重组将ctb基因插入pex-4t-mbp-egfp载体中noti克隆位点，获得重组质粒pex-4t-mbp-ctb-egfp。

进一步地，所述步骤(3)具体为：将pex-4t-mbp-ctb-egfp转入大肠杆菌bl21感受态中，在1‰amp抗生素压力下涂布lb琼脂平板，选择稳定存在的单菌落，再次经过菌液菌落pcr、pcr鉴定，获得能稳定传代的工程菌；然后在含1‰amp抗生素的lb肉汤中接入获得的工程菌，摇菌培养，在培养基中加入iptg，然后转移至16℃继续培养；离心后于沉淀中加入裂解液，并结合超声破碎，离心取上清液。

进一步地，所述步骤(4)采用ni柱纯化。

一种用于蛋白质转导的蛋白质载体的应用，通过基因工程手段用待转导的外源蛋白质替换蛋白质载体中的egfp获得重组蛋白，将重组蛋白与目标细胞共同孵育，重组蛋白穿过细胞膜，进入细胞内部。

进一步地，所述外源蛋白包括原肌球蛋白(tm)、精氨酸激酶(ak)、卵清蛋白(ova)、oct4、sox2、klf4、c-myc以及cas9等。

进一步地，所述目标细胞包括hek293t细胞、rbl-2h3细胞、lad2细胞、caco-2细胞或hela细胞。

本发明利用无毒的霍乱毒素b亚基为跨膜载体，利用基因工程技术在其前端插入具有促溶功能的mbp蛋白，使原为包涵体表达的ctb蛋白部分可溶，并可在ctb后端接入其他蛋白，通过与细胞共同孵育，即可使外源蛋白进入细胞，从而研究细胞内的多种机理以及进行相关细胞治疗。

ctb能够与真核细胞上的神经节苷脂(gm1)结合，从而将整个蛋白分子“固定”于细胞表面，且ctb能增加细胞膜的通透性，从而促进蛋白进入细胞。

本发明可直接携带外源蛋白进入多种真核生物细胞内，无需导入dna，不存在外源dna整合到细胞基因组dna上的风险，而且蛋白本身无毒，在细胞内可降解，对细胞无毒副作用。

本发明的有益效果：

(1)本发明利用麦芽糖结合蛋白(mbp)能够促进与其融合表达的外援蛋白的溶解性特点，将其与霍乱毒素中无毒但具有黏膜佐剂功能的b亚基(ctb)连接，获得一种简单的、无毒的、具有携带外源蛋白进入多种细胞的多亚基蛋白，为研究细胞内活动(细胞内物质运输、表达调控)以及进行细胞内治疗提供一种新的、安全有效的方法。

(2)本发明通过基因筛选、密码子优化、基因合成得到一条适合在大肠杆菌中表达的ctb亚基，并将其插入质粒pex-4t-mbp-egfp中，利用mbp的促溶功能使其适宜在大肠杆菌中可溶性表达。

(3)本发明制备方法采用大肠杆菌作为表达宿主菌，转化效率高，目的蛋白表达量可达到120mg/l细菌培养液。

附图说明

图1是pex-4t-mbp-egfp质粒构建流程图；

图2是转化后mbp基因的菌液pcr产物琼脂糖电泳图；

图3是mbp-egfp基因的菌液pcr产物琼脂糖电泳图；

图4是pex-4t-mbp-ctb-egfp质粒构建流程图；

图5是转化后mbp-ctb-egfp基因的菌液pcr产物琼脂糖电泳图；

图6是转化后ctb-egfp基因的菌液pcr产物琼脂糖电泳图；

图7是mctb-egfp融合蛋白的sds-page电泳图；

图8是mctb-egfp进出细胞图；

图9是mctb-tm融合蛋白的sds-page电泳图；

图10是mctb-tm蛋白致敏的balb/c小鼠血清中tm特异性ige含量。

具体实施方式

以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。

具体实施方式中所用到的生物材料及来源：

(1)载体pgex-4t-1：南京金斯瑞公司购买；

(2)大肠杆菌bl21感受态细胞：生工生物工程(上海)股份有限公司购买；

(3)ctb基因：由通用生物系统(安徽)有限公司合成。

具体实施方式中用于蛋白质转导的蛋白质载体的一般制备步骤如下：

(1)基因设计与获得

麦芽糖结合蛋白(mbp)基因，其氨基酸序列如seqidno.2所示。利用pcr法从pmal-c2x质粒中获得mbp基因片段。增强型绿色荧光蛋白(egfp)基因，其氨基酸序列如seqidno.4所示，。利用pcr法从pcmv-c-egfp质粒中获得egfp基因片段。霍乱毒素b亚基(ctb)基因，其氨基酸序列如seqidno.3所示。通过ncbi搜索ctb基因序列，优化序列使其适宜在大肠杆菌中表达，并在其前后两端插入20bp目的载体(pex-4t-mbp-egfp)中克隆位点的同源片段(含限制性酶切位点)，利用基因合成得到同源片段1-ctb-同源片段2基因，由通用生物系统(安徽)有限公司合成。

(2)基因工程菌的构建

采用primerpremier5.0专业引物设计软件设计引物如seqidno.8-9所示，对seqidno.5进行pcr扩增，通过同源重组的方法将mbp片段克隆至质粒pgex-4t-1中，且替换掉质粒中原有的gst标签，通过质粒提取、菌落pcr、菌液pcr，测序鉴定，获得重组质粒pex-4t-mbp。

采用primerpremier5.0专业引物设计软件设计引物如seqidno.10-11所示，对seqidno.7进行pcr扩增，通过mrei酶切位点连入pex-4t-mbp载体中，转化至大肠杆菌stbl3感受态中，1‰amp抗生素压力下筛选稳定生长的单菌落，进行质粒提取、菌落pcr、菌液pcr，测序鉴定，获得重组质粒pex-4t-mbp-egfp。

采用primerpremier5.0专业引物设计软件设计引物如seqidno.12-13所示，对seqidno.6进行pcr扩增，利用ctb基因两端的同源片段，采用同源重组将ctb基因插入pex-4t-mbp-egfp载体中noti克隆位点，转化至大肠杆菌stbl3感受态中，1‰amp抗生素压力下筛选稳定生长的单菌落，进行质粒提取，菌落pcr、菌液pcr，测序鉴定，获得重组质粒pex-4t-mbp-ctb-egfp。

将pex-4t-mbp-ctb-egfp转入大肠杆菌bl21感受态中，在1‰amp抗生素压力下涂布lb琼脂平板，选择稳定存在的单菌落，再次经过菌液菌落pcr、pcr鉴定，获得能稳定传代的工程菌。

(3)融合蛋白的表达和纯化

在含1‰amp抗生素的lb肉汤中接入获得的工程菌，在37℃下摇菌培养3h后，在培养基中加入tptg，然后转移至16℃培养16h；离心后于沉淀中加入裂解液，并结合超声破碎，离心取上清。ctb本为包涵体表达，但在连接mbp后，变为可溶性表达，无需进行包涵体复性，可直接采用ni柱纯化得到目的蛋白。

实施例1质粒载体pex-4t-mbp-egfp的构建

用pcr方法从野生型含mbp、egfp的质粒中分别获得mbp和egfp基因片段，先将mbp基因片段(氨基酸序列如seqidno.2，dna序列如seqidno.5)克隆到pgex-4t-1载体中，替换载体中原有的gst标签，并在其后插入多个酶切位点，获得重组质粒pex-4t-mbp，然后将egfp基因片段(氨基酸序列如seqidno.4，dna序列如seqidno.7)插入mbp后的mrei酶切位点后，获得重组质粒pex-4t-mbp-egfp，其构建图如图1所示，具体实验步骤如下：

(1)mbp替换gst标签：

表1mbp基因片段的pcr试剂用量

试剂用量如表1所示，首先用限制性酶msci和noti切断原pgex-4t-1中gst蛋白所在序列。同时利用同源重组原理，在mbp片段原有的上游引物中加入pgex-4t-1中gst所在位置的前20bp的同源序列，下游引物加入noti位点后20bp的同源序列，采用引物如：

forward:5’—tcacacaggaaacagtattc(同源序列上游)+atgaaaatcgaagaaggtaa(mbp上游引物)—3’，seqidno.8；

reverse:5’—gtacgtcagtcagtcacgat(同源序列下游)+tgcgccggcgcctgcggccg(mbp下游引物)—3’，seqidno.9；

对mbp基因序列进行pcr扩增，pcr反应条件见表2，采用高保真pcr试剂盒(南京诺唯赞公司)，pcr反应体系(50μl)：

表2mbp基因片段的pcr反应条件

pcr产物经dnpi酶切，加热使酶失活。后将线性化的pgex-4t-1质粒与mbp的pcr产物用cloniionestepcloningkit试剂盒(南京诺唯赞公司)进行同源重组。重组产物立刻转化导入大肠杆菌stbl3中，涂布与lb琼脂(含1‰amp)上，于37℃培养16h后挑取单菌落，接种于5mllb肉汤(含1‰amp)于37℃，200r/min，培养16h后进行菌液pcr，pcr产物琼脂糖电泳图如图2所示，1-3泳道为pcr成功的不同菌落的菌液。之后利用细菌质粒提取试剂盒(上海生工有限公司)提取转化成功组中的质粒。

(2)插入egfp基因片段

各试剂用量如表3所示，首先用限制性酶mrei切断质粒pgex-4t-1-mbp，使其线性化。同时利用同源重组的方法，在egfp片段原有的引物中加入pgex-4t-1-mbp中noti位点的前后各20bp的同源序列，且在上游插入noti，采用引物如：

forward:5’—cggccgcaggcgccggcgca(同源片段+mrei)+atggtgagcaagggcgagga(egfp上游引物)—3’，seqidno.10

reverse:5’—gtacgtcagtcagtcacgat(同源片段)+gatatctcagtggtggtggt(egfp下游引物)—3’seqidno.11；

对egfp基因序列进行pcr扩增，pcr反应条件见表4，采用高保真pcr试剂盒，pcr反应体系(50μl)：

表3egfp基因片段的pcr反应试剂用量

表4egfp基因片段的pcr反应条件：

pcr产物经dnpi酶切，加热使酶失活。将线性化的pgex-4t-mbp质粒与egfp的pcr产物用cloniionestepcloningkit试剂盒进行同源重组。重组产物立刻转化导入大肠杆菌stbl3中，涂布与lb琼脂(含1‰amp)上，于37℃培养16h后挑取单菌落，接种于5mllb肉汤(含1‰amp)于37℃，200r/min，培养16h后进行菌液pcr(采用mbp的上游引物，egfp的下游引物)，mbp-egfp基因片段的pcr产物琼脂糖电泳图如图3所示，1-4泳道为不同单菌落的菌液。之后利用细菌质粒提取试剂盒提取转化成功组中的质粒

实施例2质粒载体pex-4t-mbp-ctb-egfp的构建

pex-4t-mbp-ctb-egfp的构建流程图如图4所示。试剂用量见表5，通过ncbi搜索ctb基因序列(氨基酸序列如seqidno.3，dna序列如seqidno.6)，优化序列使其适宜在大肠杆菌中表达，并在其前后两端插入20bp目的载体(pex-4t-mbp-egfp)中克隆位点(noti位点)的同源片段(含限制性酶切位点)，由通用生物系统(安徽)有限公司合成得到同源片段1-ctb-同源片段2基因。采用引物：

forward:5’—acaaggacgacgatgacaag—3’，seqidno.12；

reverse:5’—tggtgatgatgatgatgatg—3’，seqidno.13；

对同源片段1-ctb-同源片段2基因进行pcr扩增，扩增条件见表6，采用高保真pcr试剂盒，pcr反应体系(50μl)：

表5试剂用量

表6pcr反应条件

pcr产物经dnpi酶切，加热使酶失活。将pgex-4t-mbp质粒采用noti酶线性化后，与同源片段1-ctb-同源片段2基因的pcr产物采用cloniionestepcloningkit试剂盒进行同源重组。重组产物立刻转化导入大肠杆菌stbl3中，涂布与lb琼脂(含1‰amp)上，于37℃培养16h后挑取单菌落，接种于5mllb肉汤(含1‰amp)于37℃，200r/min，培养16h后进行菌液pcr(采用mbp的上游引物，egfp的下游引物)，mbp-ctb-egfp基因片段的pcr产物琼脂糖电泳图如图5所示，1-3泳道为pcr成功的不同菌落的菌液；ctb-egfp基因片段的pcr产物琼脂糖电泳图如图6所示，1-4泳道为不同单菌落的菌液。之后将pcr成功的几组菌液进行测序，比对测序结果，将成功重组的组别再次转接到lb肉汤(含1‰amp)中，于37℃，200r/min，培养16h后提取质粒，获得重组质粒pex-4t-mbp-ctb-egfp。

实施例3重组蛋白在大肠杆菌中表达

(1)获得工程菌

将实施例2中获得的重组质粒pex-4t-mbp-ctb-egfp转化到大肠杆菌bl21中，涂布与lb琼脂(含1‰amp)上，于37℃培养16h后挑取单菌落，接种于5mllb肉汤(含1‰amp)于37℃，200r/min，培养16h，获得工程菌。

(2)诱导

将1中获得的工程菌按照1∶100接入300ml的lb肉汤(含1‰amp)中，于37℃，200r/min，培养至od600为0.6-1.0(约3h)时，加入iptg(终浓度为0.1mmol/l)，立即放置于16℃，200r/min，培养16-24h。4000r/min，20min，室温离心收集菌体，称重。

(3)酶解结合超声破碎

按照菌体湿重：酶解液(含0.2mg/ml溶菌酶，20μg/mldnase，1mmmgcl2，1mmpmsf)为1：30的比例加入酶解液，吹打使菌体悬浮，然后置于4℃裂解30min；在冰浴，超声2s、间歇5s条件下，用超声破碎机将裂解液超声5min，至液体颜色均一、无粘稠团聚物质。20000×g，20min离心，收集上清，用0.45μm滤膜过滤。

(4)ni-nta亲和柱纯化蛋白

(4.1)取适量的ni-nta树脂到柱中。存储缓冲液通过重力流出。

(4.2)将蛋白提取物与binding/washbuffer混匀，使总体积相当于两个柱体积。

(4.3)用两倍柱体积的binding/washbuffer平衡柱子。使用0.5～1ml/min流速，使缓冲液排出树脂。

(4.4)将蛋白提取物与binding/washbuffer混匀，加入柱子。收集流穿液到离心管中。如有需要样品可再次上样，重新流通一次。

(4.5)用两倍柱体积的binding/washbuffer清洗柱子并收集流穿液。使用一个新的收集管重复这个步骤，直到流穿液的吸光度280nm接近基线。

(4.6)用两倍柱体积的elutionbuffer洗脱柱上的组氨酸标签蛋白。此步骤重复两次，每次的洗脱液分别保存。

(4.7)在4℃下，将洗脱液放置于pbs缓冲液中透析24h，中间更换3次pbs缓冲液。

(4.8)用bca试剂盒测定蛋白含量，再进行sds-page，sds-page电泳图如图7所示。上样量为10μl，1泳道样品稀释1000倍，2号泳道样品稀释50倍。

实施例4目的蛋白(mctb-egfp)穿细胞膜活性鉴定

取对数生长期的hek293t细胞消化后，以每孔0.5ml接种于24孔板，培养1d后，直接加入过0.22μm滤膜的目的蛋白，终浓度为4μmol/l，作用5h后，用无菌pbs洗涤3次，直接用荧光显微镜观察细胞。同时利用转染的方法将目的蛋白的基因转染hek293t细胞内，同时作用5h，作为对照。荧光显微镜观察的细胞图如图8所示。

实施例5mctb与过敏原蛋白融合表达促进食物过敏动物模型构建成功

将甲壳类水产品主要过敏原——原肌球蛋白(tropomyosin，tm)替换egfp，获得mctb-tm融合蛋白，利用mctb的黏膜佐剂效果，在balb/c小鼠模型中，促进小鼠肠道黏膜部位tm的吸收率，增加过敏原的免疫原性及致敏性，从而提高食物致敏口服致敏小鼠模型的成功率，并降低过敏原的剂量。mctb-tm蛋白的sds-page的电泳图如图9所示，上样量为10μl，1泳道样品稀释100倍，2号泳道样品稀释50倍。

而食物过敏口服致敏balb/c小鼠血清中tm特异性免疫球蛋白e(sige)如图10所示，pbs组为空白对照组，mctb-tm即融合蛋白致敏组，ctb+tm(l)为与mctb-tm等剂量的市售ctb与虾中提取的tm简单混合致敏组，ctb+tm(h)为与mctb-tm4倍剂量的市售ctb与虾中提取的tm简单混合致敏组。如图所示，mctb-tm融合蛋白有效地提高了小鼠的致敏效果，显著降低了过敏原的使用剂量，大大缩短了构建食物过敏动物模型的前期工作量。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。

序列表

<110>浙江工商大学

<120>一种用于蛋白质转导的蛋白质载体及其制备方法和应用

<130>2018.7.2

<160>13

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>772

<212>prt

<213>人工合成()

<400>1

metlysileglugluglylysleuvaliletrpileasnglyasplys

151015

glytyrasnglyleualagluvalglylyslyspheglulysaspthr

202530

glyilelysvalthrvalgluhisproasplysleugluglulysphe

354045

proglnvalalaalathrglyaspglyproaspileilephetrpala

505560

hisaspargpheglyglytyralaglnserglyleuleualagluile

65707580

thrproasplysalapheglnasplysleutyrprophethrtrpasp

859095

alavalargtyrasnglylysleuilealatyrproilealavalglu

100105110

alaleuserleuiletyrasnlysaspleuleuproasnproprolys

115120125

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