鹿茸菇多糖提取物及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种鹿茸菇多糖提取物及其制备方法与应用。(二)
背景技术：
：鹿茸菇又称荷叶离褶伞(lyophyllumdecastes.)，隶属于担子菌纲、伞菌目、口蘑科，离褶伞属，是食药兼用的大型野生优良真菌，含有丰富的营养物质，以鲜食为主，菌肉肥厚细腻、清香扑鼻，口感脆滑、味道鲜美，且干制后营养和口感不变，在欧洲被称为“friedchickenmushroom”。研究表明鹿茸菇子实体中粗蛋白、氨基酸含量较高，脂肪含量低，而且还含有对人体有益的微量元素锌、硒和铜以及大量的维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素b12和烟酸，具有很高的营养价值。同时，它的子实体可以作为一种传统的药物，其主要成分为鹿茸菇多糖，且已有研究证明从荷叶离褶伞子实体中分离得到的多糖具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖血脂作用，保健效果明显。目前，提取多糖的常用方法有热水浸提、超声波辅助提取、复合酶提取等。传统方法热水浸提法虽然操作简单但时间过长；超声波辅助提取缩短了提取时间，然而还需数小时；复合酶提取条件温和、杂质易除，但酶本身容易失活且成本较高。高速剪切技术作为近年来发展起来的一种均质化技术，已广泛用于天然产物提取、分离和改性方面，主要通过负压、剪切、高速碰撞等各种外力作用使原料中有效成分迅速扩散到溶剂中，在短时间内达到溶解平衡。李丽(李丽,刘晔玮,赵剑喜,等.高速剪切技术破碎油菜蜂花粉细胞壁工艺[j].食品科学,2012,33(12):97-101)等利用高速剪切技术破碎油菜蜂花粉细胞壁，使花粉破壁率达到99％以上。多糖的生物功能取决于其复杂和多样的结构性质，如单糖组成、分子量、支链度等，均能影响多糖的生物活性功能，使其具有抗肿瘤和免疫调节等多种不同的重要的生理功能；具有作为重要的活性成分应用于保健食品或药品中的潜力，因而也吸引了越来越多的食品和医药领域的专家学者的关注。大量的研究证明菌物的子实体、菌丝体多糖的降脂降糖、抗氧化、抗癌的生物活性非常明显，且已经有大量的菌物资源被用作药物服务于临床，菌物资源的开发利用逐渐成为药物研究的一个新热点。该菌凭借着安全、天然、无毒副作用的优点越来越引起关注，在国内外深受消费者青睐，有着广阔的开发前景。鹿茸菇多糖是鹿茸菇中非常重要的活性成分之一，与其表现出的免疫调节、护肝、抗肿瘤、抗氧化等重要的生理功能密切相关。现有关于鹿茸菇的多种生物活性已被报道与其多糖组分相关，已有研究证明从鹿茸菇子实体中分离得到的多糖具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗氧化等一系列作用。贾宁(贾宁.荷叶离褶伞多糖对小鼠免疫功能影响和抗氧化作用研究[c].甘肃农业大学动物学院.vol15全国兽医病理学、动物病理生理学学术会议论文集，甘肃,2009,367.)用传统的水提醇沉法得到的鹿茸菇子实体多糖可以去除小鼠体内阴离子自由基，能增强小鼠的免疫能力，以改善抗氧化、抗衰老产品。(三)技术实现要素：本发明提供了一种鹿茸菇多糖提取物及其制备方法，该多糖提取物具有清除自由基的活性，可用于制备新型抗氧化剂。本发明的技术方案如下：一种鹿茸菇多糖提取物，按如下方法制备得到：(1)将鹿茸菇子实体干品粉碎后，按料液比1：3～6(优选1：4，g：ml)加到体积分数95％乙醇的水溶液中，浸泡8～16h(优选12h)，过滤，收集滤渣，自然晾干得到鹿茸菇脱脂粉末；所述鹿茸菇为离褶伞属，荷叶离褶伞(lyophyllumdecastes.)；(2)取步骤(1)所得鹿茸菇脱脂粉末加蒸馏水进行高速剪切提取，提取液离心(10000rpm，10min)弃去沉淀，收集上清液；所述高速剪切提取的条件参数为：料液比1：15～25(g：ml)、转速9500～14500rpm、提取时间1～4min；优选料液比1：25(g：ml)、转速11500rpm、提取时间1min；(3)将步骤(2)所得上清液浓缩至原体积的1/7～1/12(优选1/10)，得到鹿茸菇粗多糖浓缩液(记作lds)；(4)向步骤(3)所得鹿茸菇粗多糖浓缩液中加入体积分数95％乙醇的水溶液并使得乙醇终浓度达到30％～80％，静置8～16h(优选12h)，离心(10000rpm，10min)，所得沉淀去除残留乙醇后冷冻干燥，得到所述鹿茸菇多糖提取物；其中，所得沉淀去除残留乙醇的方法为：将沉淀加水复溶，减压蒸除溶剂以去除残留乙醇，重复操作至无明显乙醇气味即可。进一步，所述步骤(4)的操作方法为：向步骤(3)所得鹿茸菇粗多糖浓缩液中加入体积分数95％乙醇的水溶液并使得乙醇终浓度达到30％，静置12h，离心(10000rpm，10min)，分离得到一次沉淀和一次上清液；向一次上清液中加入体积分数95％乙醇的水溶液并使得乙醇终浓度达到60％，静置12h，离心(10000rpm，10min)，分离得到二次沉淀和二次上清液；向二次上清液中加入体积分数95％乙醇的水溶液并使得乙醇终浓度达到80％，静置12h，离心(10000rpm，10min)，分离收集三次沉淀；将所得一次沉淀、二次沉淀、三次沉淀分别加水复溶，减压蒸除溶剂以去除残留乙醇，重复操作至无明显乙醇气味，冷冻干燥，分别得到三种鹿茸菇多糖提取物，依次记为lds30、lds60、lds80。对本发明制得的鹿茸菇多糖提取物进行体外抗氧化试验，结果表明，按该方法提取所得鹿茸菇多糖提取物具有明显的抗氧化活性，可以有效清除abts自由基、dpph自由基，并且具有一定还原力，可应用于制备新型抗氧化剂。与已有的技术(热水浸提、超声波辅助提取、复合酶提取等)相比，本发明有益效果主要体现在：传统热水浸提法操作简单但时间过长；超声波辅助提取虽不像传统热水浸提法时间过长，但还需数几小时；复合酶提取法提取条件温和、杂质易除，但酶本身容易失活且成本较高；本发明方法高速剪切提取技术主要通过剪切、高速碰撞等各种外力作用使原料中有效成分迅速扩散到溶剂中，能在较短时间内达到溶解平衡，具有分离效率高、速率快、设备简单、无污染等优点，辅助水提醇沉，可以显著提高鹿茸菇多糖的得率；本发明方法制备的鹿茸菇多糖提取物抗氧化活性高，具有良好应用前景，且鹿茸菇凭借着安全、天然、无毒副作用的优点引起越来越多关注，在国内外深受消费者青睐。(四)附图说明图1：鹿茸菇多糖提取物制备工艺流程图；图2：实施例2中lds30、lds60、lds80组分的还原力曲线图；图3：实施例3中lds30、lds60、lds80组分的abts自由基清除率曲线图；图4：实施例4中lds30、lds60、lds80组分的dpph自由基清除率曲线图。(五)具体实施方式为更好的解释本发明的目的、制备方法，下面以具体实施例来对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。实施例1高速剪切提取鹿茸菇多糖称取干燥的鹿茸菇子实体干品，粉碎后经4倍95％乙醇浸泡过夜，次日，过滤收集滤渣，挥干试剂得鹿茸菇脱脂粉末，待用；以鹿茸菇多糖含量为指标，探究了高速剪切提取中不同料液比、转速、提取时间三个因素对鹿茸菇多糖含量的影响，结果如表2得所示；多糖含量(％)＝总糖含量(％)-还原糖含量(％)试验号料液比ml/g转速r/min时间min多糖提取率(％)1159500122.5321511500222.3431514500422.234209500223.1552011500422.8562014500122.977259500423.1682511500123.7192514500223.42由表1以鹿茸菇多糖含量为指标得出最优高速剪切提取鹿茸菇多糖的条件，即料液比为1:25ml/g，转速11500r/min，时间1min，在此条件下经过三次重复试验验证提取率分别为23.84、23.81、23.80，表明此优化方案可行；取鹿茸菇脱脂粉末100g，在最优条件下高速剪切提取，提取液以10000r/min速率离心10min，弃去沉淀收集上清液；将上清液旋转蒸发浓缩至体积为原体积的1/10，得鹿茸菇粗多糖浓缩液lds；向鹿茸菇粗多糖浓缩液lds中缓慢加入95％乙醇使乙醇浓度达到30％，静置过夜，10000r/min离心10min，分离沉淀i和上清液i；向上清液i中继续加入95％乙醇使i中乙醇浓度达到60％，静置过夜，同上离心10min，分离沉淀ii和上清液ii；再向上清液ii中继续加入95％乙醇使ii中乙醇浓度达到80％，静置过夜，同上离心10min，分离沉淀iii；将离心所得沉淀i、ii、iii分别加水复溶，旋蒸去除残留乙醇，重复操作至无明显乙醇气味，冷冻干燥可得三个组分的多糖粗提物，分别命名为lds30、lds60、lds80；实施例2鹿茸菇粗多糖lds30、lds60、lds80——还原力测定取实施例1所得鹿茸菇粗多糖lds30、lds60、lds80，将粗多糖lds30、lds60、lds80分别配成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/ml的水溶液，待用；取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/ml的lds30各1.0ml于试管中，加入1.0ml0.2mol/l的ph＝6.6的磷酸盐缓冲溶液和1.0ml1％的铁氰化钾溶液，漩涡振荡混匀，50℃保温反应20min，之后加入1.0ml10％的tca溶液，冷却后加入1.0ml0.1％fecl3溶液，反应10min，在700nm处测定吸光值ax。用等体积的蒸馏水代替lds30作空白对照，测吸光值a0，vc作为阳性对照；lds60，lds80同上操作。还原力公式如下：还原力＝ax－aoax：样品的吸光值；ao：空白对照组吸光值测定的结果如图2所示，组分lds30、lds60、lds80的还原力均具有浓度依赖性，且随着样品浓度上升而升高，还原力越大，表明其抗氧化能力就越强。实施例3鹿茸菇粗多糖lds30、lds60、lds80——abts自由基清除清除能力测定量取8.0ml7mmol/l的abts溶液与141μl140mmol/l的过硫酸钾溶液混合后于4℃下避光反应12-16h。用10mmol/lph＝7.4的磷酸盐缓冲液稀释储备液至od＝0.70±0.02备用；取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/ml的lds30各1.0ml于试管中，加入3.0mlabts自由基溶液，混匀后在30℃下避光反应5min，在734nm处测定吸光值ai；用1.0ml蒸馏水作空白对照，同条件下测得吸光值a0；用3.0ml蒸馏水代替abts自由基溶液作为样品对照组，测吸光值aj，vc作为阳性对照；lds60，lds80同上操作。abts自由基清除清除能力公式如下：ai：样品吸光值；aj：3.0ml蒸馏水代替abts自由基溶液测得吸光值；a0空白对照吸光值。测定的结果如图3所示，在一定浓度范围内，lds30、lds60、lds80的abts自由基清除能力均与其浓度呈正相关，表明鹿茸菇子实体粗多糖具有较好的abts自由基清除能力。实施例4鹿茸菇粗多糖lds30、lds60、lds80——dpph自由基清除清除能力测定取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/ml的lds30各2.0ml于试管中，分别加入1.0ml0.1mmol/l的dpph-无水乙醇溶液，充分混匀，密封在25℃条件下恒温避光反应1h，在517nm处测定吸光值ai；以2.0ml蒸馏水代替lds30作空白对照，同等条件下测吸光值a0；样品对照用1.0ml无水乙醇代替dpph-无水乙醇溶液，同等条件下测吸光值aj，vc作为阳性对照；lds60，lds80同上操作。dpph自由基清除清除能力公式如下：ai：样品吸光值；aj：1.0ml无水乙醇代替dpph-无水乙醇溶液测得吸光值；a0：空白对照吸光值测定的结果如图4所示，由图4表明组分lds30、lds60、lds80均具有抗氧化活性，且随着浓度的增大抗氧化活性增强。当前第1页12