一种检测人4号染色体STR基因座的引物组与检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及本发明属于基因检测领域，以多重荧光pcr技术结合毛细管电泳技术对人常染色体中4号染色体str基因座类型的检测试剂盒。

背景技术

人类4号染色体的三体在急性非淋巴细胞性白血病和淋巴细胞增生症中较常见，在自然流产胎儿中也有发现。在个体的研究中发现4号染色体与帕金森、视觉异常相关，此外4号染色体的三体可能与胎盘的发育相关。染色体异常的类型包括染色体数目异常和染色体结构异常。自然流产约占临床妊娠的10％～15％。染色体异常引起的自然流产中，约96％为数目异常，结构异常仅为3％～5％，其中就有的4号染色体三体情况。

短串联重复序列(shorttandemrepeat，str)是存在于人基因组中的一类具有长度多态性的dna序列，其核心序列一般由2～6个碱基构成，遵循孟德尔遗传规律。str基因座与所在染色体具有连锁关系，与染色体数量有对应关系。qf-pcr是基于荧光标记扩增技术和电泳技术对染色体上的str(短串联重复序列)进行检测，通过定性、定量分析str的多态性来诊断目标染色体数目，从而实现对str基因型分析的半自动化、批量检测，可实现快速、高通量诊断目标染色体数目异常，以遗传物质dna为检测对象，不需要进行细胞培养，因而是传统的细胞染色体核型分析技术的有效的补充。

目前，国内外的常见的str检测试剂盒中大多针对法医鉴定、亲子鉴定开发，选择的str位点基本在不同染色体上，针对单一染色体的str位点选择大多不超过4个(部分单独针对x或y染色体检测试剂盒除外)，涵盖了4号染色体的str位点的检测试剂盒较少，检测试剂盒中包含的4号染色体的str检测位点更少(大多只有1个str位点)，单独针对4号染色体的str检测试剂盒则尚未发现，例如qigen的investigatorhdplexkit和biotype的climera均只检测4号染色体中d4s2366位点，国内的北京基点认知技术有限公司的也只有d4s2366。而且国外试剂盒str基因座，不一定具备中国人群的多态性和特异性，国内的str检测试剂盒，4号染色体的str基因座和国外雷同且数量单一。

本发明基于这一情况，开发单独针对中国人群4号染色体的、适用于临床检测的str检测试剂盒，通过选择高多态性的str基因(5个str基因座位点)，以保证检测的准确性，利用质控品进行质量控制，最后采用毛细管电泳技术等实现半自动化和高通量检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种检测染色体非整倍体数目异常的扩增组合物以及试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种检测人4号染色体str基因型的引物组，所述引物组包含5个4号染色体str基因座，所述基因座为d4s2381、d4s2620、d4s2622、d4s3248、d4s3351，用于所述扩增基因座的引物分别为：

扩增d4s2381的引物：

正向引物：5′-gagggtaataactacttcattggat-3′，

反向引物：5′-ccacctacgaccaaagcatg-3′；

扩增d4s2620的引物：

正向引物：5′-atctttgggttcctcaagttgct-3′，

反向引物：5′-catggagaagggaaaagagga-3′；

扩增d4s2622的引物：

正向引物：5′-attcaggcaattaagtacatatgtg-3′，

反向引物：5′-cttccttgactctcatctttccat-3′；

扩增d4s3248的引物：

正向引物：5′-tgagaaaagttgatatatctgaattgt-3′，

反向引物：5′-gattaggggcagagtcaaaagtcac-3′；

扩增d4s3351的引物：

正向引物：5′-ttttctgtgtattttggctgctatc-3′，

反向引物：5′-gtgtgctgttattttgagtctgttc-3′。

优选地，各个所述基因座的两条引物中的一条引物的5’末端带有荧光标记物。

优选地，如seqidno：2、seqidno：3、seqidno：6、seqidno：7和seqidno：10所示的引物的5’末端带有fam荧光标记物。

fam荧光标记物的具体位置如下表：

本发明还提供一种包含如上述所述的引物组的检测人4号染色体str基因型的试剂盒。

优选地，所述检测人4号染色体str基因型的试剂盒中各引物组工作浓度和体积具体为：

优选地，所述检测人4号染色体str基因型的试剂盒还包括扩增预混液和pcr反应酶系。

优选地，所述扩增预混液包括pcr缓冲液、mg²⁺、dntps，其具体反应体积比例为20:10:1；扩增预混液为2.5倍工作液浓度。

优选地，所述检测人4号染色体str基因型的试剂盒还包括阴性和阳性质控品。

优选地，所述阴性质控品为正常倍型的人基因组dna；阳性质控品为非正常倍体的人基因组dna或任何已知染色体倍型的基因组dna。

优选地，为平衡检测结果准确性和成本关系，优选为采用1组阴性质控品，1组阳性质控品，其中阳性质控品具体为经染色体核型分析验证后的4三体等基因组dna。

本发明的另目的还提供一种如上述所述引物组在制备用于检测人4号染色体str基因型的试剂盒中的应用。

优选地，所述检测人4号染色体str基因型的试剂盒的反应体积为25μl，具体如下：22.5μlpcr反应液，0.5μlpcr反应酶系，2.0μldna模板(1～10ng)；多重扩增反应条件如下：37℃5分钟，95℃预变性5分钟，然后95℃30秒，58℃40秒，72℃50秒，共25个循环；最后72℃10分钟。

进一步地，为了提高pcr反应的准确性和特异性，本发明优选为采用dutp/udg防污染技术，具体通过以下方案实现：(1)pcr反应酶系，由热启动taq酶和尿嘧啶-dna糖基酶(udg)按20:1活性比配制而成；(2)在pcr反应液中加入dutp:datp:dttp:dctp:dgtp，摩尔比例为1:2:1:2:2(3)pcr扩增条件在最开始增加37℃保温5分钟使dutp/udg防污染体系发挥作用。

进一步地，为了保证检测结果准确性，本发明试剂盒提供最低检测范围，dna浓度可低至在0.1ng/μl～0.5ng/μl，最佳工作浓度建议2ng/μl。

进一步地，为了提高检测的速度和通量，优选为毛细管电泳技术进行pcr产物的检测分析，具体可以为ab3130xl、abi3500geneticanalyzer或其他遗传分析仪。

进一步地，为了检测结果的准确性，本发明提供一种对引物的质控步骤，即利用微量分光光度计对引物浓度进行定量分析和校准步骤，具体为：

a)合成引物在高速离心5分钟；

b)根据厂家标识的总nmol值选择加入te(ph8.0)溶液量，分2次梯度稀释，使其测定溶液，稀释倍数为1000；

c)吸取2μl“b)”中第二步稀释的溶液在微量分光光度计上测出其a260(使用微量分光光度计时，单链核酸值改为33)；

d)根据稀释物所需的终浓度选择相应的公式计算溶液总体积:

终浓度(100μm)公式为：

终浓度(200μm)公式为：

e)由“d”算的体积和已加入体积进行计算，确定需要补加入的te体积。

本发明对扩增组分的建立进行了以下优化：

1、热启动酶的选择

根据前期设计，采用启动酶和dutp/udg防污染技术保证检测的准确性，避免二聚体生成、pcr产物污染等。挑选了neb的热启动flexdna聚合酶、takara的taqhs启动酶、全式金的taqdnapolymerase、诺唯赞的acetaqhsdnapolymerase等热启动酶进行对比试验，考虑成本和效果，优选为takara的taqhs启动酶，其他企业的热启动酶也适用本试剂盒。

2、mg²⁺浓度的选择

选择1.0-5.0mm的浓度范围进行验证，根据结果优选采用4.0mm。

3、反应体积的选择

采用了50μl、25μl、20μl、10μl体积进行验证，根据结果优选采用25μl体系。

4、反应程序的优化

反应程序选择，退火温度55℃-62℃、扩增循环数28-32，经试验验证，优选扩增条件如下：37℃5分钟，95℃预变性5分钟，然后95℃30秒，58℃0秒，72℃50秒，共25个循环；最后72℃10分钟。

本发明的有益效果：

针对目前缺乏针对4号染色体的str基因座分析的检测试剂盒的现状，开发出针对具有中国人群多态性、特异性的的4号染色体str基因座。分析其染色体倍型的检测试剂盒。

检测半自动化、检测速度快、灵敏高、适用样本范围广。qf-pcr技术结合毛细管电泳检测技术，可以实现半自动化，提高检测效率；本检测方法同时适用于羊水、脐带血、绒毛、流产胚胎组织等多种样本类型。

检测试剂盒适用范围广：本发明的检测试剂盒适用于4号染色体数目异常引起的自然流产样本的分析，同时也可对产前诊断中4号染色体异常情况分析。

附图说明

图1是本发明阴性质控品的str基因座图谱。

图2是本发明阳性质控品的str基因座图谱。

图3是本发明实施例3中例1自然流产物(4号染色体三体)str基因座图谱。

图4是本发明实施例3中例2自然流产物(4号染色体三体)str基因座图谱。

图5是本发明实施例3中例3自然流产物(4号染色体三体)str基因座图谱。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步的详细描述。

具体实施方式

实施例1：优选符合汉族人群多态性的str基因座及其引物优化

本发明的试剂盒针对中国人群进行开发，通过如下具体实施步骤筛选获得具有中国汉族人群多态性的str位点并对其序列设计、优化引物：

1、str基因座初筛

选择中国知网以及ncbi等文献库中得到的4号染色体20个str基因座(d4s2430、d4s174、d4s3268、d4s421、d4s2381、d4s3332、d4s2620、d4s1563、d4s2622、d4s3248、d4s2366、d4s2362、d4s3359、d4s16、d4s3327、d4s98、d4s96、d4s3351、d4s3329、d4s2394)，在ncbi库中查找str基因座的核苷酸序列，利用ssrhunter软件进行序列分析，通过如下原则进行筛选获得备选str基因座：(1)str易于扩增、分析、稳定性好(2)同一染色体的str位点尽量分布在整条染色体(3)str重复单元为4bp以上，以减少或避免滑移情况；(4)str重复单元g/c在3个以内，以保证g/c量适中。

2、汉族人群str基因座的杂合度分析

初筛获得的str基因座d4s2620、d4s3351、d4s3329、d4s2394、d4s2381、d4s26221、d4s3248、d4s2620、d4s3251，通过50例正常汉族人群样本进行杂合度测试，筛选杂合度高的str序列，优选得到的str基因座杂合度(≥0.8，比其他文献报到的要求大于等于0.7的要求更严格)，由高到低依次为：d4s2381(0.91)、d4s26221(0.87)、d4s3248(0.84)、d4s2620(0.82)、d4s3251(0.81)。

3、扩增引物优化

根据杂合度，结合核心序列长度和检测范围等，在str位点上下游适合设计引物，调整str基因座的引物位置，剔除杂峰、滑移峰、双头峰等影响判读的峰型，对最终的引物组进行多重体系优化，达到各目标峰峰高一致，无明显杂带，从而确定引物和位点，str基因座d4s2381、d4s2620、d4s2622、d4s3248、d4s3351的引物的核苷酸序列，具体依次为seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10

实施例2：检测试剂盒的使用

制备包括下列组成成分的试剂盒：pcr组分，pcr混合液mix，1管(1100μl/管)；10×引物混合液，1管(30μl/管)；pcr反应酶系，1管(75μl/管)；经染色体核型分析确定的4三体阳性质控品，1管(20μl/管)；经染色体核型分析确定倍型正常的str阴性质控品，1管(20μl/管)。

1、标本采集、运送和保存

(1)标本采集：标本可为血液、羊水、绒毛组织、流产胚胎组织等。血液为常规取静脉血2ml或者胎儿脐带血0.5-1ml，edta抗凝处理；经穿刺获羊水2-5ml或者绒毛组织数条(100-500mg)。

(2)保存：标本可立即检测，4℃保存一周，-20±5℃保存期可达一年。

(3)运输：标本应在2～8℃条件下运送，运输时间不超过5天。

dna提取：建议使用dnaminikit提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作，收集到80-200μldna溶液，用紫外分光光度计定量，并稀释成1-10ng/μl，为了确保结果准确性，样本dna纯度要求为od260/280在1.6-2.0之间。

2、多重pcr扩增

本试剂盒提供的pcr组分包括2.5×pcr混合液、引物混合液、taqhs酶、灭菌水等，对于每个pcr反应体系，混合以下成分到总体积为25μl，涡旋混匀后并瞬时离心，以使液体聚集在管底。

pcr反应条件：37℃5分钟，95℃预变性5分钟，然后95℃30秒，58℃40秒，72℃50秒，共25个循环；最后72℃10分钟。

在一组实验中必须有一个4三体阳性质控品，一个str阴性质控品。

3、扩增产物电泳

(1)上样操作

每份检测取1μlpcr产物和13.5μl甲酰胺、0.5μlgenescantm600sizestandardv2.0(内标)混合。将混合物95℃加热变性5分钟。放置冰上至少1分钟，瞬时离心混合物。在abi3500dx基因分析仪上样进行毛细管电泳，具体操作参照abi3500dx基因分析仪用户手册进行。

(2)质控标准

a)genescan600sizestandardv2.0在abi3500dx电泳后显示36条均匀的橙色荧光峰，说明毛细管电泳成功。

b)21三体阳性质控品检测结果为21三体阳性；str阴性质控品检测结果为阴性。

以上标准(a)、(b)需要同时满足，否则需重新实验。

4、结果分析

对于每一个经电泳得到的数据都用abi公司软件进行数据收集和分析。分析软件的进一步信息请参阅analysissoftware用户手册。pcr产物中等位基因剂量通过相应位置的荧光峰面积比值间接反应出来，从而确定4号染色体的数目，参照acc/cmgs年会(2012)关于应用qf-pcr方法诊断非整倍体染色体病的实验指南，规定判断标准如下：如果str位点上等位基因扩增后显示为三个荧光峰，峰值面积比接近于1:1:1，可直接判断为三体型，若只显示为两个峰，则计算两个峰的峰面积比值(arearate，ar)，双峰面积比值＞1.8或者＜0.65则可判定为三体，正常双峰面积比值区间为：0.8～1.4，介于两个区间之间的值无法判断，需重新检测。

(1)正常结果判定：

至少有两个str位点为正常位点(表现为双峰，前后峰高比值在0.8-1.4之间，两峰分子量间隔超过24bp时，前后峰高比值在0.8-1.5之间)，其余为无效位点(单峰或双峰峰高比值在1.4-1.8之间)。如图1所示(阴性质控品)，所有str基因座均显示正常的峰图。

(2)4号染色体的非整倍体结果判定：

4号染色体上str位点，至少两个为异常位点(表现为三峰，且峰高比值0.8-1.4之间；或双峰，且峰高比值在0.45-0.65或1.8-2.4之间)，其余为无效位点(单峰，三峰或双峰峰高比值在1.4-1.8之间，双峰峰高比值小于0.45或大于2.4)。如图2所示(阳性质控品)，基因座d4s2622、d4s2620、d4s3248和d4s2381位点为三峰(三峰位点数量超过2个)，符合阳性结果。

实施例3：应用本试剂盒扩增对自然流产样本(4-三体)检测

采用流产组织样本，根据实施案例1方法进行盲法检测分析。结果显示：本试剂盒在48小时获得检测结果，其中检出3例4号染色体三体(例1、例2和例3)。其灵敏度和诊断准确性为100％；将qf-pcr联合毛细管电泳技术，实现高通量检测，效率更高；具体结果参见附图3，附图4，附图5所示：例1(附图3)中三峰的基因座有d4s3351、d4s3248和d4s2381位点，其余基因座的峰面积也近似1:2或2:1；例2(附图4)中三峰的基因座有d4s3248和d4s2381位点，其余基因座的峰面积也近似1:2或2:1；例3(附图5)中三峰的基因座有d4s2622、和d4s2620位点，其余基因座的峰面积也近似1:2或2:1。通过列举的上述样本检测结果说明，选择的4号染色体的基因座位点符合检测要求，能够准确地检测出4号染色体的三体情况。

实施例4：应用本试剂盒和检测4号染色体数目异常产品对比

本实施例查找市售的用于染色体数目异常的产品(基于qf-pcr或高通量测序技术的用于法医鉴定或亲子鉴定的str试剂盒虽可检测4号染色体的部分str位点，但因选择str位点较少其无法检测染色体数目异常情况，不属于同类型产品)与本发明试剂盒进行对比分析，具体为利用试剂盒1(本发明试剂盒)、市售试剂盒2(染色体微阵列分析试剂盒)、市售试剂盒3(高通量检测拷贝数变异试剂盒)进行样本检测。

具体为：收集临床上经核型鉴定的的4-三体的流产组织样本，提取其基因组dna，采用低(10ng)、高(250ng)的初始样本量进行对比检测，检测结果如下表。由下表可知，本发明试剂盒在低(10ng)检出4-三体，阳性符合率100％，相对应的试剂盒2和试剂盒3因样本量不足，无法检出；在高(250ng)样本量下，本试剂盒的检出和染色体微阵列分析、高通量测序技术检测出结果一致，符合率为100％。综上，本实施例说明本发明试剂盒在灵敏度、检测周期以及检测成本上明显具有优势，此外检出结果也完全和染色体微阵列分析技术、高通量测序技术(样本量足够条件下)一致。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

sequencelisting

<110>广州市达瑞生物技术股份有限公司

<120>4号染色体str基因型的引物组

<130>6.20

<160>10

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

gagggtaataactacttcattggat25

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<212>dna

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tgagaaaagttgatatatctgaattgt27

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