本发明涉及微生物
技术领域：
，具体涉及一种酿酒用酵母菌，其筛选方法，以及该酵母菌在蓝莓红酒发酵中的应用。
背景技术：
在红酒酿造的过程中，酵母菌起到了非常重要的作用。具体地，酵母菌的质量直接影响到红酒品质，因此需要加大对酵母菌的研究力度。糖类是红酒中含量最高的成分，酵母菌贯穿了红酒酿造的整个过程，在发酵作用下产生了大量的香味物质和酒精，这直接影响到红酒的品质。因此为了提高红酒的口感，需要对发酵菌株的形态以及筛选进行研究，促进红酒行业的可持续发展。但是，目前的酿酒用酵母菌主要是针对葡萄酒的，而对于其它植物原料，例如蓝莓，没有相适应的酵母菌用于红酒的发酵过程。鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种酿酒用酵母菌。本发明的第二目的在于提供该酵母菌的筛选方法。本发明的第三目的在于提供该酵母菌在蓝莓红酒发酵中的应用。为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明涉及一种酿酒用酵母菌，保藏号为cgmccno.15931。本发明还涉及该酿酒用酵母菌的筛选方法，包括以下步骤：(1)将蓝莓果汁在25～30℃发酵2～4天后，取发酵液用无菌水进行稀释，得到稀释液；(2)将所述稀释液涂布于孟加拉红培养基中，在25～30℃培养2～4天后，随机选取具有典型酵母菌落特征的单菌落，分离纯化2～3次，得到分离的酵母菌菌株；(3)将分离的酵母菌株进行产气性能分析、发酵速度分析、菌种凝聚性分析和碳源利用分析，筛选出所述酿酒用酵母菌株。优选地，步骤(1)中，所述蓝莓果汁通过将蓝莓果实清洗、挑选、榨汁后得到。优选地，所述榨汁过程中通入二氧化硫，二氧化硫在所述蓝莓果汁中的含量为30～70mg/l。优选地，所述步骤(1)中，发酵液与无菌水的体积比为1：(3～8)，优选1:5。优选地，所述步骤(1)和(2)中，发酵和培养温度均为28℃，时间均为3天。优选地，所述步骤(3)中，产气性能分析采用杜氏管发酵法，优选将分离的酵母菌株接入10ml内置杜氏小管的ypd培养基液中，接种量为20-40cfu，在28℃下发酵72h，测定酵母菌株产气量。优选地，所述步骤(3)中，发酵速度分析包括：将分离的酵母菌株接入蓝莓果汁中，在28℃培育24h后，在23℃下发酵6～8d，测定蓝莓果汁中的糖消耗量，并鉴定发酵过程中产生的香味。优选地，所述步骤(3)中，菌种凝聚性分析包括：(i)将分离的酵母菌株接入细胞培养瓶内，在28℃下放置48h，蒸馏水洗涤离心后去掉清液，得到湿酵母；(ii)将1g的湿酵母和ph为3～4的醋酸盐溶液12ml置于离心管中，然后将离心管在20℃下静置15～20min；(iii)摇晃离心管，使酵母菌在离心管内悬浮均匀，然后将悬浮液静置10min，观察到酵母菌发生沉淀，此时记录下酵母菌沉淀的毫升数。优选地，所述步骤(3)中，碳源利用分析包括：将分离的酵母菌株接入不同碳源培养基中，在28℃培育24h后测定碳源含量，确定能够利用的碳源。所述碳源培养基包括蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、乳糖、半乳糖、纤维二糖、柠檬糖、肌醇和可溶性淀粉培养基。本发明还涉及所述酵母菌在蓝莓红酒发酵中的应用。本发明的有益效果：本发明通过对酵母菌的形态、生理特征等方面进行研究，筛选出一种发酵能力强，同时发酵性能良好的酿酒用酵母菌。由该酵母菌发酵所得的蓝莓红酒品质优良，澄清透明，色泽橙红，具有典型的红酒风味。蓝莓水果生产为红酒产业开辟了良好的发展时机，发酵酒中含有大量的氨基酸、维生素、矿物质等营养成分，并含有一定的生理活性物质，主要具有舒筋活血、促进新陈代谢的作用，适合饮用。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。本发明实施例涉及一种酿酒酵母，保藏号为cgmccno.15931。该酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)名称为凯缘春5号，是从贵州省麻江地区的蓝莓表面分离得到的。该菌种已经保存到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间是2018年6月11日。本发明实施例还涉及该酿酒用酵母菌的筛选方法，包括以下步骤：(1)将蓝莓果汁在25～30℃发酵2～4天后，取发酵液用无菌水进行稀释，得到稀释液。在本发明的一个实施例中，蓝莓果汁通过将蓝莓果实清洗、挑选、榨汁后得到。榨汁过程中通入二氧化硫，二氧化硫在蓝莓果汁中的含量为30～70mg/l。本发明选用贵州麻江地区的蓝莓。在本发明的一个实施例中，发酵液与无菌水的体积比为1：(3～8)，优选1:5。稀释的作用是使培养液中的酵母菌含量适中，利于下一步的初筛培养。(2)将稀释液涂布于孟加拉红培养基中，在25～30℃培养2～4天后，随机选取具有典型酵母菌落特征的单菌落，分离纯化2～3次，得到分离的酵母菌菌株。孟加拉红培养基成分为：蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁(mgso4·7h2o)0.5g、琼脂20g、1/3000孟加拉红溶液100ml、蒸馏水1000ml、氯霉素0.1g。制备方法为：将上述各成分加入蒸馏水中溶解后，再加入孟加拉红溶液，分装后121℃灭菌15min。在本发明的一个实施例中，步骤(1)和(2)中，发酵和培养温度均为28℃，时间均为3天。步骤(1)和(2)合称为初筛，作用为在培养基中得到不同酵母菌产生的菌落，并对单一菌落中的菌种依次进行产气性能、发酵速度等测试分析，以筛选得到具有最佳性能的酵母菌。上述单菌落具有不同形态。其中，白色菌种菌落为圆形，局部有凸透镜状隆起，边缘完整，表面暗淡，不透明；奶油色菌种菌落为圆形，局部有凸透镜状隆起，边缘完整，表面光亮，透明；淡黄色菌种菌落为纺锤形，局部扁平状，边缘完整，表面光亮，透明。奶油色菌种菌落形状不规则，边缘呈现刺猬状，局部有凸透镜状隆起，表面暗淡，不透明。(3)将分离的酵母菌株进行产气性能分析、发酵速度分析、菌种凝聚性分析和碳源利用分析，筛选出酿酒用酵母菌株。在本发明的一个实施例中，步骤(3)中产气性能分析采用杜氏管发酵法，优选将分离的酵母菌株接入10ml内置杜氏小管的ypd培养基液中，接种量为20-40cfu，在28℃下发酵72h，测定酵母菌株产气量。其中，ypd培养基为酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基，用于酵母菌的培养。配方为：1％yeastextract(酵母膏)，2％peptone(蛋白胨)，2％dextrose(glucose)(葡萄糖)，若制固体培养基，再加入2％的琼脂粉。根据专业经验得知，如果杜氏管在72h内还没有被酵母菌及其产气充满，发酵度通常无法满足蓝莓红酒酿造的基本要求，因此相应的菌株可以舍弃，并将发酵较好的菌株进行再次对比筛选。在这一过程中发现凯缘春5号菌种的产气性能最强，说明其发酵效率和发酵度高。在本发明的一个实施例中，步骤(3)中发酵速度分析包括：将分离的酵母菌株接入蓝莓果汁中，在28℃培育24h后，在23℃下发酵6～8d，测定蓝莓果汁中的糖消耗量，并鉴定发酵过程中产生的香味。这一过程可筛选出优良、健壮的菌株，同时发现该菌株的产香能力强，适合用于蓝莓红酒的发酵过程。在本发明的一个实施例中，步骤(3)中菌种凝聚性分析包括：(i)将分离的酵母菌株接入细胞培养瓶内，在28℃下放置48h，可采用蒸馏水进行两次以上的离心洗涤，然后去掉清液，得到湿酵母；(ii)将1g的湿酵母和ph值为3～4的醋酸盐溶液(例如醋酸钠或醋酸钾的水溶液)12ml置于带有刻度的离心管中，然后将离心管在20℃下静置15～20min；(iii)摇晃离心管，使酵母菌在离心管内悬浮均匀，然后将悬浮液静置10min，观察到酵母菌发生沉淀，此时记录下酵母菌沉淀的毫升数，数目越大其分散性越好。在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，碳源利用分析包括：将分离的酵母菌株接入不同碳源培养基中，在28℃培育24h后测定碳源含量，以确定能够利用的碳源。碳源培养基包括蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、乳糖、半乳糖、纤维二糖、柠檬糖、肌醇和可溶性淀粉培养基。其中，碳源培养基液包括硫酸镁0.2克、磷酸二氢铵1克、磷酸氢二钾1克、碳源5克，上述物质溶于1000ml无菌水中。其中，镁离子是各类代谢中的辅助因子，磷酸二氢铵为氮源，磷酸氢二钾为缓冲剂，上述糖类为碳源。将酵母菌株接种于该培养基液中时，酵母菌可利用磷酸二氢铵作为唯一氮源，某种糖类作为唯一碳源，在培养基液中生长并产气。在实验鉴定中，申请人发现凯缘春5号菌种在蔗糖、麦芽糖、棉籽糖等碳源培养基中变得浑浊，说明凯缘春5号菌种可以很好的利用这些碳源。同时凯缘春5号菌种在乳糖、半乳糖、纤维二糖、柠檬糖、肌醇、可溶性淀粉等碳源培养基中不会浑浊，说明该菌株无法利用这些碳源。在糖发酵实验鉴定过程中，凯缘春5号菌种在葡糖糖、蔗糖、麦芽糖等培养基中有气泡产生，这足以说明凯缘春5号菌种可以利用这几种碳源。在其他生理学鉴定环节，申请人发现凯缘春5号菌种可以在浓度为50％的葡萄糖中生长，并具有很强的葡萄糖耐高浓度性能。在淀粉化合物中颜色不变，这表明了凯缘春5号菌种在缺乏维生素的环境下无法茁壮生长，这也说明了维生素不是凯缘春5号菌种的生长因子。申请人对于分离的酵母菌株还进行了感官评价的分析。具体为选择两个菌株，对其酒精度、糖度、感官评价等作出分析，发现这两株菌种长势良好，发酵性能极好。在感官评价的过程中主要对菌株的产酒能力、酒精度、产香能力等作出科学的评价。在此过程发现：凯缘春2号菌种和凯缘春5号菌种的发酵能力和产香能力较强，其产香能力和产酒能力都具有明显的优势，因此它们具有很好的利用价值。本发明还涉及酵母菌在蓝莓红酒发酵中的应用。发酵过程中酒精含量变化：在发酵过程中，蓝莓果汁中的总糖、乙醇、总酸含量都呈现出了不同的变化。进一步地，蓝莓果汁原汁中总糖含量为10.9％，无法满足红酒的成品要求。按照规定，成品中酒精度含量应为11.2％～12.0％。在向蓝莓果汁加入酵母菌后的发酵第4天，向其加入9.3％的糖，随之发现在发酵初期，酵母菌的活性越来越高，产酒能力增强。在发酵整个过程中随着总糖含量的下降，比如发酵的第10天，总糖仅为2.9g/l，这说明发酵过程已经完成。在实际生产中需要及时计算酵母中总酸的含量，在发酵中期，总酸含量逐渐上升，同时产生了酸、丙酮酸、乙酸乳等产物.到了发酵后期，多元酸变成一元酸，总酸含量下降，在此环节，ph值也随之下降，但是总体来说变化不大。发酵完成后，蓝莓原酒精体积分数已经达到了12.1％，其中ph值为2.98，总酸也达到7.95g/l，这些指标达到了发酵实验筛选以及蓝莓红酒生产的主要技术要求。发酵过程中单宁含量变化：在蓝莓果实中，花色苷和单宁是主要的营养成分。但是在发酵过程中，花色苷的含量下降了，其发展趋势呈现出了缓慢下滑的形态，这种变化在前提表现的不明显。直到发酵中期，花色苷含量的下降趋势逐渐平稳，此时发酵保存率为65％。花色苷与鲜果的存在环境有些相似，由于酵母菌的需氧量较大，同时发酵环节氧含量低，因此在酸度增加的情况下，酵母菌的生长速度受到了限制，产生了大量酒精，对氧含量的耗损很少，使得氧化作用逐渐增强。因此，本发明以蓝莓红酒为研究对象，将蓝莓的果实榨汁后，放在室内使其自然发酵，同时每天早晚各摇一次。将不同编号的酵母分别进行糖度调节，三次分离后在镜检中发现，这些菌落为纯种。对酵母的形态以及生理特征进行科学有效的分析与鉴定，凯缘春5号菌种的产气性能最强，发酵效率高，发酵度高。在发酵过程中，总糖、乙醇、总酸等都呈现出了不同的变化，酵母菌种感官评价分析，发酵中期，总酸含量逐渐上升，并产生了酸、丙酮酸、乙酸乳等产物，该菌株适合用于蓝莓红酒生产。实施例1采用凯缘春5号菌种生产蓝莓红酒，对比例1采用商业酵母生产蓝莓红酒。在其它发酵条件相同的情况下，成酒中的成分含量见表1。表1酒样编号残糖(g/l)酒精度(％)总酸(g/l)挥发酸(g/l)实施例12.112.17.950.38对比例12.910.55.770.45从表1可知，将本发明筛选得到的酵母菌用于蓝莓红酒的发酵过程，发酵结束后残糖含量更低，酒精度更高。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。当前第1页12