A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法和应用与流程

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种a或b亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法和应用。

背景技术

禽白血病（al）是由禽白血病病毒（alv）肉瘤病毒群病毒引起的禽类多种良性和恶性肿瘤性疾病，临床上多以免疫抑制、生长抑制和多器官组织出现肿瘤等为主要特征。根据宿主范围、囊膜蛋白抗原性和交叉中和反应等，将其分为ａ-ｋ共11个亚群，其中ａ-ｄ、ｊ和ｋ亚群为外源性alv。ｃ、ｄ亚群在野外很少见，ｅ-i亚群为内源性alv，而ｆ-ｉ亚群主要感染野生禽类。外源性alv中，a、b和j亚群对鸡有明显的致病性，对养禽业生产的危害也较大。由于我国地域广阔、养殖环境复杂、病毒不断变异，给alv的净化带来了极大的困难。

近几年在我国鸡群、尤其地方品系中又分离到了alv-a、alv-b。当前有针对alv-a/b的elisa抗体检测试剂盒，但只用于检测鸡群中alv-a/b的抗体水平，并不能判断鸡群中现在是否还有alv-a/b的感染。我国开展血清学监测通常使用美国等公司的elisa检测试剂盒，检测成本高、推广范围窄。根据国外毒株研制的检测方法和试剂盒不能够准确的检测到国内鸡群的感染状况，因此建立适用的alv-a/b检测体系对alv净化显的尤为重要。

alv-a/b囊膜糖蛋白中的表面蛋白gp85含有许多抗原表位，是制备区分病毒亚群的特异性抗体的首选蛋白。如何应用alv-a/b分离毒株的重组gp85蛋白进行原核表达并纯化得到纯度高可溶性好的gp85蛋白，是本发明要解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明就是针对上述存在的缺陷而提供一种a或b亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法，应用alv-a/b分离毒株的重组gp85蛋白进行原核表达并利用尿素法纯化得到的包涵体蛋白，通过透析复性得到了纯度高可溶性好的gp85蛋白。表达的蛋白可作为包被抗原建立抗体检测方法，还可用于免疫动物制备抗血清，为免疫荧光、免疫组化等提供原材料。同时，利用单克隆抗体技术制备抗蛋白的单克隆抗体，为今后对该病毒的临床诊断和抗原检测试剂盒的开发提供物质基础。

本发明的a或b亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白技术方案为，

一种a或b亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白纯化方法，包括以下步骤：

（1）设计扩增alv-a/bgp85基因的特异性引物；

（2）pcr扩增获得gp85基因片段并纯化；

（3）将alv-a/b的gp85基因分别克隆至pet-32a原核表达载体，筛选阳性克隆后测序鉴定；

（4）重组表达载体pet-32a-a/b-gp85的表达；

（5）尿素法纯化表达的gp85蛋白；

（6）重组gp85蛋白的复性。

步骤（1）中，

alv-a/b-f：5’-cgggatccgctgatgttcacttactcg-3’（加粗代表保护碱基，斜体为bamhⅰ酶切位点）

alv-a/b-r：5’-cccaagcttttatcgtttatgtcttacccctg-3’（加粗代表保护碱基，斜体为hindⅲ酶切位点，下划线为终止密码子）。

步骤（3）中，gp85基因片段及pet-32a空载体分别用bamhⅰ、hindⅲ快速内切酶进行双酶切，37℃温浴15min，纯化双酶切后的目的基因和载体片段，配置10μl连接体系，4℃反应过夜；连接产物转化e.colirosetta(de3)感受态，涂氨苄青霉素lb平板后，37℃温箱孵育过夜；挑取lb平板上单个的白色菌落，接种于5ml含amp的lb液体培养基中，37℃培养10h，提取质粒。

步骤（4）中，蛋白表达过程中表达条件：37℃，摇床转速为160rpm，终浓度为0.1mm的iptg，诱导5h。

步骤（5）中，用溶液1重悬菌体，超声波冰浴裂解，再依次通过溶液2、溶液3、溶液4洗涤，溶液5溶解包涵体，装入处理过的透析袋中，以tebuffer溶解的4m尿素溶液为初始透析液，通过逐渐稀释透析液的方法使透析袋中的尿素浓度依次降低，至袋中尿素浓度为零时收获复性蛋白；

溶液1：50mmol/ltris-hcl（ph=8.0），1mmol/ledta（ph=8.0），100mmol/lnacl；

溶液2：500mmol/ltris-cl（ph=8.0），100mmol/lnacl，1mmol/ledta，0.5%tritonx-100；

溶液3：溶液2含2m尿素；

溶液4：溶液2含4m尿素；

溶液5：溶液2含8m尿素。

所要表达的alv-a-gp85基因编码的核苷酸序列如seqidno：1所示：

igipspisegdfkgyvsdncttlgtdrlvssasitggpdnsttltyrkvsclllklnvsmwdeppelqllgsqslpnitditqisgvaggcvgfrpkgvpwylgwsqgeatrfllrhpsfsnltepftvvtadrhnlfmgseycgaygyrfweiyncsqegqqyrcgkarrprpqspetqctrqggiwvnrskeinetepfsftvnctasnlgnasgccgkagtilpgiwvdstqgnftkpkalppgiflicgdrawqgipsrpvggpcylgkltmlapnhtdilkilanssqtgvrhkr；

alv-b-gp85基因编码的核苷酸序列如seqidno：2所示：

advhlleqpgnlwitwanrtgqtdfclstqsatspfqtcligipspisegdfkgyvsgnctalgthrlvssgihggpdnsttltyrkvsclllklnvslldepselqllgsqslpnitnitqipsvaggcigftpygspagvygwdrrqvthilltdpgsnpffnkasnsskpftvvtadrhnlfmgseycgaygyrfwemyncsqmrqnwsicmdvwgrglpeswctstggiwvnqskeinetepfsftanctgsnlgnvsgccgesitilppgawvdstqgsftkpkalppgiflicgdrawqgipsrpvggpcylgkltmlapnhtdilkilanssqtgvrhkr。

所述的纯化方法得到的a或b亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白。

所述的a或b亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白在检测a或b亚群禽白血病病毒上的应用。

所述的a或b亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白在制备a或b亚群禽白血病病毒抗体上的应用。

本发明的有益效果为：

（1）利用大肠杆菌为表达宿主菌，其结构简单，生长速度快，易于培养和发酵，有效降低了生产成本。表达量高且表达条件易于标准化适用于规模化生产。

（2）纯化试剂主要为不同浓度的尿素溶液，价格低廉，操作简单，纯化后的蛋白纯度高。

（3）gp85蛋白是病毒囊膜表面的主要抗原，表达的蛋白可作为包被抗原建立抗体检测方法，还可用于免疫动物制备抗血清，为免疫荧光、免疫组化等提供原材料。该发明提供的包涵体蛋白纯化及变复性方法为相关单位进行gp85蛋白的原核表达提供了方法。

（4）实验表明，本发明的方法可用于a/b亚群禽白血病病毒不同毒株gp85蛋白的表达和纯化。

附图说明：

图1所示为实施例1获得的a和b亚群禽白血病病毒gp85基因及重组质粒pet-32a-a-gp85和pet-32a-b-gp85双酶切鉴定的电泳图：图中，m为dl5000bpmarker，1为alv-agp85基因pcr扩增产物，2为重组质粒pet-32a-a-gp85双酶切鉴定获得的两条特异性条带，3为alv-bgp85基因pcr扩增产物，4为重组质粒pet-32a-b-gp85双酶切鉴定获得的两条特异性条带；

图2所示为尿素法纯化复性后的重组gp85蛋白sds-page电泳图：图中，m为蛋白质marker，1为alv-agp85蛋白，2为alv-bgp85蛋白；

图3为纯化复性后重组gp85蛋白的westernblot鉴定结果：图中，m为彩色预染蛋白质marker，1为alv-agp85蛋白，2为alv-bgp85蛋白，分别以alv-a和alv-b感染鸡的临床阳性血清1:200倍稀释后作为一抗。

具体实施方式：

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。

实施例１

a或b亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法

1、实验材料

1.1质粒载体和工程菌

原核表达载体pet-32a、e.colirosetta(de3)表达菌

1.2试剂

2×pfupcrmastermix、dnamarkedl2000/dl5000、预染蛋白标准maker10-180kd为北京康润诚业生物科技有限公司（genstar）产品；bamhⅰ、hindⅲ快速内切酶为北京全式金生物技术有限公司产品（transgen）；hrp标记的羊抗鸡二抗为sigma产品；普通质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶dna回收试剂盒为omega产品；氨苄青霉素、磷酸盐药品、碳酸盐药品、无水乙醇、sds、甘油、尿素等试剂均为国产化学分析纯产品。

2、实验方法

2.1主要试剂配制

(1)lb培养基：称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g溶于800ml去离子水中，调节ph值为7.0左右后定容至1000ml。制备固体培养基时需加入琼脂使其终浓度为1.5%，高压灭菌后倒板。

(2)氨苄青霉素（amp）溶液：浓度100mg/ml，0.22μm虑膜过滤除菌，-20℃保存备用。

(3)pbs缓冲液：nacl8.0g，na2hpo4·12h2o3.58g，kh2po40.2g，kcl0.2g，待完全溶解后调液体ph为7.4，用蒸馏水定容至1000ml，高压灭菌后备用。

(4)24mg/mliptg：称取1.2giptg至50ml离心管中，加入40ml去离子水，待完全溶解后定容至50ml，0.22μm虑膜过滤除菌，小份分装，-20℃保存。

(5)溶液1：50mmol/ltris-hcl（ph=8.0），1mmol/ledta（ph=8.0），100mmol/lnacl

溶液2：500mmol/ltris-cl（ph=8.0），100mmol/lnacl，1mmol/ledta，0.5%tritonx-100

溶液3：溶液2含2m尿素

溶液4：溶液2含4m尿素

溶液5：溶液2含8m尿素

(6)初始透析液：1×te溶液含4m尿素，加入甘油，终浓度为10%。

2.2gp85基因的克隆

应用ncbi在线软件设计扩增alv-a/bgp85基因的特异性引物，在上游引物中添加bamhⅰ酶切位点，下游引物中添加hindⅲ酶切位点。引物序列为：

f:5’-cgggatccgctgatgttcacttactcg-3’，r:5’-cccaagcttttatcgtttatgtcttacccctg-3’。alv-asdau09c1毒株（由山东农业大学崔治中教授惠赠，该毒株是2009年3月份从国外引进的一群肉用型祖代鸡血浆中分离并鉴定的）和alv-bsdau09c2毒株（由山东农业大学崔治中教授惠赠，该毒株是2009年从山东地方品系芦花鸡的某鸡场鸡血浆中分离鉴定的）分别接种df-1细胞后培养7天，收获细胞提取rna后反转录为cdna作为模板，应用2×pfupcrmix进行pcr扩增，反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min20s，共30个循环，最后72℃延伸8min。用omega胶回收试剂盒纯化pcr扩增获得的目的基因片段，操作按试剂盒说明书进行。

2.3重组表达载体pet-32a-gp85的构建

胶回收后的gp85基因片段及pet-32a空载体分别用bamhⅰ、hindⅲ快速内切酶进行双酶切，37℃温浴15min，胶回收试剂盒纯化双酶切后的目的基因和载体片段，配置10μl连接体系，4℃反应过夜。连接产物转化e.colirosetta(de3)感受态，涂氨苄青霉素lb平板后，37℃温箱孵育过夜。挑取lb平板上单个的白色菌落，接种于5ml含amp的lb液体培养基中，37℃培养10h，按质粒小提试剂盒说明书操作提取质粒，用bamhⅰ、hindⅲ快速内切酶进行双酶切验证，阳性质粒送上海生工生物工程股份有限公司测序。

2.4gp85基因的原核表达

(1)测序后的阳性克隆用lb活化后冻存菌种。取10μl菌液接种含amp的5mllb培养基中，37℃摇床振荡培养过夜。次日，1:100重新接种于含amp的5mllb培养基中，37℃振荡培养约2h(菌液od600达0.6-0.8)，取1ml未诱导的菌液作为阴性对照，其余菌液加入iptg至终浓度1.0mmol/l，振荡培养4h。诱导后菌液3ml，10000r/min离心1min，弃上清，1mlpbs重悬沉淀，冰浴条件下超声波破碎菌体，200w/次，超声3s，间歇3s，超声5min。对破碎后的菌液10000r/min离心5min，将上清转移至另一ep管中，沉淀用1mlpbs重悬，各取上清和沉淀40μl加10μl的5×sds上样缓冲液，混匀后沸水浴中煮5min，10000r/min离心5min，取上清20μl进行12%sds-page电泳。未诱导菌液进行同样的处理，分析目的蛋白在菌体中的分布情况。

(2)优化表达条件：在iptg终浓度为1.0mmol/l，诱导时间为4h，诱导温度分别为25℃、30℃、37℃条件下表达，12%sds-page电泳分析蛋白表达情况后选择最适温度；在37℃，iptg终浓度为1.0mmol/l，诱导时间分别为3h、4h、5h和6h时，12%sds-page电泳分析蛋白表达情况后选择最适诱导时间；在37℃，诱导时间为5h，iptg终浓度分别为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0mmol/l时，12%sds-page电泳分析蛋白表达情况后选择最适iptg浓度；在37℃，iptg终浓度为0.1mmol/l，诱导5h，摇床转速分别为100、120、150、160、180、200rpm时，12%sds-page电泳分析蛋白表达情况选择最适摇床转速。

2.5gp85蛋白的纯化和复性

2.5.1gp85蛋白的纯化

(1)将pet-32a-a/b-gp85的表达宿主菌过夜培养物10ml加入1llb培养基中，置于37℃摇床中160rpm活化约3h（od600约为0.8左右），加入终浓度为0.1mm的iptg诱导4h。诱导后菌液10000rpm离心5min，弃上清。200mlpbs重悬洗涤，相同条件离心，弃上清。

(2)用80ml溶液1重悬菌体，400w超声4s停4s，超声20min左右至菌液不再粘稠。12，000rpm离心8min，弃上清。

(3)用150ml溶液2重悬沉淀，静置10min后，12000rpm离心6min后弃上清；用150ml溶液3重悬沉淀，静置15min后，4℃12000rpm离心8min后弃上清；用150ml溶液4重悬沉淀，静置20min后，4℃12000rpm离心10min后弃上清；按每100ml原始菌液加4ml溶液5计算，共加入40ml溶液5涡旋器震荡1h助溶。

(4)4℃12000rpm离心10min，取上清，即为溶解的包涵体蛋白。12%sds-page检测纯化后gp85蛋白的纯度。

(5)将纯化后的gp85蛋白经12%sds-page电泳后转印至pvdf膜上，分别以alv-a和alv-b感染鸡的临床阳性血清1:200倍稀释后为一抗，hrp标记的羊抗鸡igg1:2000倍稀释后为二抗，westernblot鉴定gp85蛋白的反应原性。

2.5.2包涵体的复性

12%sds-page检测后将纯化蛋白的浓度用溶液5稀释为1mg/ml装入处理好的透析袋中，放入1l初始透析液中，采用透析复性的方法使透析袋中的尿素浓度依次降低：4m-2m-1m-0.5m-0.25m-te，每次透析4h。透析过程中注意是否有白色絮状物析出，如果有大量沉淀析出则包涵体复性未成功，若无则表示成功。用12%sds-page检测复性后蛋白的纯度与浓度。复性好的蛋白经0.45µm滤器过滤后分装1ml/管保存于-80℃备用。

3、实验结果

3.1重组表达载体pet-32a-gp85的构建

构建的重组质粒命名为pet-32a-a/b-gp85，用ecori和noti双酶切后，产生约为5.9kb的载体骨架片段和1020bp的alv-agp85基因片段及1041bp的alv-bgp85基因片段及（图1）。重组质粒的测序结果表明，插入pet-32a质粒中的alv-a和alv-b的gp85基因片段大小分别为1020bp和1041bp，包括完整基因orf，含有六个组氨酸构成的his标签，终止密码子tta，分别编码340个氨基酸和347个氨基酸。

3.2gp85基因的原核表达

重组质粒小量表达后证明目的蛋白以包涵体的形式存在于超声破碎后的菌体沉淀中。通过实验优化了表达温度、表达时间、诱导剂浓度和摇床转速，结果表明，重组质粒的最佳表达条件为：37℃，诱导5h，iptg终浓度为0.1mmol/l，摇床转速为160rpm。

3.3gp85蛋白的纯化和复性

gp85蛋白以包涵体的形式表达，通过冰浴超声破碎后弃掉上清，将含目的蛋白的沉淀依次用溶液2、3、4洗涤去除包涵体以外的杂蛋白，最后用含8m尿素的溶液5将包涵体蛋白溶解。采用透析复性的方法使透析袋中的尿素浓度依次降低，获得复性后的高纯度可溶性蛋白（图2），westernblot结果表明纯化的alv-a和alv-bgp85蛋白有良好的反应原性（图3）。

以下的2种alv-a毒株同样能用该发明阐述的方法得到表达纯化后的gp85重组蛋白：

alv-asdau09e1株（genbank:hm452341）2008年从山东某培育品系鸡场的种蛋中分离得到

alv-asdau09c3株（genbank:hm452340）2009年从某养殖公司饲养的海兰褐蛋种鸡中分离得到

实施例2

用纯化复性后的alv-a/bgp85蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。

多克隆抗体的制备及效价检测

1.实验材料和方法

1.1实验材料

alv-asdau09c1株病毒，alv-bsdau09c2株病毒，白油marcol52，df-1细胞，fitc标记的羊抗兔二抗（sigma）。

1.2免疫原制备

纯化复性后的alv-a/bgp85蛋白分别与白油marcol52按照1:3的比例乳化。

1.3动物免疫

alv-a/bgp85蛋白分别用3只1.5kg左右的新西兰大白兔来制备多抗，采用背部皮下多点注射，共免疫3次，200μg/只，每次间隔两周。3免后第7天将实验兔全身麻醉后用促凝的真空采血管通过颈动脉采血，37℃放置1h后，4℃冰箱过夜分离血清。

1.4间接免疫荧光反应（ifa）测定抗血清效价

分别将24孔细胞培养板中感染了alv-asdau09c1株病毒和alv-bsdau09c2毒株的df-1细胞依次用1×pbs洗1遍，丙酮：乙醇（3:2）固定液固定7min，1×pbs洗3次。将制备的抗血清分别用1×pbs按1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1000六个稀释度加到固定好的df-1细胞上，100μl/孔，37℃孵育45min，1×pbs洗3次。再加1:100稀释的fitc标记的羊抗兔igg，100μl/孔，37℃孵育45min，1×pbs洗3次。每孔加1滴50%的甘油，在荧光显微镜下观察实验结果。

2.实验结果

蛋白与白油混匀后呈乳白色乳剂，为油包水型。移液器吸取少量乳化后抗原滴于冷水中，除第1滴外，均不扩散。共收集alv-agp85蛋白的抗血清70ml，alv-bgp85蛋白的抗血清75ml。

alv-agp85蛋白抗血清的ifa效价为1:400，alv-bgp85蛋白抗血清的ifa效价为1:800。

序列表

<110>山东省滨州畜牧兽医研究院

<120>a或b亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法和应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>300

<212>prt

<213>alv-a-gp85

<400>1

ileglyileproserproilesergluglyaspphelysglytyrval

151015

seraspasncysthrthrleuglythraspargleuvalserserala

202530

serilethrglyglyproaspasnserthrthrleuthrtyrarglys

354045

valsercysleuleuleulysleuasnvalsermettrpaspglupro

505560

progluleuglnleuleuglyserglnserleuproasnilethrasp

65707580

ilethrglnileserglyvalalaglyglycysvalglypheargpro

859095

lysglyvalprotrptyrleuglytrpserglnglyglualathrarg

100105110

pheleuleuarghisproserpheserasnleuthrgluprophethr

115120125

valvalthralaasparghisasnleuphemetglyserglutyrcys

130135140

glyalatyrglytyrargphetrpgluiletyrasncysserglnglu

145150155160

glyglnglntyrargcysglylysalaargargproargproglnser

165170175

progluthrglncysthrargglnglyglyiletrpvalasnargser

180185190

lysgluileasngluthrglupropheserphethrvalasncysthr

195200205

alaserasnleuglyasnalaserglycyscysglylysalaglythr

210215220

ileleuproglyiletrpvalaspserthrglnglyasnphethrlys

225230235240

prolysalaleuproproglyilepheleuilecysglyaspargala

245250255

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260265270

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275280285

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序列表

<110>山东省滨州畜牧兽医研究院

<120>a或b亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法和应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>300

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<213>alv-a-gp85

<400>1

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