本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时检测三种病原菌的三重pcr检测用引物、探针、试剂盒及检测方法。
背景技术：
化脓隐秘杆菌(arcanobacteriumpyogenes)是革兰氏阳性短棒状杆菌，主要引起动物如牛、羊、猪和人多种器官的化脓性感染，如肺炎、关节炎、心内膜炎、乳房炎、脓肿、骨髓炎及子宫炎等。溶血性曼氏杆菌是一种革兰氏阴性球菌，是反刍动物最重要的呼吸道病原体之一，可引起反刍动物和野生动物流行性肺炎。肺炎链球菌为革兰氏阳性球菌，可引起多种感染的重要病原体，其在机体上呼吸道定植，在世界范围内引起一系列致命性感染，如肺炎、中耳炎、菌血症等。不同来源的化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌携带的毒力差异较大，准确、快速的检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌及其毒力基因对预防化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌病有重要的意义，也可为食源性化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的溯源和风险评估提供重要技术支持。
plo基因、icemh1基因和、pspc基因分别是化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的重要基因，溶血素是一种外毒素，能够溶解多种动物红细胞、免疫细胞，引起动物的死亡。icemh1是可动遗传因子，通常整合到宿主的染色体dna中一个特殊的位点，在染色体复制和细胞分裂过程中被动地传播。icemh1也是抗菌素耐药性基因。pspc是一种表面蛋白，可刺激肺上皮细胞合成il-8，参与宿主免疫细胞的激活和趋化作用。pspc介导对上皮细胞糖肽、唾液酸残基的黏附，通过识别并聚合ig受体及分泌型iga结合，促进细菌的黏附和穿透作用。
传统的细菌分离鉴定的检测方法，须两次增菌培养后对可疑菌落进行生化鉴定，检测周期长达6～7d，无法满足大批量、快速检测的需求；也无法了解其携带的主要毒力基因的情况。本领域长久以来一直是采用传统的细菌生化鉴定和单重pcr(荧光pcr)方法进行化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的检测，耗时、操作繁琐、灵敏度低。且不能对化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌携带的毒力基因情况进行分析，无法法对于其进行毒力强弱的分析和流行病学溯源。无法满足对化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌风险监控的需求。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是针对化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌检测技术的不足，提供一种基于taqman探针的同时检测三种病原菌的三重pcr检测用引物、探针、试剂盒及检测方法。利用taqman探针具有分辨率高和特异性强的优点，建立化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌特异性强、灵敏度高和具良好稳定性的高通量检测方法，并同时可以检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌携带plo基因、icemh1基因pspc基因三个特异基因的情况。方便化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌菌株毒力的强弱及溯源分析。
本发明是通过以下技术方案来实现：
本发明针对化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌，通过对化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的携带毒力基因的针对性分析，选择三个特异性的毒力基因：plo基因、icemh1基因pspc基因，然后根据genbank上公布的化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌plo、icemh1和pspc基因序列采用dnastar进行比对，分析序列并在其保守区域采用primerexpress3.0设计引物和探针。建立三重实时荧光定量pcr检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的方法。
首先，本发明提供化脓隐秘杆菌plo基因、溶血性曼氏杆菌icemh1基因和肺炎链球菌pspc基因的实时荧光pcr检测用引物，其中：
化脓隐秘杆菌的plo基因的上、下游引物的dna序列分别如seqidno.1和seqidno.2所示；
溶血性曼氏杆菌的icemh1基因的上、下游引物的dna序列分别如seqidno.3和seqidno.4所示；
肺炎链球菌的pspc基因的上、下游引物的dna序列分别如seqidno.5和seqidno.6所示。
其次，本发明提供一种化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的taqman三重实时荧光pcr检测用探针，其中：
化脓隐秘杆菌的plo基因探针的dna序列如seqidno.7所示，且在该plo基因探针的5’端标记cy5荧光报告基团，3’端标记bhq1；
溶血性曼氏杆菌的icemh1基因探针的dna序列如seqidno.8所示，且在该icemh1基因探针的5’端标记vic荧光报告基团，3’端标记bhq1；
肺炎链球菌的pspc基因探针的dna序列如seqidno.9所示，且在该pspc基因探针的5’端标记fam荧光报告基团，3’端标记bhq1。
再次，本发明还提供一种化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的taqman三重实时荧光pcr检测用试剂盒，试剂盒中的反应体系总体积为25μl，包括：
premixextaqtm(2×)12.5μl；
plo引物、探针(10μm)各0.5μl；
icemh1引物、探针(10μm)各0.5μl；
pspc引物、探针(10μm)各0.5μl；
rox0.3μl；
去离子水5.7μl；dna模板为2μl；
其中，plo基因上游引物、plo基因下游引物和plo基因探针的dna序列分别如seqidno.1、seqidno.2和seqidno.7所示；
iicemh1基因上游引物、iicemh1基因下游引物和iicemh1基因探针的dna序列分别如seqidno.3、seqidno.4和seqidno.8所示；
pspc基因上游引物、pspc基因下游引物和pspc基因探针的dna序列分别如seqidno.5、seqidno.6和seqidno.9所示
最后，本发明还提供一种化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的taqman三重实时荧光定量pcr检测方法，包括以下步骤：
s1.吸取37℃过夜培养菌液1ml置2ml离心管离心去培养基后，用1ml去离子水漂洗，12000r/min离心2min去上清，重复2次。按试剂盒说明提取dna备用。
s2.采用本发明设计的引物和探针和检测方法进行实时荧光pcr检测。
s3.采用本发明建立的方法对化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌进行定量检测。
优选地，s1提取dna具体方法为：菌株用脑心浸萃液增菌培养24h后，取1ml菌液12000r/min离心去上清，采用商品化细菌基因组dna提取试剂盒提取dna作为反应的模板。
优选地，s2中所述三重实时荧光pcr检测反应体系为25μl：plo、icemh1、pspc引物探针(10μm)分别为0.5μl，rox0.3μl，去离子水5.7.μldna模板为2μl。反应条件：stage1：预变性95℃30s；stage2：95℃5s，60℃34s，40个循环，并于fam、vic，cy5三个通道收集荧光信号；扩增反应在abi7500fast荧光定量pcr仪上进行。
优选地，s2中所述三重实时荧光pcr检测的反应程序为：stage1：预变性95℃30s；stage2：95℃5s，60℃34s，40个循环，并于cy5、vic，fam三个通道收集荧光信号；化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌定性结果：待测基因出现扩增曲线，且ct值<36，则判断为阳性，如果36<ct<40，判断为可疑，可加大模板量重复实验，如果有典型扩增曲线，判为阳性，否则为阴性，无ct值或ct等于40为阴性。
优选地，s3中所述化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌定量检测方法为：
采用本发明所述菌种扩增的plo、icemh1和pspc基因片段序列，克隆于puc57(ecorv,ampr抗性)并构建a.p-m.h1-s.p质粒，采用1.25×106、1.25×105、1.25×104、1.25×103、250、50、和10copies/μl7个质粒dna稀释度并按s2进行三重实时荧光定量pcr扩增，以y轴为ct值，x轴为log10(cfu)分别绘制plo、icemh1和pspc基因标准曲线，根据三条标准曲线的公式代入待测样品扩增得到的ct值，即可计算出样品中化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的含量。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明利用taqman探针技术建立的化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌三重实时荧光pcr快速检测方法，5′采用不同的荧光报告基团标记，信号之间互不干扰，提高了探针结合的严谨度，最高可识别一个碱基的差异，增加了检测的分辨率。同时，taqman探针的淬灭基团是一种非荧光的淬灭基团，本身不会产生荧光，降低了实时荧光pcr应反的荧光本底信号的强度，进一步提高了其敏感性。同一样本采用三对引物，分别扩增不同的靶基因片段，同时检测plo、icemh1和pspc三个基因，提高效率，节省时间，降低检测成本。不但可以对化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌进行快速检测，还可对化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌株基因plo、icemh1和pspc的携带情况进行检测，提供分析化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌毒力强弱的参考依据，也可为化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌聚类分型和流行病学溯源提供方便，对控制化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌引发疾病的传播及化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌病的治疗有重要意义，适用于大量样本的化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌毒力基因携带情况的快速检测及流行病学调查。
本发明所使用taqman探针进行荧光定量pcr检测，其优越性表现在：
1操作简便，通过扩增曲线可直观的进行定性判定，无须电泳等后续步骤，通过荧光信号的积累实现对整个pcr过程进行监测，然后通过扩增曲线或ct值来对未知模板进行定性或定量的分析，可以很好地满足化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的快速检测和鉴定及三个毒力基因的携带情况分析；
2.快速、高通量：本发明定量下限可以检测到20拷贝的标准品阳性质粒，整个扩增过程在45分钟以内，一次可检测三个毒力基因，节约检测成本，可进行高通量的检测；
3.本发明获得的三个毒力基因的标准曲线，可实现化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的定量检测。
附图说明
图1是taqman三重实时荧光pcr检测的特异性结果示意图。
图2是taqman三重实时荧光pcr检测的灵敏度结果示意图。
图3是taqman三重实时荧光pcr检测的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。除非特别说明，下述实施例中使用的生物材料、试剂原料为常规市购或商业途径获得的生物材料和试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。
1、建立化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌三重实时荧光pcr检测体系
1.1设计引物和探针
通过对化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的携带毒力基因的针对性分析，选择三个重要的毒力基因：plo、icemh1和pspc，然后根据genbank上公布的化脓隐秘杆菌plo基因、溶血性曼氏杆菌icemh1基因和肺炎链球菌pspc基因序列，用dnastar进行比对，分析序列并在其保守区域采用primerexpress3.0设计引物和探针，引物的序列为：
seqidno.1：plo-f：5’-ttgacggacggcttgtca-3’。
seqidno.2：plo-r：5’-gcgccgacttaaggtcaact-3’。
seqidno.3：icemh-f：5’-ccacgccaaccgatgaa-3’。
seqidno.4：icemh-r：5’-agagtgccggcatagcctaa-3’。
seqidno.5：pspc-f：5’-gaagaagactatgctcgtagatcagaag-3’。
seqidno.6：pspc-r：5’-ggagtagatggttgtgctggttt-3’。
taqman探针的序列为：
seqidno.7：
plo-probe：5’-cy5-cgagcctccatctccccgacg–bhq1-3’
seqidno.8：
icemh-probe：5’-vic-agccaaaccgccaacagagcca-bhq1-3’
seqidno.9：
pspc-probe：
5’-fam-aatataatcgcttgactcaacagcaaccgc-bhq1-3’
需要说明的是，上述引物和探针采用本领域常规方法合成，本实施例应用的引物和探针均委托英潍捷基公司合成。
本发明实施例所述实时荧光pcr检测使用的仪器为荧光定量pcr仪abi7500。
1.2基于上述引物、探针和体系等条件，提供一种化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的三重实时荧光定量pcr检测方法，包括以下步骤：
s1.提取dna作为反应的模板；
提取dna具体方法为：菌株用脑心浸萃液增菌培养24h后，取1ml菌液12000r/min离心去上清，采用商品化细菌基因组dna提取试剂盒提取dna作为反应的模板
s2.采用所述引物和探针进行taqman三重实时荧光定量pcr检测。
所述三重实时荧光pcr检测反应体系为：25μl：premixextaqtm(2×)12.5μl、plo、icemh1、pspc引物、探针(10μm)分别为0.5μl，rox0.3μl，去离子水5.7μldna模板为2μl。
所述三重实时荧光pcr检测的反应程序为stage1：预变性95℃30s；stage2：95℃5s，60℃34s，40个循环；并于fam、vic，cy5三个通道收集荧光信号。
2、特异性、灵敏度试验、标准曲线建立和重复性试验
2.1检测特异性分析
采用大量菌株，分别用本发明建立的检测方法进行taqman三重实时荧光pcr扩增，观察实验菌株有典型扩增曲线产生。表1中列举了部分本实验采用的菌株。
表1实验用部分菌株列表
实验发现，有且只有化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌有指数扩增，其他菌均无典型扩增曲线产生，表明本发明建立的针对化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌毒力基因plo、icemh1、pspc检测的taqman三重实时荧光pcr方法特异性良好，如图1所示。图1中，1为肺炎链球菌；2为化脓隐秘杆菌；3为溶血性曼氏杆菌；4-17分别为鼠伤寒沙门氏菌、非01霍乱弧菌(vb0)、单增李斯特氏菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单孢菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、铜绿假单胞杆菌、大肠埃希氏菌、英诺克李斯特菌、伊氏李斯特菌和巴氏杆菌。
2.2检测灵敏度分析
化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌扩增的序列克隆于puc57(ecorv,ampr抗性)载体中构建的a.p-m.h1-s.p重组质粒dna加双蒸水稀释成1.25×106、1.25×105、1.25×104、1.25×103、250、50和10copies/μl，提取dna进行三重实时荧光pcr检测。
本发明最低检测定量下限可以检测到20拷贝的标准品阳性质粒，扩增结果如图2所示。图2中，1～7分别为：1.25×106、1.25×105、1.25×104、1.25×103、250、50和10copies/μl的化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌。
2.3化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌多重实时荧光定量pcr扩增的标准曲线建立
采用本发明建立的taqman三重实时荧光pcr检测方法，采用1.25×106、1.25×105、1.25×104、1.25×103、250、50和10copies/μl7个浓度的化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌质粒dna进行三重实时荧光定量pcr实验，分别绘制plo、icemh1和pspc标准曲线，得到标准曲线的方程分别为：
m.h.:y＝3.5009x+40.844；
s.p:y＝3.3914x+40.418；
a.p:y＝3.4769x+40.746；
(m.h为溶血性曼氏杆菌，s.p为肺炎链球菌，a.p为化脓隐秘杆菌)
标准曲线的相关系数分别为0.99、0.99和0.99，扩增效率分别为94％、93％和97％，表明检测体系的三个基因扩增效率和线性相关系数良好，可以满足三重实时荧光定量pcr检测的要求，结果如图3所示。2.4三重实时荧光定量pcr可重复性试验
将化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌扩增的序列克隆于puc57(ecorv,ampr抗性)载体中所构建a.p-m.h1-s.p重组质粒，提取模板dna稀释成1.25×106、1.25×105、1.25×104、1.25×103、250、50和10copies/μl的7个浓度，进行三重实时荧光pcr检测，每个稀释度做3个平行，结果表明三种毒力基因的ct值变异系数均在2％以下，说明本文建立的三重实时荧光pcr检测方法重复性好，稳定可靠。结果如表2所示：
表2taqman三重实时荧光pcr重复性试验结果
表2中：m.h为溶血性曼氏杆菌，s.p为肺炎链球菌，a.p为化脓隐秘杆菌。
2.5化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌定量检测
样品经实时荧光pcr得到的相应通道的ct值，根据plo、icemh1、pspc标准曲线方程：m.h.:y＝3.5009x+40.844、s.p:y＝3.3914x+40.418和a.p:y＝3.4769x+40.746；可以计算出化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球浓度菌落的对数值(log10(cfu))值，实现化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的定量检测。
综上所述，本发明根据化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的plo基因、icemh1基因和pspc基因序列设计特异性引物探针，建立了三重实时荧光pcr检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的方法，可快速检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌。适用于大量样本的化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌毒力基因分布情况的快速检测及流行病学调查，对控制化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌引发的疾病的传播和治疗有积极意义。
本发明优化了实时荧光pcr检测体系和的反应程序条件，成功建立了高通量的化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌taqman探针三重实时荧光定量pcr检测方法，操作简单、安全，以重组质粒a.p-m.h1-s.p为标准品建立的标准曲线在1.25×106～1.0×101copies/μl范围内具有良好的线性关系，定量下限可以检测到20拷贝的标准品阳性质粒。整个扩增过程在45min以内，具有更加高的灵敏度、特异性和稳定性，可以很好地满足养殖业中化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的快速检测和鉴定，并能快速、准确的测定样本中三种菌的含量，同时可以分析三种菌的三个毒力基因携带情况，可用于其流行病学溯源和毒力强弱分析。
序列表
<110>陕西省动物研究所
<120>一种同时检测三种病原菌的三重pcr检测用引物、探针、试剂盒及检测方法
<160>9
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
ttgacggacggcttgtca18
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gcgccgacttaaggtcaact20
<210>3
<211>17
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
ccacgccaaccgatgaa17
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
agagtgccggcatagcctaa20
<210>5
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
gaagaagactatgctcgtagatcagaag28
<210>6
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
ggagtagatggttgtgctggttt23
<210>7
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
cycgagcctccatctccccgacgbh25
<210>8
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
agccaaaccgccaacagagcca22
<210>9
<211>30
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>9
aatataatcgcttgactcaacagcaaccgc30