鉴别或辅助鉴别甘草的引物对及其应用的制作方法

本发明涉及鉴别或辅助鉴别甘草的引物对及其应用，该引物对可用于对待测甘草是否是新疆产甘草进行鉴别。

背景技术：

甘草为豆科甘草属药材，《中国药典》规定甘草药材植物来源为甘草、胀果甘草或光果甘草的干燥根和根茎。市场上甘草药材以甘草(又称乌拉尔甘草)来源为主，其产地多分布于新疆、甘肃、宁夏、内蒙古等省份。

目前在甘草种子市场上，不同产地甘草的种子价格差异显著，新疆产甘草的种子价格普遍比其他产地(包括内蒙、甘肃、吉林等省份)低近一半左右。这就导致在市场交易及流通过程中，新疆产甘草的种子经常混杂在其他产地的种子中进行销售。而从甘草种子的外观形态方面很难准确区分新疆产甘草。

分子标记技术如rapd(randomamplifiedpolymorphicdna，随机扩增多态性dna标记)、aflp(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，扩增片段长度多态性)、ssr(simplesequencerepeat，简单重复序列标记)等结果可重复性差、工作量大、成本高。

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)是指发生在染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的dna序列多态性。在漫长的进化过程中，生物体形成了自身特有的dna碱基序列，比较不同物种间或同一物种不同地方品种间的snp差异，可以了解物种间的亲缘关系和进化的生物信息学，从而对不同物种或同一物种不同地方的品种进行精细鉴定和分类。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，单个核苷酸多态性标记可帮助区分个体间遗传物质的差异。

技术实现要素：

本发明涉及一种基于单核苷酸多态性标记的鉴别或辅助鉴别新疆产甘草的方法，运用分子生物学的分子标记技术，对不同产地的甘草植物样本进行dna提取，pcr扩增，引物筛选及生物信息学分析，找到快速准确鉴别新疆产甘草的方法。

发明人通过大量阅读文献以及实地调研等方式确定甘草的主产区。甘草目前主要分布在新疆、甘肃、宁夏、陕西、内蒙古等地，野生与栽培均有资源分布。通过深入甘草主产区，与当地种植大户沟通，采集了大量正品的甘草野生与栽培样本。

通过对采集的样本进行dna提取，运用不同的序列引物进行pcr扩增，并测序，通过生物信息学分析比对序列，筛选的序列包括核基因序列its(internaltranscribedspacer，内转录间隔区)与its2(internaltranscribedspacer2)，叶绿体基因序列psba-trnh(主要是指psba与trna-hisintergenicspacerregion间隔区序列)、rbcl(ribulose1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenaselargesubunit)、matk(maturasek)。

运用mega软件进行序列比对与分析，找到可以稳定准确鉴别新疆产甘草的引物序列(在该序列某一位点或某几个位点，新疆产甘草与其它产地样本的碱基均不一样，且各自一致)。通过最终数据比对筛选，发现叶绿体基因组psba-trnh序列可以将新疆产甘草与其它产地甘草进行鉴别。经过序列比对分析，发现在psba-trnh序列中的270位点(psba-trnh序列为独立的序列，有其固定的组成部分，为psba、psba-trnhintergenicregion、trnh，虽然不同物种之间各组成部分的长度不同，但同一物种或其近缘种的psba-trnh序列的长度是基本一致的。而且通过mega软件进行序列比对后，每条序列的碱基均相对应，保证每条序列都是在270位点处产生碱基突变)，呈现规律性的突变碱基(singlenucleotidepolymorphisms，单核苷酸多态性，snp变异位点)。新疆产甘草在psba-trnh序列的270位点为t碱基，其它产地的甘草在psba-trnh序列的270位点为c碱基(如图1所示)。

基于此，本发明提供一种基于单核苷酸多态性标记的鉴别或辅助鉴别新疆产甘草的方法，其包括以下步骤：

1)提取待测甘草的dna；

2)通过测序，若叶绿体基因序列psba-trnh第270位点为t碱基，则该待测甘草是新疆产甘草，若叶绿体基因序列psba-trnh第270位点为c碱基，则该待测甘草是其它产地甘草。

在本发明优选的实施方式中，可以加入引物对进行pcr扩增，获得扩增产物，然后对扩增产物进行测序。优选的是，应用psba-trnh序列的fwdpa/revth引物(fwdpa/revth引物对)对模板进行pcr扩增。

在本发明优选的实施方式中，可以加入引物对进行pcr扩增，获得扩增产物，然后对扩增产物进行电泳检测。优选的是，扩增产物为约200bp的dna片段。

本发明涉及用于鉴别或辅助鉴别新疆产甘草的引物对，其可以选自：引物对1、引物对2和引物对3，其中，引物对1的序列如seqidno:1和seqidno:2所示，引物对2的序列如seqidno:3和seqidno:4所示，引物对3的序列如seqidno:5和seqidno:6所示。

本发明涉及一种用于鉴别或辅助鉴别新疆产甘草的方法，其包括以下步骤：

1)提取待测甘草的dna作为模板；

2)采用至少一种引物对作为pcr扩增引物，进行pcr扩增，获得扩增产物；

3)检测扩增产物。

进一步地，所述检测为分子水平的检测。如可以为杂交、基因芯片、pcr检测等。pcr检测简便易行，因此，优选为pcr检测。

在本发明优选的实施方式中，所述引物对选自：引物对1、引物对2和引物对3，其中，引物对1的序列如seqidno:1和seqidno:2所示，引物对2的序列如seqidno:3和seqidno:4所示，引物对3的序列如seqidno:5和seqidno:6所示。

在本发明优选的实施方式中，引物对1的pcr条件为：95℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

在本发明优选的实施方式中，引物对2的pcr条件为：95℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

在本发明优选的实施方式中，引物对3的pcr条件为：95℃预变性4min；94℃变性30s，48℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

在本发明优选的实施方式中，可以通过琼脂糖凝聚电泳来检测所述扩增产物，若电泳显示出现扩增条带，则表明该待测甘草是新疆产甘草。优选的是，所述的扩增条带的分子量是约200bp。

在本发明优选的实施方式中，可以在扩增后的反应体系中加入荧光染料，例如荧光染料sybrgreeni，若检测到所述含有荧光染料的体系产生绿色荧光，则表明该待测甘草是新疆产甘草。优选的是，含有荧光染料的体系是否产生绿色荧光是在365nm紫外波长下进行检测的。

本发明还提供了鉴别新疆产甘草或辅助鉴别新疆产甘草的pcr试剂，其可以含有至少一种上述的引物对，该pcr试剂可以用于检测待测甘草是否是新疆产甘草或是否含有新疆产甘草。

本发明还提供了鉴别新疆产甘草或辅助鉴别新疆产甘草的试剂盒，其可以含有至少一种上述的引物对或者至少一种上述的pcr试剂。该试剂盒为鉴定新疆产甘草提供了便利。

在本发明优选的实施方式中，该试剂盒中包括pcr反应缓冲液、dna聚合酶和dntp。

在本发明优选的实施方式中，该试剂盒中还可以含有荧光染料，例如荧光染料sybrgreeni。

附图说明

图1不同产地甘草psba-trnh序列snp变异位点的软件截图

图2引物对1鉴别不同产地甘草时的电泳检测图

图3引物对2鉴别不同产地甘草时的电泳检测图

图4引物对3鉴别不同产地甘草时的电泳检测图

本文中描述并要求保护的发明内容不限于本文中公开的以下具体实施方案的范围，这些实施方案仅旨在说明本发明的几个方面。

实施例1单核苷酸多态性标记的筛选

从新疆、甘肃、内蒙古、宁夏等地主产区采集标准的甘草野生与栽培样本共计302份，可以典型地代表当前各主产区的样本类型。

采集的甘草标准品的详细信息见下表1：

采集样本均为实地采集(附gps信息)

1.1总dna提取

将采集的各产地甘草样本使用硅胶进行干燥，待完全干燥后，使用小钢珠与球磨仪(德国fritsch，pulverisette6)将样本粉碎研磨。利用试剂盒法(ctab法，天根生化，dp305试剂盒)提取植物样本基因组总dna。具体步骤如下：

1)将研磨好的样本粉末迅速转移至2.0ml的ep管中，加入65℃预热的缓冲液gp1700μl，巯基乙醇1μl；将ep管盖子顶端用parafilm封口膜进行密封，上下颠倒混匀后，放入65℃水浴30min，在水浴过程中，不断颠倒ep管数次。

2)加入700μl氯仿：异戊醇(24:1)混合液，充分混匀，12000rpm离心5min。

3)将离心后分离的上清液小心转移至新的2.0ep管中，加入700μl异丙醇(放-20℃冰箱保存，低温效果更佳)，充分混匀。

4)将混匀后的液体分两次转移到吸附柱cb3内，12000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液。

5)向吸附柱cb3内加入500μl缓冲液gd(使用前确定加入规定体积的无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液。

6)向吸附柱cb3内加入700μl漂洗液pw，(使用前确定加入规定体积的无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液。

7)重复6步骤。

8)将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱cb3放入新的1.5mlep管中，置室温放置数分钟，直到彻底晾干吸附柱cb3内的残余漂洗液(以无乙醇味为判断标准)。

9)向吸附柱cb3中间滤膜为止悬空加入100μl洗脱液te，室温放置3-5分钟，使得洗脱液充分洗脱dna。

10)将放有吸附柱cb3的1.5mlep管12000rpm离心2min，将溶液收集到1.5mlep管内，-20℃保存备用。

1.2引物筛选与pcr扩增

选择引物，对不同产地甘草样本的总dna进行pcr扩增及电泳检测，pcr扩增反应体系为25μl，组成为ddh2o8.5μl，2×taqpcrmix12.5μl，上下游引物各1μl，dna模板2μl。

各引物序列及pcr反应条件分别为：

its2序列，其引物(s2f:atgcgatacttggtgtgaat,s3r:gacgcttctccagactacaat)，该引物对序列分别如seqidno:7和seqidno:8所示，

94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸45秒，40个循环；72℃延伸10分钟。

its序列，其引物(5f:ggaagtaaaagtcgtaacaagg,4r:tcctccgcttattgatatgc)，该引物对序列分别如seqidno:9和seqidno:10所示，

94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟(每个循环增加3秒)，30个循环；72℃延伸7分钟。

psba-trnh序列，其引物(fwdpa:gttatgcatgaacgtaatgctc,revth:cgcgcatggtggattcacaatcc)，该引物对序列分别如seqidno:11和seqidno:12所示，

94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，30个循环；72℃延伸7分钟。

matk序列，其引物(kim_3f:cgtacagtacttttgtgtttacgag,kim_1r:acccagtccatctggaaatcttggttc)，该引物对序列分别如seqidno:13和seqidno:14所示，

94℃预变性1分钟；94℃变性30秒，52℃退火20秒，72℃延伸50秒，35个循环；72℃延伸5分钟。

rbcl序列，其引物(1f:atgtcaccacaaacagaaac,724r:tcgcatgtacctgcagtagc)，该引物对序列分别如seqidno:15和seqidno:16所示，

95℃预变性2分钟；94℃变性1分钟，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，34个循环；72℃延伸7分钟。

pcr反应产物电泳检测：配置1％琼脂糖凝胶(0.6g琼脂糖+60ml0.5×tbe缓冲液，微波加速溶解；加入1μl核酸染料genegreen，待冷却至65℃左右时倒入放置梳子的胶盒内；室温放置10-20分钟，凝胶彻底凝固后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内，电泳槽内的tbe缓冲液需没过凝胶；)，将pcr产物点入凝胶内，同时点入dnamarker(dl2000)，调整电泳仪电压至100-140v，时间为30分钟，开始电泳。电泳结束后，将凝胶放入凝胶成像仪，紫外灯下观察电泳条带，如每份样品均有单一且明亮的条带，说明pcr扩增成功，可进行后续测序工作。

1.3测序与序列比较分析

将全部pcr产物点入琼脂糖凝胶内进行电泳，并对凝胶中的条带位置进行切胶回收，并对回收后的产物进行上机测序。

测序完成后，对返回的序列运用codoncodealigener软件进行序列拼接，去掉低质量区序列；运用mega软件进行序列比对与分析，找到可以稳定准确鉴别新疆产甘草的引物序列。经过序列比对分析，发现在psba-trnh序列中的270位点呈现规律性的突变碱基(singlenucleotidepolymorphisms，单核苷酸多态性，snp变异位点)。其它产地的甘草在psba-trnh序列的270位点为c碱基，而如图1所示，在新疆产甘草在psba-trnh序列的270位点为t碱基。

实施例2基于单核苷酸多态性标记对新疆产甘草进行鉴别

2.1总dna提取

取待测甘草干燥样本，可在去除表面污染物后直接称取约30mg，放入灭菌的1.5ml离心管内，加入两粒灭菌后的小钢珠，放入球磨仪内1500rpm研磨3-5分钟；新鲜样本可称取约0.5g，去除表面污染物，加入干净的研钵内，用液氮充分研磨成粉末，取适量加入1.5ml离心管内；

加入250μl细胞核裂解液(主要用于将样本中的细胞壁裂解，释放出细胞内的遗传物质)，5μlrna酶溶液，充分震荡混匀；

加入20μl蛋白酶k，充分震荡混匀；

将其置于65℃水浴锅内水浴1小时(期间反复倒转混合数次)；

加入250μl裂解缓冲液，充分混匀后全部转移至纯化吸附柱内，12000rpm离心5分钟；

去掉收集管内的废液，加入700μl漂洗液(使用前确定已加入无水乙醇)，12000rpm离心40秒；

去掉收集管内的废液，重复步骤6)2次；

去掉收集管内的废液，空管12000rpm离心2分钟，将纯化吸附柱放入新的1.5ml离心管中，室温放置5分钟，待乙醇会发完全；

在纯化吸附柱的中心滤膜上悬空加入100μl灭菌的洗脱缓冲液，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟即得样本dna模板，放-20℃保存备用。

2.2pcr扩增

配置pcr反应体系25μl，放入0.2mlpcr管内，体系包括12.5μl2×taqpcrmix，dna模板2μl，引物(上/下游，2.5μm)各1μl，灭菌双蒸水8.5μl，对待测不同产地甘草样本的总dna进行pcr扩增及电泳检测。

引物序列及pcr反应条件分别为：

psba-trnh序列，其引物(fwdpa:gttatgcatgaacgtaatgctc,revth:cgcgcatggtggattcacaatcc)，

94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，30个循环；72℃延伸7分钟。

2.3测序分析

将pcr产物点入琼脂糖凝胶内进行电泳，并对凝胶中的条带位置进行切胶回收，并对回收后的产物进行上机测序。

若psba-trnh序列第270位点为t碱基，则该待测甘草是新疆产甘草；若psba-trnh序列第270位点为c碱基，则该待测甘草是其它产地的甘草。

实施例3特异性引物

根据可稳定鉴别新疆产甘草的稳定snp变异位点，以此设计鉴别新疆产甘草的特异性引物。在psba-trnh序列的上游30-49bp处选择20bp长度的互补序列作为上游引物序列，以新疆产甘草为例，其psba-trnh序列270位点为t碱基，在psba-trnh序列的270位点前后分别设计三组引物作为下游引物，分别为250-270bp、260-280bp、270-291bp。这三段序列的反向互补序列分别对应特异性引物的下游三组引物序列。此过程可通过软件primer6.0实现序列与引物序列的转换，或手动修改均可。

三对引物对分别为：

引物对1的序列如seqidno:1(5’-cttcgaggtagatatttacc-3’)和seqidno:2(5’-gcgcgtcttctaaaatacgag-3’)所示；

引物对2的序列如seqidno:3(5’-cttcgaggtagatatttacc-3’)和seqidno:4(5’-ttaagttcttgcgcgtcttct-3’)所示；

引物对3的序列如seqidno:5(5’-cttcgaggtagatatttacc-3’)和seqidno:6(5’-tttcttctcttttaagttcttg-3’)所示。

运用primer6.0软件对引物序列进行分析，确定退火温度并进行试验优化，最终确定各引物对的pcr反应程序为：

引物对1的pcr条件为：95℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；

引物对2的pcr条件为：95℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；

引物对3的pcr条件为：95℃预变性4min；94℃变性30s，48℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

实施例4通过特异性引物对鉴别新疆产甘草的方法

特异性鉴别新疆产甘草的鉴别系统主要包括dna提取部分、含pcr试剂的扩增部分与琼脂糖凝胶电泳检测三部分，其中该pcr试剂含特异性引物。dna提取部分主要包括细胞核裂解液、裂解液缓冲液、rna酶溶液、蛋白酶k，漂洗液(使用时需加入无水乙醇)、无菌的洗脱缓冲液、纯化吸附柱、收集管、1.5ml灭菌离心管等。pcr扩增部分主要包括2×taqpcrmix、特异性引物(上/下游)、标准新疆产甘草dna(阳性对照)、标准其它产地甘草dna(阴性对照)、灭菌双蒸水等。琼脂糖凝胶电泳检测部分包括琼脂糖、50×tbe缓冲液、dnamarker(dna分子量标记)以及核酸染料。

检测方法：

4.1总dna提取

取待测甘草干燥样本，可在去除表面污染物后，直接称取约30mg，放入灭菌的1.5ml离心管内，加入两粒灭菌后的小钢珠，放入球磨仪内1500rpm研磨3-5分钟；新鲜样本可称取约0.5g，去除表面污染物，加入干净的研钵内，用液氮充分研磨成粉末，取适量加入1.5ml离心管内；

加入250μl细胞核裂解液(主要用于将样本中的细胞壁裂解，释放出细胞内的遗传物质)，5μlrna酶溶液，充分震荡混匀；

加入20μl蛋白酶k，充分震荡混匀；

将其置于65℃水浴锅内水浴1小时(期间反复倒转混合数次)；

加入250μl裂解缓冲液，充分混匀后全部转移至纯化吸附柱内，12000rpm离心5分钟；

去掉收集管内的废液，加入700μl漂洗液(使用前确定已加入无水乙醇)，12000rpm离心40秒；

去掉收集管内的废液，重复步骤6)2次；

去掉收集管内的废液，空管12000rpm离心2分钟，将纯化吸附柱放入新的1.5ml离心管中，室温放置5分钟，待乙醇会发完全；

在纯化吸附柱的中心滤膜上悬空加入100μl灭菌的洗脱缓冲液，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟即得样本dna模板，放-20℃保存备用。

4.2pcr扩增

配置pcr反应体系25μl，放入0.2mlpcr管内，体系包括12.5μl2×taqpcrmix，dna模板2μl，特异性引物(上/下游，2.5μm)各1μl，灭菌双蒸水8.5μl。除了样本dna模板外，另行配置阳性对照、阴性对照与空白对照样本pcr反应体系，方法同上，除了dna模板不同，空白对照用灭菌双蒸水取代dna模板。

充分混匀体系溶液，用微型离心机离心数秒后，放入pcr仪内。

pcr反应程序与特异性引物相对应，分别为：

引物对1的pcr条件为：95℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；

引物对2的pcr条件为：95℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；

引物对3的pcr条件为：95℃预变性4min；94℃变性30s，48℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

待pcr反应结束后，将pcr产物取出后放入-4℃保存备用，或立即进行琼脂糖凝胶电泳检测

4.3电泳检测

1)琼脂糖凝胶制作

称取0.6g琼脂糖，加入60ml0.5×tbe缓冲液中(试剂盒内为50×tbe缓冲液，适合长期保存，使用时可用蒸馏水直接稀释至0.5×tbe缓冲液使用，建议现配现用)，加入微波炉内加热加速溶液(高火1-2分钟)，待琼脂糖完全溶解后且温度降至65℃左右时，加入1μl核酸染料，慢慢摇匀后倒入插有梳子的胶盒内，室温下凝固。

2)电泳检测

将新鲜的0.5×tbe缓冲液加入电泳仪的电泳槽内，将凝固好的凝胶放入电泳槽内(缓冲液需没过凝胶)，凝胶的加样孔一侧放在电泳槽的负极。从加样孔的一端依次加入5μl的dnamarker、阳性对照、阴性对照、空白对照、检测样本dnapcr产物，按5v/cm的恒压进行电泳30分钟。

3)凝胶成像系统分析

电泳结束后，将琼脂糖凝胶放入凝胶成像仪内进行观察拍照。使用紫外灯不断曝光直至胶图上条带清晰为止，保存电泳胶图结果为电子文件，并观察记录电泳检测结果。

4)检测结果分析

如果阴性对照与空白对照均未出现条带，阳性对照出现200bp左右的扩增条带，如待测样本出现相应的200bp左右的扩增条带，可判定待测样本为阳性结果(新疆产甘草)；如待测样本未出现与阳性对照相对应的200bp左右的扩增条带，可判定该待测样本不是新疆产甘草。

运用三对特异性引物对新疆及其它产地甘草的标准样本进行pcr扩增与琼脂糖凝胶电泳检测，本发明涉及的三对特异性引物均可特异性扩增新疆产甘草样本，而不能扩增其它产地甘草样本。三对特异引物对特定甘草样本进行扩增的电泳检测图谱如图2、图3和图4所示，选自实施例1中的新疆产甘草的标准品的电泳检测均出现相应的约200bp的扩增条带，而选自实施例1中的其它产地的甘草标准品的电泳检测均未出现相应的约200bp的扩增条带。由此，本发明涉及的三对特异引物对均可快速特异性检测待测甘草是否是新疆产甘草。

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<110>中国中药有限公司

<120>鉴别或辅助鉴别甘草的引物对及其应用

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