肺炎支原体快速检测引物组、试剂盒的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种肺炎支原体快速检测引物组、试剂盒。
背景技术：
：肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae，mp)，属柔膜体纲，支原体属，是介于细菌和病毒之间，能在无生命培养基上独立生活、能够进行自我复制的原核微生物。肺炎支原体可通过咳嗽时飞沫或气溶胶以及直接接触传播，对人类普遍易感，但是发病呈现低龄化趋势，尤其是免疫系统发育尚未成熟的儿童和青少年。肺炎支原体可导致急性肺部感染，是儿童和成人社区获得性肺炎(communityacquiredpneumonia，cap)的重要病原体。儿童cap中10％-40％由mp感染所致，其中约18％需要住院治疗。除了肺炎，肺炎支原体也可引起多种肺μ并发症包括神经、心血管等多系统疾病，甚至死亡。由于肺炎支原体没有细胞壁，寻常抗生素对其治疗效果不佳，因此，为避免滥用抗生素，早期诊断尤为重要。目前，针对肺炎支原体的检测方法，主要包括快速培养法、荧光pcr法和血清学检测法。其中荧光pcr法因其灵敏度高、特异度高等优势，越来越广泛的应用于临床肺炎支原体感染检测。国内外已报道多种肺炎支原体荧光pcr检测体系，包括荧光定量pcr法、环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)等，检测灵敏度和特异度均已经超过其他检测技术，逐渐成为临床肺炎支原体检测的“金标准”。但是，荧光pcr法也存在一些缺点，包括依赖于成本高昂的荧光pcr仪及复杂的实验设计，同时对实验技术人员操作要求较高，耗时长等，同时需要变温循环容易产生气溶胶，具有污染的风险。lamp技术需要65℃恒温，这个温度也是相对较高的，存在污染可能性较大、假阳性、特异度低等缺点。技术实现要素：针对以上问题，本发明提供一种肺炎支原体快速检测引物组、试剂盒，操作简单、耗时短、灵敏度高、特异性强，准确度高，不易出假阳性，能够快速而准确地检测肺炎支原体。为达到上述目的，本发明的技术方案是：肺炎支原体快速检测引物组，包含检测肺炎支原体基因组p1基因保守序列的上、下游引物和探针，所述上游引物是：5’-ggcagtcaacaaaccacgtatgatccc-3’；所述下游引物是：5’-aaacggcaaaccgataaggattggagg-3’；所述探针是5’-gccgggcgcgccttatacgacc/i6-famdt/c/idsp/a/ibhq1dt/ttttcgaagt-3’c3spacer。其中：“i6-famdt”指6-fam(6-羧基荧光素)荧光标记的dt核苷酸，“idsp”指碱基缺失，“ibhq1dt”指带有bhq1淬灭基团标记的dt核苷酸，“c3spacer”指3’羟基封闭。进一步的，所述上游引物可以是权利要求1所述上游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；所述下游引物可以是权利要求1所述下游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；所述探针可以是权利要求1所述探针序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列同源性大于85％的序列；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列碱基互补的序列；或者，所述探针的6-fam、缺失及bhq1修饰处于序列的第23、25及27位；或者，所述探针的6-fam、缺失或bhq1标记处于正向或反向互补序列的第21-32位。进一步的，所述探针长度有34bp，荧光、碱基缺失和淬灭修饰处于序列中下游第23、25及27位。本发明还提供肺炎支原体快速检测试剂盒，所述试剂盒包括以下内容：(1)裂解液；(2)复溶液；(3)含引物探针的ema反应管；所述引物包含上、下游引物和探针；所述上游引物是：5’-ggcagtcaacaaaccacgtatgatccc-3’；所述下游引物是：5’-aaacggcaaaccgataaggattggagg-3’；所述探针是5’-gccgggcgcgccttatacgacc/i6-famdt/c/idsp/a/ibhq1dt/ttttcgaagt-3’c3spacer；(4)阳性质控品；(5)阴性质控品。进一步的，所述上游引物可以是权利要求1所述上游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；所述下游引物可以是权利要求1所述下游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；所述探针可以是权利要求1所述探针序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列同源性大于85％的序列；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列碱基互补的序列；或者，所述探针的6-fam、缺失及bhq1修饰处于序列的第23、25及27位；或者，所述探针的6-fam、缺失或bhq1标记处于正向或反向互补序列的第21-32位。优选的，所述裂解液含有终浓度为2-5％的np-40(v/v)、20-50mg/ml的chelex-100、10-20mm的ph8.0的tris-ac以及超纯水。优选的，所述复溶液含有终浓度为20-30mm的mgac2、90-100mm的tris-ac(ph8.0)、55-60mm的kac、10-15％的peg20000(w/v)及超纯水。优选的，所述含引物探针的ema反应管的成分如下：每个反应管中含有终浓度为24-27ng/μl的单链dna结合蛋白、62-125pg/μl的atp再生蛋白、6-7.5ng/μl的dna解旋酶、2-3ng/μl的dna聚合酶、90-120pg/μl的dna限制性内切酶、300-400pg/μl的辅助蛋白、200-300nm的上游引物、200-300nm的下游引物、30-40nm的探针、20-30mm的磷酸肌酸钠、2-3mm的atp、100-150μm的dntp、50-60mm的tris-ac(ph8.0)、35-50μg/μl的海藻糖、100-120mm的kac、7.5-10ng/μl的甘露醇、1-5％的peg20000(w/v)。优选的，所述阴性质控品为超纯水空白对照。优选的，所述阳性质控品是含有目的序列的质粒，浓度是1*104copies/μl。本发明还提供所述肺炎支原体快速检测引物组在制备肺炎支原体快速检测试剂盒中的应用。本发明还提供一种肺炎支原体的检测方法，所述检测方法采用所述的肺炎支原体快速检测试剂盒，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的，所述检测方法包括以下步骤：(1)使用所述的肺炎支原体快速检测试剂盒，将目标样本拭子放到500μl裂解液中并剪断，涡旋振荡30秒，5000转/分，离心1分钟，取100μl上清液转移到新的1.5ml离心管中，金属浴90℃加热裂解10分钟，随后冷却到室温，取上清进行检测；(2)使用所述的肺炎支原体快速检测试剂盒，取10μl复溶液及10μl样本裂解所得上清，加入到含引物探针的ema反应管中，充分混匀，另设置阳性及阴性对照；(3)将复溶的ema反应管放入clicki核酸荧光检测仪中，37-45℃扩增10-30分钟，每30秒扫描荧光一次，采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；(4)结果质控：阳性质控品ct值＜20，荧光曲线为典型“s”型，阴性质控品无ct值，以上条件均满足，本次实验有效，否则无效，需要排查原因并重新测试；(5)结果判断：如果样本扫描荧光曲线为典型“s”型，且ct值＜30，则判断为阳性结果；反之，扫描荧光曲线为水平直线，无ct值，则为阴性结果。本发明依赖于ema技术，可在37-45℃恒温条件下进行，检测时间是10-30分钟。本发明提供的探针设计与taqman探针不同，长度有34bp，荧光、碱基缺失和淬灭修饰处于序列中下游第23、25及27位，距离1-4个碱基，可有效降低背景荧光，提高灵敏度，特异度。本发明的引物序列是这样得到的：通过国内外文献及genebank数据库比对筛选肺炎支原体基因序列，最终确定p1细胞粘附蛋白基因为目的基因，该基因高度保守特异，通过检测该序列，即可以明确样本中是否含有肺炎支原体。从genebank数据库中下载肺炎支原体p1基因序列(序列号cp002077.1)，通过primerpremier6软件设计多对引物，以含目的序列的质粒为模板，通过凝胶电泳筛选最适引物。筛选标准：引物分析灵敏度至少到100copies/μl、阳性扩增曲线是典型“s”曲线、阴性扩增曲线是水平直线。筛选好3对引物后，以上下游引物中间的序列设计多条探针，进一步筛选探针。从而得到本发明所含引物对及探针：上游引物是：5’-ggcagtcaacaaaccacgtatgatccc-3’；下游引物是：5’-aaacggcaaaccgataaggattggagg-3’；探针是5’-gccgggcgcgccttatacgacc/i6-famdt/c/idsp/a/ibhq1dt/ttttcgaagt-3’c3spacer。本发明的试剂盒是采用筛选后得到的最佳引物探针根据ema体系制备条件，调整引物及探针的最佳浓度，制备含引物探针的ema反应管和复溶液、裂解液、阴性质控品、阳性质控品，形成肺炎衣原体快速检测试剂盒。本发明的有益效果包括：1、本发明中引物序列较长，即便样本中靶序列存在1-3个突变，也可以正常扩增，增加了本发明的准确性。2、本发明中探针序列较长，fam及bhq1标记在序列的内部，距离1-4个碱基，这样的设计增加了扩增体系的适应性，同时降低了背景荧光；若样本中靶序列存在突变，也可以保证荧光探针与靶序列的退火及荧光信号的产生及释放；从而增加了本发明的灵敏度和特异性。3、本试剂盒中ema反应管中的试剂经过冻干处理，可2-8℃保存和运输，降低了保存及冷链运输的设备要求，同时延长了有效期。4、本发明中试剂盒含有裂解液，可以快速提取样本中肺炎支原体的dna，无需额外提取试剂盒，降低成本并提高效率。5、本发明中核酸扩增条件为37℃到45℃，对温度要求低，对机器要求低。6、本发明的核酸扩增时间短，可在30分钟内报告结果。本发明中肺炎支原体的p1基因具有高度保守及种属特异性，以p1为目的基因，筛选最佳引物及探针，并配合以通用的ema酶，形成最优的实验反应体系，使本发明试剂盒具有检测能力上的优势与特点，不仅检测简单易行，而且具有较高的准确度、精密度、特异性以及可重复性。本发明提供的引物组序列较长，具有一定的容错性，同时本发明探针的设计与taqman探针设计不同，集中修饰处于序列的内部，距离1-4个碱基，可有效降低背景荧光，提高灵敏度和特异度。本发明提供的试剂盒，采用的是ema技术，该技术可在37-45℃恒温条件进行，检测时间10-30分钟，可以实现对待检样本的早期快速检定。附图说明图1是实施例1肺炎支原体快速检测引物组的筛选结果图2是实施例2肺炎支原体快速检测探针的初筛结果图3是实施例4交叉反应的检测结果图4是实施例5临床样本的检测结果。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明，所选配方为试剂盒的优选配方，但并不用来限制本发明的范围。本发明提供的肺炎支原体快速检测引物组，包含检测肺炎支原体p1基因保守序列的上、下游引物和探针，所述上游引物是：5’-ggcagtcaacaaaccacgtatgatccc-3’；所述下游引物是：5’-aaacggcaaaccgataaggattggagg-3’；所述探针是5’-gccgggcgcgccttatacgacc/i6-famdt/c/idsp/a/ibhq1dt/ttttcgaagt-3’c3spacer。进一步的，所述上游引物可以是权利要求1所述上游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；所述下游引物可以是权利要求1所述下游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；所述探针可以是权利要求1所述探针序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列同源性大于85％的序列；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列碱基互补的序列；或者，所述探针的6-fam、缺失及bhq1修饰处于序列的第23、25及27位；或者，所述探针的6-fam、缺失或bhq1标记处于正向或反向互补序列的第21-32位。本发明还提供肺炎支原体荧光ema检测试剂盒，所述试剂盒包括以下内容：(1)裂解液；(2)复溶液；(3)含引物探针的ema反应管；所述引物探针包含上、下游引物和探针；所述上游引物是：5’-ggcagtcaacaaaccacgtatgatccc-3’；所述下游引物是：5’-aaacggcaaaccgataaggattggagg-3’；所述探针是5’-gccgggcgcgccttatacgacc/i6-famdt/c/idsp/a/ibhq1dt/ttttcgaagt-3’c3spacer；(4)阳性质控品；(5)阴性质控品。进一步的，所述上游引物可以是权利要求1所述上游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；所述下游引物可以是权利要求1所述下游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；所述探针可以是权利要求1所述探针序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列同源性大于85％的序列；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列碱基互补的序列；或者，所述探针的6-fam、缺失及bhq1修饰处于序列的第23、25及27位；或者，所述探针的6-fam、缺失或bhq1标记处于正向或反向互补序列的第21-32位。优选的，所述裂解液含有终浓度为2-5％的np-40(v/v)、20-50mg/ml的chelex-100、10-20mm的ph8.0的tris-ac以及超纯水。优选的，所述复溶液含有终浓度为20-30mm的mgac2、90-100mm的tris-ac(ph8.0)、55-60mm的kac、10-15％的peg20000(w/v)及超纯水。优选的，所述含引物探针的ema反应管的成分如下：每个反应管中含有终浓度为24-27ng/μl的单链dna结合蛋白、62-125pg/μl的atp再生蛋白、6-7.5ng/μl的dna解旋酶、2-3ng/μl的dna聚合酶、90-120pg/μl的dna限制性内切酶、300-400pg/μl的辅助蛋白、200-300nm的上游引物、200-300nm的下游引物、30-40nm的探针、20-30mm的磷酸肌酸钠、2-3mm的atp、100-150μm的dntp、50-60mm的tris-ac(ph8.0)、35-50μg/μl的海藻糖、100-120mm的kac、7.5-10ng/μl的甘露醇、1-5％的peg20000(w/v)。优选的，所述阴性质控品为超纯水空白对照。优选的，所述阳性质控品是含有目的序列的质粒，浓度是1*104copies/μl。本发明还提供一种肺炎支原体的检测方法，所述检测方法采用所述的肺炎支原体快速检测试剂盒，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的；所述检测方法包括以下步骤：(1)使用所述的肺炎支原体快速检测试剂盒，将目标样本拭子放到500μl裂解液中并剪断，涡旋振荡30秒，5000转/分，离心1分钟，取100μl上清液转移到新的1.5ml离心管中，金属浴90℃加热裂解10分钟，随后冷却到室温，取上清进行检测；(2)使用所述的肺炎支原体快速检测试剂盒，取10μl复溶液及10μl样本裂解所得上清，加入到含引物探针的ema反应管中，充分混匀，另设置阳性及阴性对照；(3)将复溶的ema反应管放入clicki核酸荧光检测仪中，37-45℃扩增10-30分钟，每30秒扫描荧光一次，采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；(4)结果质控：阳性质控品ct值＜20，荧光曲线为典型“s”型，阴性质控品无ct值，以上条件均满足，本次实验有效，否则无效，需要排查原因并重新测试；(5)结果判断：如果样本扫描荧光曲线为典型“s”型，且ct值＜30，则判断为阳性结果；反之，扫描荧光曲线为水平直线，无ct值，则为阴性结果。实施例1、肺炎支原体快速检测引物组的筛选从genebank上下载肺炎支原体p1基因保守序列(序列号cp002077.1)，通过primerpremier6软件设计了4对引物(表1)，运用ema通用酶，将引物交叉配对，共16种组合，分别扩增含有p1基因序列的质粒。质粒10倍梯度稀释，浓度是1×106copies/μl、1×105copies/μl、1×104copies/μl、1×103copies/μl、1×102copies/μl、10c叩ies/μl、1copies/μl，并设置阴性对照，扩增后进行电泳检测。表1引物列表序列名称序列1fcgtatcgtaacacgagcttttcctccc1rgcccggtttggtcgcgcgtgggcgtttgcg2fggccttagtgcgcgacaacagcgctaag2raaagccgccaaaggggttaaaggtgatctg3fggcagtcaacaaaccacgtatgatccc3rgacctcgtttcactgttggggtgcagc4fgcatcaaccacctttgcgttacgccgg4raaacggcaaaccgataaggattggagg筛选引物标准：检测限最高，没有非特异扩增。筛选结果见图1。每对引物的电泳图由左往右泳道分别是marker，7个模板，浓度分别是1×106c叩ies/μl、1×105c叩ies/μl、1×104copies/μl、1×103copies/μl、1×102copies/μl、10copies/μl、1copies/μl，以及阴性对照。引物对1f/3r、2f/2r、2f/4r、3f/1r、3f/2r、3f/4r的扩增没有非特异扩增，选择3对引物2f/2r、3f/2r、3f/4r设计探针，其他引物作为备选。实施例2、肺炎支原体快速检测探针的初筛根据实施例1的结果设计的两条公用探针，序列见表2，将实施例1中筛选的3对引物与2对探针交叉组合，形成6种组合。各组合配合ema通用酶，扩增以含有p1基因序列的质粒为模板，浓度是1×104copies/μl。表2探针序列探针初筛标准：阳性荧光曲线为典型“s”型，且ct值最小，阴性荧光曲线是水平直线。探针初筛结果见图2。其中2f/2r-p2扩增曲线不是典型“s”型，排除；线①是3f/4r-p1扩增的阴性，阴性有扩增曲线，所以这对组合排除；3f/4r-p2扩增曲线ct值最小，所以筛选引物3f、4r、探针p2进行冻干。最终所得上、下游引物和探针为：上游引物是：5’-ggcagtcaacaaaccacgtatgatccc-3’；下游引物是：5’-aaacggcaaaccgataaggattggagg-3’；探针是5’-gccgggcgcgccttatacgacc/i6-famdt/c/idsp/a/ibhq1dt/ttttcgaagt-3’c3spacer。实施例3、制备肺炎支原体快速检测试剂盒本实施例采用实施例2筛选得到的引物组。基于ema技术，分别设计裂解液、复溶液、含引物探针的ema反应管。(1)裂解液通过比较各提取试剂的搭配、比例、裂解效果及裂解时间，最终选用的裂解液含有终浓度为2-5％的np-40(v/v)、20-50mg/ml的chelex-100、10-20mm的ph8.0的tris-ac以及超纯水。(2)复溶液及含有引物探针的ema反应管通过反复调整引物、探针的含量，验证反应体系的扩增效果，形成了最佳的扩增体系：选用的复溶液含有终浓度为20-30mm的mgac2、90-100mm的tris-ac(ph8.0)、55-60mm的kac、10-15％的peg20000(w/v)及超纯水。选用的含有引物探针的ema反应管中含有终浓度为24-27ng/μl的单链dna结合蛋白、62-125pg/μl的atp再生蛋白、6-7.5ng/μl的dna解旋酶、2-3ng/μl的dna聚合酶、90-120pg/μl的dna限制性内切酶、300-400pg/μl的辅助蛋白、200-300nm的上游引物、200-300nm的下游引物、30-40nm的探针、20-30mm的磷酸肌酸钠、2-3mm的atp、100-150μm的dntp、50-60mm的tris-ac(ph8.0)、35-50μg/μl的海藻糖、100-120mm的kac、7.5-10ng/μl的甘露醇、1-5％的peg20000(w/v)。(3)阴性质控品为超纯水空白对照。(4)阳性质控品是含有目的序列的质粒，浓度是1*104copies/μl。肺炎支原体荧光ema检测步骤如下：第一步、样本dna的提取。将目标样本拭子放到500μl裂解液中并剪断，涡旋振荡30秒，5000转/分，离心1分钟，取100μl上清液转移到新的1.5ml离心管中，金属浴90℃加热裂解10分钟，随后冷却到室温，取上清进行检测；第二步、取10μl复溶液及10μl样本裂解所得上清，加入到含引物探针的ema反应管中，充分混匀，另设置阳性及阴性对照；第三步、将复溶的ema反应管放入clicki核酸荧光检测仪中，37-45℃扩增10-30分钟，每30秒扫描荧光一次，采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；第四步、结果质控：阳性质控品ct值＜20，荧光曲线为典型“s”型，阴性质控品无ct值，以上条件均满足，本次实验有效，否则无效，需要排查原因并重新测试；第五步、结果判断：如果样本扫描荧光曲线为典型“s”型，且ct值＜30，则判断为阳性结果；反之，扫描荧光曲线为水平直线，无ct值，则为阴性结果。实施例4：交叉反应的检测：选用部分人类感染常见病原体的核酸提取物，核酸浓度见表3，包括肺炎衣原体、流感h1n1、合胞病毒a型、腺病毒3型、腺病毒7型、结核分枝杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念球菌，以含有目的基因的质粒(1×104copies/μl)为阳性对照，进行交叉反应的检测，结果显示除含有肺炎支原体目的基因的质粒为阳性结果外(如图3的曲线)，其它样本结果均为阴性，证明本试剂盒与本实施例中其他病原体无交叉反应。表3交叉反应样本列表样本编号浓度备注肺炎衣原体/1.06×104copies/μl临床样本流感h1n1/8.17×104copies/l临床样本合胞病毒a型/2.51×105copies/μd临床样本腺病毒3型/8.49×105copies/μl临床样本腺病毒7型/7.56×104copies/μl临床样本结核分枝杆菌/6.82×104copies/μl临床样本肺炎链球菌atcc496197.24×107ng/μl/金黄色葡萄球菌atcc259233.66×106ng/μl/大肠杆菌atcc259237.25×107ng/μl/白色念球菌atcc102319.28×106ng/μl/实施例5：临床样本的检测：临床样本取自上海某医院，共7例确诊为肺炎支原体感染的临床样本咽拭子及其他5例阴性样本。采用本发明的肺炎支原体快速检测试剂盒中的裂解液进行样本核酸的提取，并进行肺炎支原体的扩增检测，结果ct值见表4，显示检出肺炎支原体阳性结果7例(如图4，7条曲线)、阴性结果5例，与临床诊断结果完全符合。表4临床样本的检测结果样本编号医院诊断结果本实施例结果s1阳性9.65s2阳性8.27s3阳性8.38s4阳性7.93s5阳性8.43s6阳性8.88s7阳性10.27s8阴性-s9阴性-s10阴性-s11阴性-阴性对照/-阳性对照/11.37注：“/”表示无数据；“-”表示无ct值，为阴性结果。本发明的肺炎支原体快速检测引物组通过实验验证，显示了很高的准确度和特异性，肺炎支原体快速检测试剂盒同样具有高的准确度、特异性和正确性。本发明使用ema技术，通过多个酶促反应，可在37-45℃恒温条件进行，配合荧光检测技术，可以30分钟内实现对待检核酸的快速检测。本发明以肺炎支原体的p1序列为目的基因，筛选最佳引物及探针，引物和探针的组合对高浓度的阴性样本无交叉反应，说明本试剂盒具有较高的特异性。配合通用的ema酶，形成最优的实验反应体系，使本发明试剂盒操作简便，耗时短，对肺炎支原体的早期快速诊断具有重要意义。本发明提供的引物组序列具有一定的容错性，同时本发明探针的设计与taqman探针设计不同，集中修饰处于序列的内部，且距离很近，可有效降低背景荧光，提高灵敏度和特异度。本发明提供的试剂盒，采用的是ema技术，该技术可在37-45℃恒温条件进行，检测时间10-30分钟，可以实现对待检样本的早期快速检定。以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。序列表<110>苏州点晶生物科技有限公司<120>肺炎支原体快速检测引物组、试剂盒<130>0<141>2019-03-01<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>27<212>dna<213>mycoplasmapneumoniae<220><221>misc_feature<222>(1)..(27)<400>1ggcagtcaacaaaccacgtatgatccc27<210>2<211>27<212>dna<213>mycoplasmapneumoniae<220><221>misc_feature<222>(1)..(27)<400>2aaacggcaaaccgataaggattggagg27<210>3<211>34<212>dna<213>mycoplasmapneumoniae<220><221>misc_feature<222>(1)..(34)<400>3gccgggcgcgccttatacgacccattttcgaagt34当前第1页12