钠通道阻断剂μ-TRTX-Ca1a作为镇痛药物的应用的制作方法

本发明涉及白线霜足蛛多肽毒素μ-trtx-ca1a的发现和应用，属于生物医学技术领域。

背景技术：

电压门控离子通道是参与细胞电信号传导的跨膜蛋白，是神经、肌肉、腺体等许多组织细胞膜上的基本兴奋单元，它们能产生和传导电信号，其活动与细胞的兴奋、收缩、分泌和突触传递等特异性功能密切相关。在所有哺乳动物钠通道亚型中，nav1.7，nav1.8和nav1.9主要分布在外周神经系统，参与疼痛信号的传导，而nav1.7是目前缓解慢性疼痛最有前景的目标之一。nav1.7通道功能获得性突变会导致神经病理性疼痛，包括红斑性肢痛症、阵发性剧痛症、以及小纤维神经痛；相反，nav1.7的功能缺失性突变会导致非功能性通道蛋白的表达，进而导致先天性无痛症。在药理学上抑制nav1.7活性的化合物有可能治疗慢性疼痛，因此靶向nav1.7通道的专一性抑制剂有望发展为新型的镇痛药物。

蜘蛛毒液是一种高度复杂的混合物，主要含有蛋白质、多肽以及一些小分子物质。目前已经证实了这些多肽成分多为神经毒素，可特异性识别离子通道蛋白、膜受体及转运蛋白。因此蜘蛛毒液中的成分具有广泛的应用前途，如开发成为镇痛药物、治疗自身免疫疾病药物等。

技术实现要素：

本发明提供一种白线霜足蛛多肽毒素μ-trtx-ca1a的基因、氨基酸序列及其作为镇痛药物的应用。

本发明提供的白线霜足蛛多肽毒素μ-trtx-ca1a，是从白线霜足蛛粗毒中通过反向高效液相色谱分离纯化得到的，其氨基酸序列为ifecsisceiekegngkkckpkkckggwkckfnicvkv，该多肽包括38个氨基酸残基，分子量为4289.31da，等电点为9.20，分子内含有三对二硫键，排列方式为c1-c3、c2-c5和c4-c6。

白线霜足蛛多肽毒素μ-trtx-ca1a的基因克隆包括：白线霜足蛛毒腺总rna提取，mrna纯化，mrna反转录及cdna文库构建，设计引物，利用pcr方法筛选白线霜足蛛钠离子通道抑制剂多肽基因。基因测序结果表明编码白线霜足蛛钠离子通道阻断剂的基因由261个核苷酸组成，自5’端至3’端基因序列包括了信号肽、前体肽和成熟肽。

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本发明的白线霜足蛛多肽毒素μ-trtx-ca1a，对电压门控钠通道nav1.7有非常显著的抑制作用，是一种钠通道抑制剂。同时，小鼠的镇痛模型表明该多肽具有良好的镇痛效果。

附图说明

图1：多肽毒素μ-trtx-ca1a的分离纯化。a：白线霜足蛛粗毒c18反相hplc分离纯化，其中星号所示为目的峰。b：目的多肽进一步采用反相hplc分离。c：目的分子的质谱鉴定图。

图2：μ-trtx-ca1a的基因序列和氨基酸序列。其中黑色阴影部分为成熟肽。

图3：μ-trtx-ca1a对电压门控钠通道nav1.2-nav1.9的活性。a：1µmμ-trtx-ca1a抑制nav1.2电流63.7%。b：1µmμ-trtx-ca1a抑制nav1.3电流23.1%。c：1µmμ-trtx-ca1a抑制nav1.4电流11.2%。d：10µmμ-trtx-ca1a对nav1.5电流无作用。e：1µmμ-trtx-ca1a抑制nav1.6电流68.1%。f：1µmμ-trtx-ca1a抑制nav1.7电流86.5%。g：10µmμ-trtx-ca1a对nav1.8电流无作用。h：10µmμ-trtx-ca1a对nav1.9电流无作用。i：μ-trtx-ca1a对钠离子不同亚型作用的浓效曲线。

图4：μ-trtx-ca1a对nav1.7的动力学作用。a：μ-trtx-ca1a不改变nav1.7的电流电压关系曲线。b：μ-trtx-ca1a不改变nav1.7的稳态激活曲线。c：μ-trtx-ca1a不改变nav1.7的稳态失活曲线。d：μ-trtx-ca1a不改变nav1.7的稳态失活曲线。

图5：μ-trtx-ca1a对不同疼痛模型的镇痛效果。a：100μg/kg,200μg/kg以及500μg/kg的μ-trtx-ca1a明显减少福尔马林导致的炎性疼痛。b：100μg/kg,200μg/kg以及500μg/kg的μ-trtx-ca1a明显减少醋酸导致的疼痛。c：100μg/kg,200μg/kg以及500μg/kg的μ-trtx-ca1a明显降低热导致的疼痛。

具体实施方式

1、μ-trtx-ca1a的分离纯化

μ-trtx-ca1a的分离纯化分为两个步骤：（1）制备型反相hplc高效液相色谱：将300mg冻干的蜘蛛毒液溶于ddh2o，配制成5mg/ml。上样于反相高效色谱c18柱，以水（含0.1%三氟乙酸）和乙腈（含0.1%三氟乙酸）构成的洗脱系统进行梯度洗脱，乙腈浓度变化范围为10%-55%，洗脱梯度为1%/min，洗脱速度为3ml/min，检测波长为280/215nm，收集目标组分冻干。（2）分析型反相hplc高效液相色谱进一步分离纯化：将冻干的目标组分用ddh2o，配制成0.5mg/ml。上样于反相高效色谱c18柱，以水（含0.1%三氟乙酸）和乙腈（含0.1%三氟乙酸）构成的洗脱系统进行梯度洗脱，乙腈浓度变化范围为20%-40%，洗脱梯度为0.5%/min，洗脱速度为1ml/min。检测波长为280/215nm，收集目的峰。如图1所示，白线霜足蛛粗毒经反相hplc分离，其中星号所示为目的峰，该峰经过第二次反相hplc分离产生一个单一的主峰。

毒素分子质量的鉴定均使用美国abi公司生产absciex-tof/tof^tm5800型质谱仪，采用maldi-tof进行检测。用0.1%tfa-50%乙腈-49.9%去离子水混合液制备基质cca(α-cyano-4-hydroxyc-innamicacid)的饱和液，然后取1μl样品与1μlcca的饱和液混合，再取0.5μl混合液点样于质谱的样品盘上，室温干燥后检测分子量。用外标法或内标法进行校正。结果如图1c，白线霜足蛛毒素μ-trtx-ca1a的分子量为4289.31da，分子内含有三对二硫键。

2、μ-trtx-ca1a氨基酸序列以及基因序列

2.1经质谱鉴定纯度达到99.9%的μ-trtx-ca1a采用edman降解原理，利用全自动氨基酸测序仪测得部分序列，再根据μ-trtx-ca1a的基因序列最终确定完整的氨基酸序列。

2.2白线霜足蛛毒腺总rna的提取：

a.取出白线霜足蛛毒腺组织，放入液氮中保存，取出冻存的毒腺组织500mg，加入10m1总rna提取缓冲液（trizol溶液，美国gibcobrl公司），置于20m1玻璃匀浆器中匀浆30分钟。

b.加入等体积酚/氯仿溶液，震荡混匀，室温放置10分钟，4°c，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。

c.上清中加入等体积的异丙醇，-20°c放置10分钟，4°c，12000rpm离心10分钟，沉淀用75%乙醇洗3次，晾干，管底沉淀物即为白线霜足蛛毒腺总rna。

2.3白线霜足蛛毒腺mrna的纯化：

白线霜足蛛毒腺mrna分离纯化采用美国promega公司的polyattract®mrnaisolationsystems试剂盒。

a.取白线霜足蛛毒腺500μg总rna溶于500μldepc水中，放入65°c水浴10分钟，加入3μl的oligo(dt)探针和13μl20×ssc溶液，混匀，放置室温冷却，称为a液。

b.磁珠（sa-pmp）的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×ssc0.3m1，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml0.5×ssc悬浮，称之为b液。

c.将a液加入b液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×ssc洗涤4次，最后弃上清，加0.lmldepc水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15m1depc水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的白线霜足蛛毒腺mrna。

d.加入1/10体积3m乙酸钠，ph5.2，等体积异丙醇，于-70°c放置30分钟，4°c，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μldepc水中。

2.4白线霜足蛛毒腺cdna文库构建：采用clontech公司creatorsmartcdnalibraryconstructionkit质粒cdna文库构建试剂盒。

a.cdna第一链合成（mrna反转录）：

1.在0.2ml无菌的离心管加入：1μl白线霜足蛛毒腺mrna、1μlsmartiv寡聚核苷酸、1μlcdsiii/3’pcr引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。

2.混匀离心管中的试剂并离心，72°c保温2分钟。将离心管在冰上孵育2分钟。在离心管中加入以下试剂：2.0μl5×第一链缓冲、1.0μl20mm二硫苏糖醇（dtt）、1.0μl10mmdntp混合物、1.0μlpowerscript反转录酶。

3.混合离心管中试剂并离心，在42°c保温1小时。

4.将离心管置于冰上中止第一链的合成。

5.从离心管取2μl所合成的cdna第一链备用。

b.采用长末端聚合酶链式反应（ld-pcr）方法扩增第二链

1.95°c预热pcr仪。

2.将2μlcdna第一链（mrna反转录）、80μl去离子水、10μl10×advantage2pcr缓冲、2μl50×dntp混合物、2μl5’pcr引物、2μlcdsiii/3’pcr引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。

3.在pcr仪中按以下程序扩增：

95°c20秒钟，22个循环：95°c5秒钟、68°c6分钟。

4.循环结束后，将离心管中合成的cdna双链进行抽提。

c.pcr产物用promega公司的wizardsvgelandpcrclean-upsystem试剂盒进行抽提回收，步骤如下：

1.将通过pcr得到的cdna双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使dna充分与硅胶膜结合。16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

2.加入700µl的洗脱液（含乙醇）于离心纯化柱中，16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

3.重复步骤2。

4.16,000g离心5分钟。

5.将离心纯化柱置于新的离心管中。

6.加入30µl超纯水，在室温下静置5分钟。

7.16,000g离心1分钟，管底溶液即为所纯化过的cdna双链。

d.大肠杆菌dh5α感受态细胞的制备：

1.挑取单个dh5α菌落，接种于3m1不含氨苄青霉素的lb培养基中，37°c培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50m1lb培养液中，37°c振荡2小时。当od600值达到0.35时，收获细菌培养物。

2.将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50m1聚丙烯管中，在冰上方置10min，使培养物冷却至0°c。

3.于4°c以4100r/min离心10min，以回收细胞。

4.倒出培养液，将管倒置lmin以使最后的痕量培养液流尽。

5.每50ml初始培养液且30ml预冷的0.1mol/lcacl2-mgcl2溶液（80mmol/lmgcl2,20mmol/lcacl2）重悬每份细胞沉淀。

6.于4°c以4100r/min离心10min，以回收细胞。

7.倒出培养液，将管倒置lmin以使最后的痕量培养液流尽。

8.每50m1初始培养物用2m1用冰预冷的0.1mol/lcacl2重悬每份细胞沉淀，分装后备用。

e.酶切、连接以及连接产物的转化：

1.在微量离心管中加入1μltakarapuc19载体、4μl白线霜足蛛cdna双链溶液，全量为5μl。

2.加入5μl（等量）的连接酶缓冲混合物。

3.16°c反应2小时。

4.全量（10μl）加入至100μldh5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。

5.42°c水浴热休克90秒钟后，迅速放入冰上2分钟。

6.加入300mlsoc培养基（不含抗生素），置于37℃摇床，转速200rpm，复苏45min。

7.菌液涂布于15cm培养皿上（apr-iptg/x-gallb固体培养基），37℃过夜。

8.每个lb平皿用5m1lb液体培养基洗涤菌落，加30%甘油冻存。构建的cdna大约含1×10⁶个单独克隆。

2.5、白线霜足蛛毒素μ-trtx-ca1a基因克隆筛选：

扩增引物长度为17个核苷酸其序列为5’-gcgaaaaatggaaatct-3’，pcr另一扩增引物为clontech公司smart^tmcdnalibraryconstructionkit中的3’pcrprimer引物，其序列为5＇attctacaggccgaggcggccgacatg3＇。

pcr反应在如下条件下进行：94℃30秒钟，68℃30秒钟和72℃1分钟，30个循环。

将扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，切取目的条带，用dna纯化试剂盒

进行纯化。将纯化的目的片段连接到puc19载体中，即得连接产物。将连接产物转化预先制备好的大肠杆菌dh5α感受态细胞。最后，取适量转化产物涂布至含amp的lb平板上，经37℃培养16h形成的单菌落即为含目的片段的阳性克隆。

挑取单菌落用m13引物检测插入片段的大小。挑选含目的片段的阳性克隆送dna测序公司测序。

白线霜足蛛毒素μ-trtx-ca1a的氨基酸序列和基因序列如图2所示。

3、白线霜足蛛毒素μ-trtx-ca1a对电压门控钠通道nav1.2-nav1.9活性

细胞转染：

（1）培养hek293t细胞，当细胞密度达到80-90%时，弃培养液，用pbs漂洗一次，加入2ml无血清培养基（opti-mem）。

（2）配制a液：250µl无血清培养基+4ugdna，轻轻混合均匀，室温静置5分钟。

（3）配制b液：250µl无血清培养基+8µllipfectamine2000，轻轻混合均匀，室温静置5分钟。

（5）将a液与b液轻轻混匀，室温下静置20min。

（6）将dna-脂质体混匀后，轻轻滴加入细胞中。

（7）4-6小时后，更换含有血清的全培养基。

活性检测：

实验前将细胞外液从冰箱取出恢复室温，更换培养皿内的培养液。更换溶液时动作要轻柔，防止细胞从培养皿底部脱落。倒置显微镜下选择细胞膜较为光滑、细胞质均匀的细胞，在室温20～25℃条件下进行膜片钳实验。选用硼硅酸盐玻璃毛细管为玻璃电极材料，玻璃电极在拉制仪(pc-10，narishige)上经两步拉制而成，拉制完成后在玻璃电极内灌细胞内液。玻璃电极入水电阻为1.5～2.5mω。待电极与细胞膜之间形成高阻抗的京欧（gω）封接后，补电极快电容，转换为全细胞记录模式，给予细胞一短促而有力的负压，将钳制在电极中的细胞膜迅速打破，再补偿细胞慢电容。将细胞钳制为-100mv，细胞稳定4～6min开始记录电流。系统电阻(rs)在实验过程中始终保持在5～10mω的范围之内，基本维持不变，系统串联电阻（rseriescompensation）补偿80%。

4、白线霜足蛛μ-trtx-ca1a的镇痛效果

4.1福尔马林镇痛实验

icr小鼠（18~22g），分为五组（n=8）。白线霜足蛛毒素μ-trtx-ca1a冻干粉溶解于无菌生理盐水，采用肌肉注射方式给药，给药30min后，于小鼠右后足趾注射5%福尔马林溶液20μl，立即开始计时注射福尔马林后小鼠添足时间，每隔5min记录一次总时间，连续记录40min。对照组给予同样体积的无菌生理盐水。观察记录各组小鼠注射福尔马林40min之内的舔足时间。实验数据，采用t检验比较各组的显著性差异。

醋酸扭体法镇痛实验

icr小鼠（18~22g），分为五组（n=8）。白线霜足蛛毒素μ-trtx-ca1a冻干粉溶解于无菌生理盐水，采用腹腔注射方式给药，在μ-trtx-ca1a注射15min后，采用腹腔注射方式给小鼠注射200μl1%的乙酸，计数小鼠注射乙酸后30min的扭体次数。

热板法镇痛实验

本实验前需将小鼠做实验前筛选，剔除对热不敏感和对热过于敏感的个体，选择能够受热5-30s的个体进行实验，并求出基础疼痛阈值。放置小鼠于55±0.1℃的恒温板上，观察记录小鼠从放入到舔后足所需时间，以此作为疼痛阈值。小鼠随机分为五组（n=8）。白线霜足蛛毒素μ-trtx-ca1a冻干粉溶解于无菌生理盐水，采用腹腔注射方式给药,分别在μ-trtx-ca1a注射后30min,60min,90min和120min测定小鼠的痛阈。对照组给予同样体积的无菌生理盐水。实验数据，采用t检验比较各组的显著性差异。

序列表

<110>湖南师范大学

<120>钠通道阻断剂μ-trtx-ca1a作为镇痛药物的应用

<130>1

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>34

<212>prt

<213>cyriopagopusalbostriatus

<400>1

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151015

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