大豆抗疫霉病相关基因GmLMM1的应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及大豆抗疫霉病相关基因gmlmm1在调控植物细胞死亡、植物pti免疫反应和疫霉病抗性中的应用。

背景技术：

大豆疫霉病是大豆生产上最具危害性的病害之一，严重危害大豆的生产。目前，由于大豆抗病机制方面技术方法的缺乏，导致大豆疫霉病病原菌的防治主要依靠选用抗病品种。大豆疫霉菌毒力结构复杂，生理小种进化速度快，而常规的品种培育周期长，效率低，很难满足生产的需求。因此，利用抗病基因工程育种是解决该难题的最有效途径。

大豆疫霉菌侵染寄主，破坏根部组织，并向茎蔓延，该病原物在潮湿的环境以及厚重的黏土中生长。目前，大豆疫霉菌的研究仅集中在大豆疫霉菌自身的毒性机制研究，而与大豆抗疫霉菌相关的基因的研究较少。大豆疫霉菌侵染过程的细胞生物学及大豆疫霉菌和大豆间的分子识别机理还有待更深入的挖掘。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供大豆gmlmm1在调控植物细胞死亡、植物pti免疫反应和疫霉病抗性中的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明通过筛选大豆突变体库获得了一个与抗病相关的类病斑突变体，经图位克隆将目标基因定位在13号染色体的15.08mb-15.21mb之间，经测序分析获得了目标基因，将其命名为gmlmm1(glycinemaxlesionmimicmutant)，其编码蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示，cds序列如seqidno.2所示。本发明发现gmlmm1负调控植物pti免疫反应以及疫霉病抗性。

第一方面，本发明提供大豆gmlmm1蛋白或其编码基因或大豆gmlmm1蛋白的编码基因的抑制因子在调控植物疫霉病抗性中的应用。

第二方面，本发明提供大豆gmlmm1蛋白或其编码基因或大豆gmlmm1蛋白的编码基因的抑制因子在调控植物pti免疫反应中的应用。

第三方面，本发明提供大豆gmlmm1蛋白或其编码基因或大豆gmlmm1蛋白的编码基因的抑制因子在调控植物细胞死亡或活性氧爆发中的应用。

上述应用中，通过降低植物中所述gmlmm1蛋白的编码基因的表达量，提高植物的疫霉病抗性、增强的植物pti免疫反应或促进植物细胞死亡或活性氧爆发。

第四方面，本发明提供大豆gmlmm1蛋白或其编码基因、或大豆gmlmm1蛋白的编码基因的抑制因子在植物遗传育种或转基因植物制备中的应用。

优选地，所述转基因植物为抗病转基因植物。更优选为抗疫霉病转基因植物。

本发明中，所述大豆gmlmm1蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如seqidno.1所示的氨基酸序列；

(2)如seqidno.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)与如seqidno.1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少90％；更优选为95％。

本发明中，所述大豆gmlmm1蛋白的cds具有如下任一种核苷酸序列：

(1)如seqidno.2所示的核苷酸序列；

(2)如seqidno.2所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列。

上述如seqidno.1所示的氨基酸序列为大豆gmlmm1蛋白的氨基酸序列，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到与本发明公开的gmlmm1蛋白具有相同活性的gmlmm1蛋白的突变体。

上述如seqidno.2所示的核苷酸序列为大豆中gmlmm1蛋白的cds序列。本发明所述的gmlmm1蛋白的编码基因可以为任意能够编码上述gmlmm1蛋白的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

优选地，所述大豆gmlmm1蛋白的编码基因的抑制因子包括能够抑制大豆gmlmm1蛋白的编码基因表达的干扰rna或grna。

作为示例，本发明提供一种用于抑制(失活)大豆gmlmm1蛋白的编码基因表达的grna，所述grna包含如seqidno.3所示的核苷酸序列。该grna可与cas9等基因编辑工具配合作用，实现大豆gmlmm1蛋白的编码基因的敲除或降低表达量。

上述gmlmm1蛋白或其编码基因或大豆gmlmm1蛋白的编码基因的抑制因子的应用可以gmlmm1蛋白或其编码基因或大豆gmlmm1蛋白的编码基因的抑制因子本身的形式应用，或者以含有gmlmm1蛋白的编码基因或其抑制因子的表达盒、载体、含有所述表达盒或所述载体的宿主细胞的形式应用。

第五方面，本发明提供一种调控植物疫霉病抗性的方法，包括：调控植物中大豆gmlmm1蛋白的编码基因的表达量；

所述大豆gmlmm1蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如seqidno.1所示的氨基酸序列；

(2)如seqidno.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)与如seqidno.1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少90％；更优选为95％。

优选地，上述方法包括：通过降低所述植物中gmlmm1蛋白的编码基因的表达量，提高所述植物的疫霉病抗性。

上述降低植物中gmlmm1蛋白的编码基因的表达量可通过本领域常规技术手段实现，例如：利用crispr/cas9技术敲除植物中gmlmm1蛋白的编码基因。

优选地，本发明利用crispr/cas9技术，以如seqidno.3所示的核苷酸序列为grna敲除植物中gmlmm1蛋白的编码基因，利用该方法能够显著提高植物中gmlmm1蛋白的编码基因的敲除效率。

本发明中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述植物包括但不限于大豆、拟南芥、小麦、水稻、玉米、棉花、花生等。

本发明的有益效果在于：

本发明首次在大豆中克隆了参与大豆细胞死亡、免疫反应和疫霉病抗性调控的gmlmm1基因。gmlmm1基因能够负调控植物pti免疫反应和疫霉病抗性：通过降低gmlmm1基因的表达量，能够有效增强植物pti免疫反应，提高植物的疫霉病抗性(降低疫霉菌的易感性和发病情况)；而提高植物中gmlmm1基因的表达量，会显著抑制植物细胞死亡和活性氧爆发。gmlmm1基因的克隆和功能发现是大豆抗疫霉病机理探究里程中的突破性进展，为抗疫霉病相关机制研究提供了重要的基因基础及理论支持，为推进植物防御系统的研究和应用以及培育高抗病的大豆新品种提供宝贵的基因资源，gmlmm1基因及其抑制因子在大豆抗病基因工程育种中具有重大的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中野生型williams82叶片与gmlmm1突变体叶片的表型比较。

图2为本发明实施例2中gmlmm1基因在大豆13号染色体上的定位。

图3为本发明实施例3中接种大豆疫霉菌p.sojae7076菌丝块60小时后的侵染观察。

图4为本发明实施例3中接种大豆疫霉菌p.sojae7076菌丝块60小时后的病斑形成面积，其中，**代表在p<0.01水平上差异显著。

图5为本发明实施例3中接种大豆疫霉菌p.sojae7076游动孢子36小时后的根毛侵染观察。

图6为本发明实施例4中gmlmm1抑制xeg1诱发的细胞死亡；其中，a为经疫病菌模式分子xeg1或gfp处理瞬时表达gfp或gmlmm1蛋白的烟草叶片后的细胞死亡情况，gfp代表对照组，xeg1代表疫病菌模式分子，gmlmm1-ha代表gmlmm1蛋白；b为westernblot检测gmlmm1的表达情况，其中，gmlmm1-ha代表gmlmm1蛋白，rubisco为内参。

图7为本发明实施例4中gmlmm1抑制flg22诱发的活性氧爆发；其中，a为经1umolflg22或水处理瞬时表达gfp或gmlmm1蛋白的烟草叶片后的活性氧爆发情况，gfp代表对照组，gmlmm1-ha代表实验组，h2o代表采用h2o处理的空白对照组，flg22代表采用小肽处理；b为westernblot检测gmlmm1的表达情况，其中，gmlmm1-ha代表gmlmm1蛋白，rubisco为内参。

图8为本发明实施例5中利用crispr/cas9敲除gmlmm1基因后植株叶片出现类病斑表型。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1gmlmm1突变体群体的构建及表型分析

通过筛选经ems诱变williams82获得的突变体库，获得突变体gmlmm1，其叶片出现类病斑表型(图1)，连续自交种植4代进行背景纯化。通过与远源品种“菏豆12”杂交构建了用于图位克隆的f2分离群体，表型观察及统计分析表明其稳定遗传、符合孟德尔遗传定律(3:1分离比)，表明gmlmm1突变体表型是隐性单基因控制。

实施例2大豆抗疫霉病相关基因gmlmm1的定位

采用gmlmm1与“菏豆12”杂交的f2分离群体进行基因定位。粗定位结果表明，突变位点位于13号染色体15.06mb-17.65mb之间。为进一步确定gmlmm1突变体基因的位置，在13号染色体15.06mb-17.65mb之间区域设计新的indel分子标记对突变体单株进行精细定位，最后将gmlmm1基因定位在13号染色体的15.08mb-15.21mb之间131kb区间(图2)。此131kb区间内，共有13个候选基因，结合全基因组重测序结果发现，在该131kb区间内只有glyma.13g054400即gmlmm1基因(编码蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示，cds序列如seqidno.2所示)的第二个外显子区域内存在单碱基g到a的突变，其突变位点的物理位置为15166020bp,该碱基突变导致氨基酸编码提前终止(图2)。因此，推断gmlmm1突变体的叶片出现类病斑表型是由gmlmm1基因突变所导致的。

实施例3gmlmm1突变体抗疫霉病表型鉴定

采用大豆疫霉菌p.sojae7076菌丝块接种野生型“williams82”叶片与gmlmm1突变体叶片，侵染60小时后观察病斑形成大小及台盼蓝染色观察侵染差异(图3)，观察统计发现gmlmm1突变体与野生型相比，其抗性水平显著提高。进一步对菌丝块侵染60小时后病斑形成面积进行统计，发现突变体gmlmm1的病斑面积要显著小于野生型“williams82”病斑面积(图4)。

采用大豆疫霉菌p.sojae7076游动孢子侵染大豆突变体gmlmm1及野生型“williams82”的根毛，生长3d左右的疫霉诱导游动孢子，待孢子液浓度为104-105，用2ml孢子液侵染长势基本一致的根毛20min，取出根毛放置25度36h，观察根毛侵染情况，发现野生型“williams82”根毛更容易被侵染(图5)，以上实验结果说明gmlmm1突变体具有抗大豆疫霉病的特性。因此，推测gmlmm1基因可能参与了植物免疫反应调控。

实施例4gmlmm1基因抑制植物pti免疫反应

利用农杆菌注射烟草瞬时表达gfp(对照组)和gmlmm1(实验组)，24小时后分别注射病原相关模式分子xeg1(实验组)及gfp(对照组)，发现gmlmm1抑制xeg1诱导的细胞死亡(图6)。

利用农杆菌注射烟草瞬时表达gfp(对照组)和gmlmm1(实验组)，24小时后用病原相关模式分子flg22小肽分别处理，检测处理后的活性氧爆发情况，发现gmlmm1抑制flg22诱导的活性氧爆发(图7)。以上实验说明gmlmm1基因能够抑制pti免疫反应中的细胞死亡及活性氧爆发，负调控植物的pti免疫反应。

实施例5cas9技术敲除gmlmm1基因

构建gmu6启动子驱动grna(序列如seqidno.3所示)和gmubi3启动子驱动cas9蛋白的crispr/cas9重组质粒，通过农杆菌介导的遗传转化系统将重组质粒导入野生型东农50大豆中。经遗传转化，最终获得t1代转基因植株，可看到gmlmm1基因敲除后其叶片出现类病斑表型(图8)。该遗传转化实验结果进一步说明gmlmm1基因在免疫反应中的重要作用。gmlmm1的新功能的发现为植物遗传育种提供了宝贵的基因资源。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120>大豆抗疫霉病相关基因gmlmm1的应用

<130>khp191115423.7

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>896

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<210>2

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