小麦抗逆蛋白TaBZR2D及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及小麦抗逆蛋白tabzr2d及其编码基因与应用。
背景技术：
：干旱、高盐及低温等逆境胁迫是影响小麦生长、发育的障碍因子。因此，了解小麦对逆境条件的应答与信号传导机制，提高小麦品种的抗逆性，成为小麦遗传研究及小麦品种改良的重要任务之一。在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。目前发现植物的耐盐抗旱胁迫信号网络中主要有植物激素信号途径、脂质体信号途径、snrk2(sucrosenon-fermenting1-relatedproteinkinase2)和mapk(mitogen-activatedproteinkinase)信号途径、ros(reactiveoxygenspecies)信号途径以及气孔信号途径。这些信号网络系统将植物的激素调节、新陈代谢、能量供应以及生长发育密切联系在一起。这说明植物对高盐干旱等胁迫的适应，不仅依赖于耐逆相关基因的表达，还依赖于由干旱和高盐等胁迫诱导引发的各种信号通路的综合调控作用。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，转录因子在调节植物胁迫相关基因表达的过程中起着重要作用。当非生物胁迫来临时，转录因子在植物体内活性的变化，使其调控的靶基因的活性也发生相应的改变，即在转录及蛋白水平的表达量发生改变。也就是说，在非生物胁迫刺激植物体的时候，在细胞膜外二级信号分子就会产生，然后该信号分子会刺激细胞内膜使磷酸化蛋白分子相继产生，继而启动转录因子，使其活性增加来调控功能基因。典型的植物转录因子的结构是由dna结合区、转录调控域、寡聚化位点及核定位信号构成。dna结合区(dna-bindingdomain)是指转录因子识别dna顺式作用元件并与之结合的一段氨基酸序列，相同类型转录因子dna结合区的氨基酸序列较为保守。转录调控域(transcriptionregulationdomain)包括两类，一类为转录激活域；一类为转录抑制域，它们决定着转录因子的功能差异。寡聚化位点(oligomerizationsite)是不同转录因子借以发生相互作用的功能域。它们的氨基酸序列很保守，大多与dna结合区相连并形成一定的空间构象。根据转录因子与其相应的顺式元件(核酸序列)结合的特征将抗逆性相关的转录因子划分成若干个不同的家族，主要包括myb类、wrky类、ap2/erebp类和bzip类等。最近研究发现植物激素油菜素内酯(brs)在植物生长发育和抵抗非生物胁迫方面扮演着重要的角色。在干旱胁迫条件下，对植物喷施brs能促进渗透保护物质合成，降低细胞膜损伤和提高抗氧化物酶活性，从而降低逆境对植物的损伤，提高植物在干旱条件下的存活率。对水稻和小麦喷施油菜素内酯不仅能提高作物抗逆性，还能增加逆境条件下生物量的积累，从而提高产量。植物bes类转录因子是植物特有的一类与br信号传递相关的转录因子。bes类转录因子能与e-box(canntg)元件结合调控下游基因的表达，参与植物生长发育和非生物胁迫响应。综合目前的研究结果，植物bes类转录因子在植物各个的生命活动中都扮演着重要的角色。这也充分体现了bes类转录因子的生物学功能具有多样性，涉及胚胎形成、光合作用、开花时间调控及各种胁迫响应等重要生理过程。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何调控植物耐逆性。为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与植物耐逆性相关的蛋白。本发明所提供的与植物耐逆性相关的蛋白来源于麦类小麦属(triticumaestivuml.)，名称为tabzr2d，为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。其中，序列2由333个氨基酸残基组成。为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述c)中的蛋白质tabzr2d，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白质tabzr2d可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述c)中的蛋白质tabzr2d的编码基因可通过将序列1所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。为解决上述技术问题，本发明又提供了与tabzr2d蛋白质相关的生物材料。本发明提供的与tabzr2d蛋白质相关的生物材料为下述a1)至a12)中的任一种：a1)编码tabzr2d蛋白质的核酸分子；a2)含有a1)所述核酸分子的表达盒；a3)含有a1)所述核酸分子的重组载体；a4)含有a2)所述表达盒的重组载体；a5)含有a1)所述核酸分子的重组微生物；a6)含有a2)所述表达盒的重组微生物；a7)含有a3)所述重组载体的重组微生物；a8)含有a4)所述重组载体的重组微生物；a9)含有a1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；a10)含有a2)所述表达盒的转基因植物细胞系；a11)含有a3)所述重组载体的转基因植物细胞系；a12)含有a4)所述重组载体的转基因植物细胞系。上述生物材料中，a1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：1)其编码序列是序列1所示的cdna分子或基因组dna分子；2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码tabzr2d蛋白质的cdna分子或基因组dna分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码tabzr2d蛋白质的cdna分子或基因组dna分子。其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。其中，序列1由1002个核苷酸组成，编码序列2所示的氨基酸序列。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码tabzr2d的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的tabzr2d的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码tabzr2d且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，a2)所述的含有编码tabzr2d的核酸分子的表达盒(tabzr2d基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达tabzr2d的dna，该dna不但可包括启动tabzr2d转录的启动子，还可包括终止tabzr2d转录的终止子。进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv35s终止子、tml终止子及豌豆rbcse9终止子。可用现有的表达载体构建含有所述tabzr2d基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2300、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptii基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。在本发明中，所述重组表达载体为将上述tabzr2d基因插入pcambia1302载体或pwmb111载体中得到的重组载体。上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。为解决上述技术问题，本发明还提供了tabzr2d蛋白质或上述生物材料的新用途。本发明提供了tabzr2d蛋白质或上述生物材料在调控植物耐逆性中的应用。上述应用中，所述调控为提高。本发明还提供了tabzr2d蛋白质或上述生物材料在培育耐逆性提高的转基因植物中的应用。本发明还提供了tabzr2d蛋白质或上述生物材料在植物育种中的应用。上述应用中，所述耐逆性为耐旱性；所述提高植物耐旱性具体体现在如下(1)-(6)中任一种：(1)在干旱条件下，提高植物存活率；(2)在干旱条件下，提高植物根长和/或总根长和/或主根长；(3)在干旱条件下，提高植物总鲜重和/或地上鲜重和/或地下鲜重；(4)在干旱条件下，提高植物侧根数；(5)在干旱条件下，降低植物电解质渗透率和/或丙二醛含量；(6)在干旱条件下，提高植物脯氨酸含量。所述干旱为peg处理或控水处理。peg处理的浓度具体为6％、10％、12％或25％。所述peg具体为peg6000。上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥；所述拟南芥具体可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。所述单子叶植物具体可为小麦；所述小麦具体可为小麦fielder。为解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法。本发明提供的培育耐逆性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中tabzr2d蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。上述方法中，所述提高受体植物中tabzr2d蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达tabzr2d蛋白质。上述方法中，所述过表达的方法为将tabzr2d蛋白质的编码基因导入受体植物；所述tabzr2d蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的dna分子。在本发明的一个实施方式中，tabzr2d蛋白质的编码基因(即序列1所示的核苷酸)通过含有tabzr2d蛋白质的编码基因的表达盒的重组载体pcambia1302-tabzr2d导入受体植物中。所述重组载体pcambia1302-tabzr2d为将序列表中序列1所示的tabzr2d基因插入pcambia1302载体的ncoi酶切位点间，且保持pcambia1302载体的其他序列不变后得到的载体。在本发明的另一个实施方式中，tabzr2d蛋白质的编码基因(即序列1所示的核苷酸)通过含有tabzr2d蛋白质的编码基因的表达盒的重组载体pwmb111-tabzr2d导入受体植物中。所述重组载体pwmb111-tabzr2d为将序列表中序列1所示的tabzr2d基因插入pwmb111载体的bamhi酶切位点间，且保持pwmb111载体的其他序列不变后得到的载体。上述方法中，所述耐逆性为耐旱性。所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现在如下(1)-(6)中任一种：(1)转基因植物的存活率高于受体植物；(2)转基因植物的根长和/或总根长和/或主根长长于受体植物；(3)转基因植物的总鲜重和/或地上鲜重和/或地下鲜重高于受体植物；(4)转基因植物的侧根数多于受体植物；(5)转基因植物的电解质渗透率和/或丙二醛含量低于受体植物；(6)转基因植物的脯氨酸含量高于受体植物。上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述tabzr2d基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥；所述拟南芥具体可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。所述单子叶植物具体可为小麦；所述小麦具体可为小麦fielder。通过实验证明：本发明发现的tabzr2d基因在干旱诱导下表达，且将tabzr2d基因导入拟南芥和小麦中得到的转基因拟南芥和转基因小麦，其对干旱逆境的抗性高于野生型拟南芥和野生型小麦。本发明提供的蛋白和基因为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物中发挥重要的作用。附图说明图1为转tabzr2d拟南芥和野生型拟南芥(wt)的干旱表型鉴定及生理指标的测定。图2为转tabzr2d小麦和野生型小麦(wt)的干旱表型鉴定及生理指标的测定。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。下述实施例中的普通小麦(triticumaestivuml.)品种小白麦记载于文献“孙海桃等，小麦tadreb6转录因子互作蛋白的筛选，中国农业科学，2011,44(22)：4740-4747.”中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用；公众也可从国家种质资源库获得(编号为zm242)。下述实施例中的pwmb111载体记载于文献“zhang,n.,yin,y.,liu,x.,tong,s.,xing,j.,zhang,y.,pudake,r.n.,izquierdo,e.m.,peng,h.,xin,m.,hu,z.,ni,z.,sun,q.,andyao,y.(2017).thee3ligasetasap5altersdroughtstressresponsesbypromotingthedegradationofdripproteins.plantphysiol175,1878-1892.”中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。实施例1、tabzr2d的克隆一、植物材料的处理将水培生长10天左右的小白麦(triticumaestivumcv.xiaobaimai)三叶期整株幼苗用浓度为15％的peg6000溶液浸泡处理2小时，并将处理后的幼苗用液氮速冻，-80℃保存备用。二、总rna的提取采用trizol法(tiangen)提取步骤一获得的处理后的小白麦幼苗叶片的总rna。三、cdna的获得第一链cdna合成用反转录酶xl(amv)。采用smart法合成dscdna，pcr产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。通过5’race和3’race的方法获得序列表中的序列1。上述序列1也可以通过人工合成的方式获得。将序列表中序列1所示的基因命名为tabzr2d基因，其开放阅读框架为自序列表的序列1的5′端第1-1002位核苷酸，将该基因编码的蛋白命名为tabzr2d蛋白，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2，由333个氨基酸残基组成。实施例2、转tabzr2d拟南芥的获得及其耐逆性分析一、转tabzr2d拟南芥的获得1、重组表达载体的构建(1)tabzr2d基因的克隆提取小白麦叶片总rna，反转录得到cdna，以cdna模板，采用引物对tabzr2d-1302f和tabzr2d-1302r进行扩增，得到pcr产物。引物序列如下(下划线标注的碱基序列为ncoi酶切识别位点序列)：tabzr2d-1302f：5'-gactcttgaccatggtaatgccgacgtgcagggagag-3'(序列3)；tabzr2d-1302r：5'-gtcagatctacccatggcgctcctcgtcctggagcttcc-3(序列4)。将pcr产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，其大小为1.002kb。并将该pcr产物进行测序，结果表明该pcr产物具有序列表中序列1，即为tabzr2d基因。采用agarosegeldnapurificationkitver.2.0(takara公司，codeno.:dv807a)回收纯化大小为1.002kb的pcr产物。(2)用限制性内切酶ncoi酶切步骤(1)回收纯化的pcr产物，回收酶切产物；用限制性内切酶ncoi酶切pcambia1302载体(购自cambia公司)，回收载体骨架；将酶切产物和载体骨架连接，得到连接产物。(3)将步骤(2)获得的连接产物热击转化top10菌株(tiangen，cb104-03)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆提取质粒进行测序。测序结果表明，该质粒为将序列表中的序列1所示的tabzr2d基因插入pcambia1302载体的ncoi酶切位点间，且保持pcambia1302载体的其他序列不变后得到的载体，并将其命名为pcambia1302-tabzr2d。2、重组菌的构建(1)将步骤1获得的重组质粒pcambia1302-tabzr2d转化农杆菌gv3101(购自北京拜尔迪生物技术公司)，得到重组农杆菌。(2)提取重组农杆菌的质粒送去测序，结果表明该质粒为pcambia1302-tabzr2d，证明该重组菌为阳性重组农杆菌，并将其命名为gv3101/pcambia1302-tabzr2d。3、转tabzr2d拟南芥的获得(1)将重组农杆菌gv3101/pcambia1302-tabzr2d接种于yep液体培养基中，28℃、3000rpm培养约30小时。(2)将步骤(1)获得的菌液转至yep液体培养基(含50μg/ml利福平及卡那)中，28℃、300rpm培养约14小时(菌液od600达到1.5-3.0)。(3)收集菌体，4℃、4000g离心10min，用10％蔗糖(含0.02％silwet)稀释至od600约为1.0。(4)将拟南芥哥伦比亚生态型col-0(美国拟南芥信息资源网，以下简称为野生型拟南芥，购自salk公司)整株与花盆一起倒扣在盛有步骤(3)的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，混收t0代转tabzr2d拟南芥种子。将t0代转tabzr2d拟南芥种子播种到含有50mg/ml潮霉素的ms培养基上进行培养，得到10株t1代转tabzr2d拟南芥幼苗。采用同样的方法将空载体pcambia1302转入野生型拟南芥，得到t1代转空载体拟南芥。分别将t1代转tabzr2d拟南芥和t1代转空载体拟南芥播种、自交，直到得到t3代转tabzr2d拟南芥和t3代转空载体拟南芥。(5)提取t3代转tabzr2d拟南芥植株的基因组dna，以tabzr2d-1302f和tabzr2d-1302r为引物进行pcr检测，得到条带大小为1.002kb的阳性t3代转tabzr2d拟南芥植株。提取t3代转空载体拟南芥的基因组dna，以tabzr2d-1302f和tabzr2d-1302r为引物进行pcr扩增，没有得到大小为1.002kb的目的片段，说明t3代转空载体拟南芥构建成功。(6)提取t3代转tabzr2d拟南芥植株和野生型拟南芥的总rna，反转录得到cdna，以cdna模板，分别采用引物(tabzr2d-rtf1和tabzr2d-rtr1)和(atactinf和atactinr)进行扩增，得到pcr产物。同时以atactin作为内参基因。引物序列如下：tabzr2d-rtf1：5'-tcgtcaaacccattcagcgt-3'；tabzr2d-rtr1：5'-actcgtcagaaaccacgtcca-3'；atactin-rtf：5'-ctccgtgttgctcctgaggaacatc-3'；atactin-rtr：5'-acctcaggacaacggaatcgctc-3'。对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，部分结果如图1c所示。从图中可以看出：野生型拟南芥植株的rt-pcr无扩增产物，而t3代转tabzr2d拟南芥纯合株系#1、#3和#7均可以扩增出目的条带，表明外源基因tabzr2d不但已顺利整合到拟南芥的基因组上，而且能够在转基因拟南芥中正常转录表达。选取t3代转tabzr2d拟南芥纯合株系#1、#3和#7用于下一步的耐逆性分析。二、转tabzr2d拟南芥的耐逆性分析1、分别将编号为#1、#3和#7的t3代转tabzr2d拟南芥种子、t3代转空载体拟南芥种子和野生型拟南芥种子(wt)播种在ms培养基上培养，生长10天后，再将t3代转tabzr2d拟南芥、t3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥幼苗转移至含有不同浓度的peg6000(6％、10％和15％)的ms培养基上生长7天。观察在含有不同浓度peg6000的ms培养基上生长7天和10天后的生长状态并统计生长7天后的主根长、侧根长、侧根数、存活率和总鲜重。每个株系10棵，实验重复三次，结果取平均值。结果如图1b、d、e、f、g和h所示，从图中可以看出，编号为#1、#3和#7的t3代转tabzr2d拟南芥在6％和10％peg6000胁迫下，长势均优于野生型拟南芥(wt)，主根长、侧根长、侧根数和总鲜重均显著高于野生型拟南芥(wt)。编号为#1、#3和#7的t3代转tabzr2d拟南芥在15％peg6000胁迫下，存活率显著高于野生型拟南芥(wt)。t3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥的结果无显著差异。2、分别将编号为#1、#3和#7的t3代转tabzr2d拟南芥种子、t3代转空载体拟南芥种子和野生型拟南芥种子(wt)播种在ms培养基上培养，生长20天后进行干旱处理，处理方法如下：先控水处理一周，然后再复水一周。干旱处理后观察各植株的生长状态并统计存活率。每个株系10个，实验重复三次，结果取平均值。结果如图1a、d所示。从图中可以看出，编号为#1、#3和#7的t3代转tabzr2d拟南芥在干旱处理后，t3代转tabzr2d拟南芥的长势均优于野生型拟南芥(wt)，处理一周后野生型拟南芥(wt)及转tabzr2d拟南芥均出现萎蔫甚至死亡的现象，但转tabzr2d拟南芥的长势依然优于野生型拟南芥(wt)，且复水一周后转tabzr2d拟南芥存活率为40％以上，而野生型拟南芥(wt)的存活率仅为20％。t3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥的结果无显著差异。实施例3、转tabzr2d小麦的获得及其耐逆性分析一、转tabzr2d小麦的获得1、重组表达载体的构建(1)tabzr2d基因的克隆提取小白麦叶片总rna，反转录得到cdna，以cdna模板，采用引物对tabzr2d-111f和tabzr2d-111r进行扩增，得到pcr产物。引物序列如下(下划线标注的碱基序列为bamhi酶切识别位点序列)：tabzr2d-111f：5'-ggtcgactctagaggatccatgccgacgtgcagg-3'(序列5)；tabzr2d-111r：5'-cgagggtacccggggatccgctcctcgtcctggagc(序列6)。将pcr产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，其大小为1.002kb左右。并将该pcr产物进行测序，结果表明该pcr产物具有序列表中序列1，即为tabzr2d基因。采用agarosegeldnapurificationkitver.2.0(takara公司，codeno.:dv807a)回收纯化大小为1.002kb的pcr产物。(2)用限制性内切酶bamhi酶切步骤(1)回收纯化的pcr产物，回收酶切产物；用限制性内切酶bamhi酶切pwmb111载体，回收载体骨架；将酶切产物和载体骨架连接，得到连接产物。(3)将步骤(2)获得的连接产物热击转化top10菌株(tiangen，cb104-03)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆提取质粒进行测序。测序结果表明，该质粒为将序列表中的序列1所示的tabzr2d基因插入pwmb111载体的bamhi酶切位点间，且保持pwmb111载体的其他序列不变后得到的载体，并将该质粒命名为pwmb111-tabzr2d。2、重组菌的构建(1)将步骤1获得的重组质粒pwmb111-tabzr2d转化农杆菌eha105(购自北京拜尔迪生物技术公司)，得到重组农杆菌。(2)提取重组农杆菌的质粒送去测序，结果表明该质粒为pwmb111-tabzr2d，证明该重组菌为阳性重组农杆菌，并将其命名为eha105/pwmb111-tabzr2d。3、转tabzr2d小麦的获得(1)将重组农杆菌eha105/pwmb111-tabzr2d接种于yep液体培养基中，28℃、3000rpm培养约30小时。(2)将步骤(1)获得的菌液转至yep液体培养基(含50μg/ml利福平及卡那)中，28℃、300rpm培养约14小时(菌液od600达到1.5-3.0)。(3)收集步骤(2)获得的菌体，4℃、4000g离心10min，用10％蔗糖(含0.02％silwet)稀释至od600约为1.0；(4)超净工作台内，用1ml注射器针头挑取农杆菌菌落，注射受体小麦fielder幼胚，然后将注射后的幼胚在无菌、高湿条件下培养，直至组培小麦苗长出，继续培养小麦苗，直至收获t0代转tabzr2d小麦种子。将t0代转tabzr2d小麦种子播种到含有50mg/ml除草剂的ms培养基上进行培养，得到10株t1代转tabzr2d小麦幼苗。采用同样的方法将空载体pwmb111转入野生型小麦，得到t1代转空载体小麦。分别将t1代转tabzr2d小麦和t1代转空载体小麦播种、自交，直到得到t3代转tabzr2d小麦和t3代转空载体小麦。(5)rt-pcr检测小麦阳性植株提取t3代转tabzr2d小麦(ubi-tabzr2d转基因小麦)和受体小麦叶片的总rna，反转录得到cdna，以cdna模板，分别采用引物(tabzr2d-rtf和tabzr2d-rtr)和(actinf和actinr)进行扩增，得到pcr产物。同时以actin作为内参基因。引物序列如下：tabzr2d-rtf：5'-tcgtcaaacccattcagcgt-3'；tabzr2d-rtr：5'-aattgcgggactctaatcata-3'；actinf-rtf：5'-ctccctcacaacaaccgc-3'；actinr-rtr：5'-taccaggaacttccataccaac-3'。将pcr产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，其大小为0.5kb左右。结果如图2b所示。从图中可以看出：野生型小麦植株的rt-pcr无扩增产物，而t3代转tabzr2d小麦纯合株系#705、#709和#711均可以扩增出目的条带，表明外源基因tabzr2d不但已顺利整合到小麦的基因组上，而且能够在转基因小麦中正常转录表达。选取t3代转tabzr2d小麦纯合株系#705、#709和#711用于下一步的耐逆性分析。二、转tabzr2d小麦的耐逆性分析1、分别将编号为#705、#709和#711的t3代转tabzr2d小麦种子、t3代转空载体小麦种子和野生型小麦种子(fielder)(wt)播种在霍格兰培养基上，生长5天后，再将t3代转tabzr2d小麦、t3代转空载体小麦和野生型小麦幼苗转移至含有不同浓度的peg6000(6％、10％、12％、25％)的霍格兰培养基上生长7天。观察在含有不同浓度peg6000的ms培养基上生长7天后的生长状态并统计地上鲜重和地下鲜重。每个株系10棵，实验重复三次，结果取平均值。结果如图2a、h和i所示，可以看出，编号为#705、#709和#711的t3代转tabzr2d小麦在不同浓度的peg6000处理后，转tabzr2d小麦株系的长势均优于野生型小麦(wt)，且地上鲜重和地下鲜重也均显著高于野生型小麦(wt)。t3代转空载体小麦和野生型小麦的结果无显著差异。2、分别将编号为#705、#709和#711的t3代转tabzr2d小麦种子、t3代转空载体小麦种子和野生型小麦种子(wt)播种在霍格兰培养基上，生长14天后进行干旱处理，处理方法如下：先控水处理10天，然后再复水一周。干旱处理后观察各植株的生长状态及统计存活率、地上部分鲜重、脯氨酸含量、mda含量和电解质渗透率。每个株系10颗，实验重复三次，结果取平均值。结果如图2a、c、d、e、f、g所示。从图中可以看出，编号为#705、#709和#711的t3代转tabzr2d小麦在干旱处理后，转tabzr2d小麦株系的长势均优于野生型小麦(wt)，处理10天后野生型小麦(wt)及转tabzr2d小麦均出现萎蔫甚至死亡的现象，但转tabzr2d小麦的长势依然优于野生型小麦(wt)，且复水一周后转tabzr2d小麦存活率为70％以上，而野生型的存活率仅为40％。且地上部分鲜重和脯氨酸含量也均显著高于野生型小麦(wt)，mda含量和电解质渗透率均显著低于野生型拟南芥(wt)。t3代转空载体小麦和野生型小麦的结果无显著差异。序列表<110>中国农业科学院作物科学研究所<120>小麦抗逆蛋白tabzr2d及其编码基因与应用<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>1002<212>dna<213>小麦（triticumaestivuml.）<400>1atgccgacgtgcagggagagggagaacaacaagcgcagggagcggcggcggcgcgcgatc60gccgccaagatattctccggcctgcgggcgcacggcgggtacaagctgcccaagcactgc120gacaacaacgaggtcctcaaggccctctgcaacgaggccggctgggtcgtcgagcccgac180ggcaccacctaccgcaagggatgcagacccgcagagcgcatggatgggattgggtgctca240gtgtcaccaagcccatgctcctcctatcagccgagtccgcgggcatcatacaatgcaagc300cctacttcctcttcattccccagcggcgcatcgtcgcccttcctcccgcattccaacaac360atggtaaatggcgtcgatgcaactcccatcctaccatggctccagacgttctccaattcg420acggcgtcgaataagcggccgcatcttcccccgctgctgattcacggtggctccattagc480gccccggtgactcctccactgagctcaccgactgctcgcacccctcgcatgaagacggac540tgggacgagtcggtgatccagccaccatggcatggttcaaacagtccctgcgtggtgaac600tccaccccgccgagccccgggcgtcagatggttcctgacccggcatggctggccggtatc660cagatctcgtcaacgagcccttcatcgcccaccttcagtctcatgtcgtcaaacccattc720agcgtcttcaaagaagcgattccgggcggtggttcgtcgaggatgtgcacgccagggcag780agcggcacctgctcgccggtgattcccggcatggcgcggcacccggacgttcacatgatg840gacgtggtttctgacgagtttgcgtttggaagcagcaccaacggcggcgctcagcaggcc900accgccggattggtgagggcgtgggagggcgagaggatccacgaggactccggatcggac960gagctggagctcactctcggaagctccaggacgaggagctga1002<210>2<211>333<212>prt<213>小麦（triticumaestivuml.）<400>2metprothrcysarggluarggluasnasnlysargarggluargarg151015argargalailealaalalysilepheserglyleuargalahisgly202530glytyrlysleuprolyshiscysaspasnasngluvalleulysala354045leucysasnglualaglytrpvalvalgluproaspglythrthrtyr505560arglysglycysargproalagluargmetaspglyileglycysser65707580valserproserprocyssersertyrglnproserproargalaser859095tyrasnalaserprothrserserserpheproserglyalaserser100105110propheleuprohisserasnasnmetvalasnglyvalaspalathr115120125proileleuprotrpleuglnthrpheserasnserthralaserasn130135140lysargprohisleuproproleuleuilehisglyglyserileser145150155160alaprovalthrproproleuserserprothralaargthrproarg165170175metlysthrasptrpaspgluservalileglnproprot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