本发明属于DNA分子标记
技术领域：
，涉及InDel标记技术，具体涉及一种矮秆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用。
背景技术：
：株高是影响植物倒伏、收获指数以及产量的重要农艺性状。在小麦中，至今发现25个矮化基因(30个等位位点)，其中9个来源于四倍体小麦。来源于我国新疆吐鲁番的矮秆波兰小麦(DwarfPolishWheat,2n＝4x＝28,AABB,TriticumpolonicumL.)携带一个隐性矮化基因Rht-dp。该基因位于4BS染色体，与4BS上已有的矮化基因Rht-B1非等位，前人将该基因初定位在4BS染色体上，但其遗传距离较大，不利于该基因的图位克隆。小麦植株高矮是决定小麦产量的重要因素之一，在小麦的育种过程中，不断发现和利用矮秆基因使得世界小麦产量得到了进一步增加。因此，矮秆基因的不断探索、挖掘、鉴定、研究和利用，对小麦高产育种意义重大。技术实现要素：本发明的目的是提供一种矮秆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用，该标记能够在苗期就快速区分波兰小麦的植株高矮，为小麦株高改良的育种工作提供了指导。为了达到上述目的，本发明提供了一种矮秆波兰小麦的InDel标记，该InDel标记是对矮秆波兰小麦基因组核苷酸序列中第109位到第116位核苷酸之间的核苷酸序列-ATGCACTG-进行标记。本发明还提供了一种矮秆波兰小麦InDel标记的核苷酸序列，该核苷酸序列处于矮秆波兰小麦基因组核苷酸序列中第109位到第116位核苷酸之间，其包含：序列-ATGCACTG-。本发明还提供了核苷酸序列在鉴定波兰小麦株高的应用，所述的核苷酸序列包含：序列-ATGCACTG-，通过InDel标记该核苷酸序列以鉴定波兰小麦的株高。优选地，在所述的InDel标记中，PCR扩增采用的上游引物包含如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列，采用的下游引物包含如SEDIDNO.2所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种InDel标记的上下游引物，上游引物包含如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列，下游引物包含如SEDIDNO.2所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种InDel标记核苷酸序列鉴定波兰小麦株高的方法，该方法包含：(1)提取波兰小麦DNA；(2)PCR扩增：采用的上游引物包含如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列，采用的下游引物包含如SEDIDNO.2所示的核苷酸序列；(3)扩增DNA片段检测分析：当扩增产物含有大小为110bp的片段时，小麦为矮秆波兰小麦；当扩增产物含有大小为102bp的片段时，小麦为高秆波兰小麦；当扩增产物为杂合带型时，小麦为高秆波兰小麦。其中，所述的矮秆波兰小麦基因中含有核苷酸序列-ATGCACTG-。优选地，在步骤(1)中，采用CTAB法提取基因组DNA。优选地，在所述的步骤(3)中，采用扩增DNA片段检测分析变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染进行检测分析。本发明还提供了一种鉴定波兰小麦株高的试剂盒，该试剂盒包含：具有如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列的上游引物，和具有如SEDIDNO.2所示的核苷酸序列的下游引物。本发明的矮秆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用，具有以下优点：(1)本发明的通过InDel标记小麦核苷酸序列-ATGCACTG-，鉴定标记的扩增条带特性，判断出植株的表型是高秆和矮秆，通过田间统计的株高数据，对于高矮秆植株株高的临界值(106cm)进行划分，用于指导小麦株高改良的育种工作；(2)本发明的分子标记不仅在苗期就能区分植株高矮秆，而且对于目标基因的定位有很大的帮助，极大的降低了劳动成本、节约了时间并且不受环境及人为因素的影响。附图说明图1为本发明实验例3InDel标记在矮秆波兰小麦×高秆波兰小麦F7代重组自交系中的分型结果。图2为本发明实验例3InDel标记在矮秆波兰小麦×高秆波兰小麦F2代重组自交系中的分型结果。具体实施方式以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。一种矮秆波兰小麦的InDel标记，该InDel标记是对矮秆波兰小麦基因组核苷酸序列中第109位到第116位核苷酸之间的核苷酸序列-ATGCACTG-进行标记。核苷酸序列-ATGCACTG-(名称：4BS-PMT2)作为InDel标记基，用于鉴定波兰小麦株高，当扩增产物含有SEDIDNO.1时，该矮秆波兰小麦；当扩增产物不含SEDIDNO.1时，小麦为高秆波兰小麦。具体地，当扩增产物的大小为110bp时，小麦为矮秆波兰小麦；当扩增产物的大小为102bp时，小麦为高秆波兰小麦；当扩增产物为杂合带型时，小麦为高秆波兰小麦。进一步地，在InDel标记中，PCR扩增采用的上游引物包含如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列，采用的下游引物包含如SEDIDNO.2所示的核苷酸序列。一种鉴定波兰小麦株高的试剂盒，该试剂盒包含：具有如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列的上游引物，和具有如SEDIDNO.2所示的核苷酸序列的下游引物，以对波兰小麦株高进行鉴定。本发明的InDel标记核苷酸序列鉴定波兰小麦株高的方法，具体如下：实验例1基因组DNA提取在幼苗期时，对矮秆波兰小麦×高秆波兰小麦重组自交系(F2和F7代)群体各单株挂牌标明株号并取其嫩叶，F2代编号1-26，F7代编号1-26，放入液氮中迅速冷冻，再放入-70℃超低温冰箱备用。对上述自交系群体F2和F7代分别提取总基因DNA，具体操作参照Doyle等(1987)的2×CTAB法(CTAB,hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵)，2×CTAB提取液的组成(1000mL)如下表1：表12×CTAB提取液的组成表注：EDTA为EthyleneDiamineTetraaceticAcid，即乙二胺四乙酸；Tris-HCl为三(羟甲基)氨基甲烷。基因组DNA提取的步骤，具体如下：(1)取1～2g幼嫩小麦叶片加液氮并迅速研磨成细粉，置入2mL离心管中加入预热至65℃的等体积2×CTAB缓冲液，加入β-疏基乙醇1μL，轻摇混匀；(2)65℃水浴1～2h，其间10～15min轻摇混匀一次；(3)冷却至室温后，加等体积的氯仿-异戊醇(体积比为24:1)，轻轻上下颠倒混匀至上清液呈牛奶状，12000rpm/min离心10min；(4)取上清液，加入等体积冰冷的异丙醇以沉淀(可提前放置于冰箱或制冰机中)，挑出DNA；(5)用70％酒精洗，无水乙醇洗，空气中干燥；(6)按照上表1中的Tris-HCl和EDTA的量配制1×TE(pH8.0)缓冲液，将步骤(5)干燥的DNA溶于适量的1×TE(pH8.0)缓冲液以备用；(7)用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测或用紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度。实验例2SSR(Simplesequencerepeat，简单序列重复)反应PCR反应的组分和用量，具体如下表2：表2PCR反应的组分和用量表注：2×TaqMasterMixforPAGE购自Vazyme公司。上下游引物，具体如下表3：表3上下游引物序列表PCR反应程序，具体如下表4：实验例3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染(1)药品配制8％聚丙烯酰胺PA：尿素420.42g、Acr(acrylamide，丙烯酰胺)80g、Bis(bisacrylamide，双丙烯酰胺)4.212g、10*TBE(Tris硼酸)100mL。10×TBE(2L)：Tris-base216g，硼酸110g，EDTA-Na214.88g，加超纯水定容至1L。Binding(亲和硅烷)：无水乙醇2mL，Binding原液8μL，冰醋酸8μL。Repel(剥离硅烷)：三氯甲烷100mL，Repel2mL。银染液：蒸馏水1500mL，无水乙醇150mL，硝酸银溶液(1g/mL)1500uL。显影液：蒸馏水1500mL，氢氧化钠30g，甲醛6mL，硫代硫酸(10mg/mL)300μL。(2)洗板和擦板电泳槽板先用无水乙醇擦一遍，5min后用配制的剥离硅烷(repel，4度保存，使电泳槽与胶分离)溶液涂抹均匀，放置15～30min。将玻板先用抹布蘸少许洗洁精在自来水下洗净，再用无水乙醇擦一遍，5分钟后用新鲜配制的溶液涂抹均匀，放置15～30min；如为用过的玻板，则先用NaOH溶液(1瓶加约25L水，可反复使用)浸泡1-2天，直至废胶脱落，再进行上述清洗。(3)装板玻板在下，电泳槽板在上，中间放两根压条(涂抹repel和binding的面相互靠近)，对齐后用三对夹子将波板与电泳槽板夹紧。(4)灌胶用针筒吸取凝胶混合液，缓慢均匀的从灌胶口将胶灌入，灌好后取下靠近灌胶口的夹子，倒插入梳子，注意不要起汽泡，插好后，再夹上夹子；凝胶需要1～2(30min)个小时；(5)预电泳(主要是使凝胶的温度达到一定高度)取下夹子，拔出倒插的梳子，在自来水下将灌胶口冲洗干净，放入电泳槽，卡紧，灌入缓冲液，上下槽各300mL左右，上下槽用一样的缓冲液(即1×TBE)注意用夹子夹紧上槽排放缓冲液的胶管；80W衡功率电泳半小时。(6)点样用吸管吹干净灌胶口的废胶，将梳子顺插入灌胶口，再用吸管将每个梳孔吹干净，开始点样，注意不要串样，梳齿不要将胶面弄坏。(7)电泳80W衡功率电泳1h左右(电压可能达到1100V-2000V，若太高则有可能配错，将功率调低，以免温度过高，玻璃板裂开)。(8)银染将板子置于银染液15min。(9)水洗用蒸馏水洗3到4s(主要是冲去银离子，免得遇光变黑，需5～8s)。(10)显影将板子置于显影液中10～15min，直至条带清晰。(11)水洗自来水冲水洗银染板，将NaOH洗掉(若不冲去NaOH，它会使凝胶氧化变黑)。结果统计：如图1所示，为本发明实验例3InDel标记在矮秆波兰小麦×高秆波兰小麦F7代重组自交系中的分型结果，如图2所示，为本发明实验例3InDel标记在矮秆波兰小麦×高秆波兰小麦F2代重组自交系中的分型结果，其中，Marker为pUC19DNA/MspI(HpaII)Marker(购自thermo-金蓉诚，品牌/型号ThermoFermentas-金蓉诚/SM0222)。标记4BS-PMT2，扩增产物中能扩增出102bp片段，说明该植株为高秆波兰小麦，如果能扩增出110bp片段，说明该植株为矮秆波兰小麦，如果扩增出杂合带型，说明该植株为高秆波兰小麦，进行统计对F2和F7分型和实际生长情况进行统计，如下表5所示，为本发明的F2代编号1-26的株高统计表，如下表6所示，为本发明的F7代编号1-26的株高统计表，将检测结果和株高进行对应，发现一致，表明本发明的方法的鉴别率为100％。表5本发明的F2代编号1-26的株高统计表表6本发明的F7代编号1-26的株高统计表F7代编号株高(cm)1142.732120.833124.534121.00579.30682.607129.73882.979134.8710135.131187.671272.531387.501484.2015134.371679.6717133.8018134.9719129.872086.272196.032291.5023134.6724123.2025130.6026134.50综上所述，本发明的矮秆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用，该InDel标记不仅在苗期就能区分植株高矮秆，而且对于目标基因的定位有很大的帮助，极大的降低了劳动成本、节约了时间并且不受环境及人为因素的影响。尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。序列表<110>四川农业大学小麦研究所<120>一种矮秆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用<141>2018-07-13<160>2<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成(ArtificialSequence)<400>1tgaaatataatggtgagtga20<210>2<211>18<212>DNA<213>人工合成(ArtificialSequence)<400>2gatctcactgctacactc18当前第1页1 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