本发明涉及一种大白菜毛刺的InDel标记及其检测引物与应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
分子标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)不受环境条件的限制，可以在植物发育的任何生长时期从DNA分子水平上进行(Tanksley，1989)。它克服了传统植物育种时间长、速度慢、不确定性、受环境条件限制等缺陷。目前，国际上已建立了多种植物分子标记技术体系并应用于农作物的遗传改良，这为作物育种开辟了新的途径。利用分子标记技术快速筛选特别是分子标记的出现使得育种工作中的选择由传统的表型选择转变为基因型选择，大大提高了选择的准确性和效率。基于PCR的分子标记如RAPD(random amplified polymorphic DNA)、SSR(Simple sequence repeat)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)、InDel(insertion-deletion)等的出现，因其简便、快速和高效等特点，使分子标记的开发与利用遍及各种作物。其中InDel标记是由于同一位点处的DNA序列在不同个体间发生了核苷酸片段的插入/缺失，根据目标位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增，扩增片段的长度多态性即是InDel标记。由于InDel标记为共显性标记，具有较好的稳定性及多态性丰富等优点，已被广泛应用于多态性分析、基因的精细定位及图位克隆等。
大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis，AA基因组，2n＝20)起源于中国，是我国栽培面积和产量最大的蔬菜作物之一，具有重要的经济价值，素有“国菜”之称。大白菜叶被毛是植物体表面的一种保护组织，是植物与环境接触的最外层。它具有防治病虫侵害和紫外线伤害，减少植物蒸腾作用和増加耐冻性等作用，但是随着人们生活水平的提高，因其口适性和触感，大多数消费者更偏爱无毛大白菜品种，因此，有无叶被毛是目前大白菜抗病育种、品质育种的重要目标性状及商品性状。但到目前为止，与毛刺性状紧密连锁的标记较为缺乏，严重阻碍了其育种的进程，这意味着开发与大白菜毛刺性状紧密连锁的分子标记，对于快速培育无毛抗病大白菜新品种将有重要的指导及实践意义。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供一种大白菜毛刺的InDel标记及其检测引物与应用。
本发明技术方案如下：
一种大白菜毛刺的InDel标记TR-1,核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
上述大白菜毛刺的InDel标记TR-1的检测引物，该检测引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述大白菜毛刺的InDel标记TR-1的检测引物在无毛大白菜品种选育中的应用。
根据本发明优选的，所述应用，步骤如下：
(1)提取待检测大白菜品种的基因组DNA，获得基因组DNA溶液；
(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用上述检测引物对基因组DNA进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)制得的PCR扩增产物经凝胶电泳后，当PCR产物电泳图谱显示被测样品仅有156bp一条条带时，则该被检测样品为有毛材料；当PCR产物电泳图谱显示仅有144bp一条条带时，则该被检测样品为无毛材料；当PCR产物电泳图谱显示同时含有156bp和144bp条带时，则该被检测样品为有毛和无毛杂交材料，表型上表现为有毛材料。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(1)中，提取待检测大白菜品种的基因组DNA采用改良的CTAB法提取。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(2)中，PCR反应体系如下，总体系为20μL：
20ng/μL模板DNA 2μL，含20mM MgCl2的10×PCR buffer2μL，2.5mMdNTPs0.5μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，1U TaqDNA聚合酶0.2μL，加ddH2O至20μL。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增程序为：
95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共计36个循环；72℃延伸10min。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(3)中，凝胶电泳为质量百分比为8％的变性聚丙烯酰氨凝胶电泳。
有益效果
本发明首次公开了与大白菜毛刺相关的InDel标记TR-1及其检测引物，通过对有毛和无毛大白菜自交系以及二者杂交后产生的F2代分离群体材料的DNA进行PCR扩增，并利用8％变性聚丙烯酰氨凝胶电泳进行检测，发现与大白菜毛刺相关的InDel标记TR-1可明显区分有毛和无毛大白菜品种，可用于无毛大白菜新品种的选育。
附图说明
图1是大白菜毛刺相关的InDel标记TR-1的核苷酸序列对比图；
图中划线标识区域为Indel标记TR-1；有毛大白菜(G291)与无毛大白菜(ZHB)相比，有12bp的DNA插入；
图2是大白菜毛刺相关的InDel标记TR-1的检测引物在无毛(ZHB)与有毛(G291)大白菜以及二者杂交后产生的F2代分离群体材料中的PCR扩增电泳结果照片；
图中：泳道1：ZHB(无毛)，泳道2：G291(有毛)，泳道3-14：ZHB和G291杂交F2代无毛群体，泳道15-26：ZHB和G291杂交F2代有毛群体；
图3是大白菜毛刺相关的InDel标记TR-1的检测引物在市场上销售的有毛与无毛大白菜材料中的PCR扩增电泳结果照片；
图中：泳道1：ZHB(无毛)，泳道2：G291(有毛)，泳道3-17(无毛)：分别是AM4-1、AM3-1、AM5-2、AM9-1、AM94、AM30、AM54、AM72-1、AM10-1、AM56-1、青研春白2号、德高百合、西白45、Y2、L41，泳道18-32(有毛)：分别是西白8号、中华1号、青研CR20、青研夏白2号、广东早、L46、2013-33、AM2-1、高抗2号、西白5号、夏优二号、金童玉女、攻关二号、丰抗60、德高喜抗65。
图4是大白菜毛刺相关的InDel标记TR-1的检测引物与采用相同方法设计的其他7对InDel标记引物对有毛与无毛大白菜材料中的PCR扩增电泳结果照片；
图中：泳道1-4(无毛)：分别是ZHB、AM3-1、德高百合、AM10-1，泳道5-8(有毛)：分别是G291、中华1号、西白8号、攻关二号；图中A1-A7分别是筛选过程效果不佳的InDel标记。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源
AM4-1、AM3-1、AM5-2、AM9-1、AM94、AM30、AM54、AM72-1、AM10-1、AM56-1、Y2、L41、AM2-1、广东早、L46、高抗2号、2013-33、攻关二号品种购自山东省农业科学院；
德高百合、德高喜抗65品种购自山东省德州市德高蔬菜种苗研究所；
西白45、西白8号品种购自山东登海种业股份有限公司；
中华1号品种购自山东省临朐县德民种业有限公司；
青研CR20、青研夏白2号、青研春白2号品种购自山东省青岛市农业科学研究院；
西白5号、丰抗60品种购自山东省莱州市农业科学院蔬菜种苗研究所；
夏优二号品种购自历城春夏大白菜研究所；
金童玉女品种购自北京澳硕丰农业科技有限公司。
实施例1.InDel标记引物的开发
以大白菜毛刺形成相关基因为候选基因，利用重测序技术对有毛(G291)与无毛(ZHB)大白菜进行全基因组重测序。根据重测序结果对有毛与无毛大白菜中的候选基因进行序列比对，对其中的1个InDel标记TR-1设计引物，该大白菜InDel标记TR-1的序列比对图如图1所示。图中划线标识区域为InDel标记TR-1。
有毛大白菜(G291)与无毛大白菜(ZHB)相比，有12bp的DNA插入。设计大白菜InDel标记TR-1的检测引物，引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
实施例2.InDel标记引物的应用
2.1植物材料与模板DNA的提取
选取大白菜杂种一代商业品种青研春白2号、德高百合、西白45、西白8号、中华1号、青研CR20、青研夏白2号、中华1号、高抗2号、西白5号、夏优二号、金童玉女、公关二号、丰抗60、华阳白、德高喜抗65和大白菜自交系广东早、Y2、L41、L46、AM4-1、AM3-1、AM5-2、AM9-1、AM94、AM30、AM54、AM72-1、AM10-1、AM56-1、以及ZHB和G291的杂交F2代叶片为材料。
以改良的CTAB法提取总DNA，具体步骤如下：
1.取1-10g新鲜大白菜叶片，在液氮中快速研成粉；
2.将冻粉转入预冷的离心管中，加入等体积(w/v，g/ml)2×CTAB提取缓冲液，65℃保温20分钟；
3.加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24:1)，颠倒离心管混匀，12000r/min室温离心10分钟；
4.将上清液转入另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24:1)，颠倒离心管混匀，12000r/min室温离心10分钟；
5.将上层水相转入新的离心管中，加入等体积的异丙醇,轻轻颠倒混匀，室温下放置30分钟；
6.12000r/min室温离心5-10分钟，去上清液；
7.70％乙醇漂洗，12000r/min室温离心5-10分钟，去上清液；
8.重复步骤7一次；
9.沉淀风干，加入100μl的TE缓冲液或超纯水溶解DNA，-20℃保存备用；
10.取2μl溶液利用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
2.2PCR扩增
根据上述设计的大白菜InDel标记TR-1的检测引物(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列)，在生工生物工程(上海)股份有限公司合成大白菜InDel标记TR-1的引物，溶解后稀释至10μM备用。
以上述提取的DNA为模板，分别以大白菜InDel标记的引物进行PCR扩增，制得PCR产物。
PCR反应体系如下，总体系20μL：
20ng/μL模板DNA 2μL，含20mM的MgCl2的10×PCR buffer2μL，浓度2.5mM的dNTPs0.5μL，浓度10μM的上游引物0.4μL，浓度10μM的下游引物0.4μL，1U的TaqDNA聚合酶0.2μL，加ddH2O至20μL。
扩增程序为：
95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共计36个循环；72℃延伸10min。
2.3聚丙烯胺凝胶电泳分离与多态性检测
PCR产物经质量浓度为8％的变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后，利用银染法显影检测。
PCR产物与上样缓冲液混匀后95℃预变性10min，取4μl点样，在Sequi-GT核酸电泳系统(Bio-Rad，USA)中进行电泳分离，电极缓冲液为1×TBE，在25℃、55W恒功率下电泳1.5h，通过银染法显影、拍照并记录结果。
图2是采用大白菜InDel标记TR-1的引物对ZHB、G291以及ZHB和G291杂交F2群体材料的PCR扩增产物进行8％变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后的结果图。
图3是采用大白菜InDel标记TR-1的引物对无毛材料(AM4-1、AM3-1、AM5-2、AM9-1、AM94、AM30、AM54、AM72-1、AM10-1、AM56-1、青研春白2号、德高百合、西白45、Y2、L41)和有毛材料(西白8号、中华1号、青研CR20、青研夏白2号、广东早、L46、中华1号、高抗2号、西白5号、夏优二号、金童玉女、公关二号、丰抗60、华阳白、德高喜抗65)的PCR扩增产物进行质量浓度为8％的变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后的结果图。
图4是采用大白菜InDel标记TR-1引物及采用相同方法设计的其他7对InDel标记引物对无毛材料(早皇白、AM3-1、德高百合、AM10-1)和有毛材料(冠291、中华1号、西白8号、攻关二号)的PCR扩增产物进行质量浓度为8％的变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后的结果图。
由图2、图3和图4可以看出，大白菜InDel标记TR-1的引物可对有毛和无毛大白菜的DNA进行有效扩增，带型清晰，且在有毛和无毛大白菜材料中具有良好的多态性，其中有毛材料扩增条带为156bp，无毛材料扩增条带为144bp，能够很好的区分有毛和无毛大白菜，可用于无毛大白菜新品种选育。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 一种大白菜毛刺的InDel标记及其检测引物与应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ttccatacct ccctcactgg ta 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ttcaactgtc cacaaccctt tc 22
<210> 3
<211> 144
<212> DNA
<213> ZHB
<400> 3
ttccatacct ccctcactgg tagcaatctt tataagtaga gtctctatca cagataataa 60
tctgagaatc aaaggatgag aacgaggaga agaacagagg aagagaatca tcaagaatac 120
aagaaagggt tgtggacagt tgaa 144
<210> 4
<211> 156
<212> DNA
<213> G291
<400> 4
ttccatacct ccctcactgg tagcaatctc tttctctctc tttataagta gagtctctat 60
cacagataat aatctgagaa tcaaaggatg agaacgagga gaagaacaga ggaagagaat 120
catcaagaat acaagaaagg gttgtggaca gttgaa 156