本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于鉴定红花草莓花色性状相关的分子标记。
背景技术：
草莓属的植物均开白花，红花草莓(Pink-flowered strawberry)为属间杂种(Fragaria×Potentilla)，是一种新型的兼具观赏性和食用性的多年生草本花卉(Mabberley，2002)。红花草莓由于具有靓丽的花色和可食用的果实而深受人们喜爱，具有极大的市场潜力和经济价值，且红花草莓的价格也都远远高于普通的白花草莓栽培品种(Bentvelsen and Bouw，2006)。目前，红花草莓的新品种选育仍依赖于传统杂交育种方法，育种周期较长，从杂交到实生苗正常开花结实，至少需要2-3年，且杂交后代花色显著分离。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种快速鉴定红花草莓杂交后代花色性状的方法。
本发明的技术方案为：用于鉴定红花草莓花色性状的SSR分子标记的引物，SSR分子标记的引物包括4个，分别为UgRFsr57622、UgRFsr94149、UgRFsr40142、UgRFsr54608；其中，UgRFsr57622的上游核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；UgRFsr94149的上游核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；UgRFsr40142的上游核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；UgRFsr54608的上游核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，下游核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
用于鉴定红花草莓花色性状的试剂盒，含有UgRFsr57622、UgRFsr94149、UgRFsr40142或UgRFsr54608引物中的一种或多种的混合。
用于鉴定红花草莓花色性状的SSR分子标记的引物UgRFsr57622、UgRFsr94149、UgRFsr40142或UgRFsr54608在草莓花色性状鉴定上的应用。
鉴定红花草莓花色性状的方法，包括如下步骤：
(1)使用UgRFsr57622、UgRFsr94149、UgRFsr40142或UgRFsr54608作为引物，以待鉴定草莓DNA为模版进行PCR扩增；
(2)PCR扩增产物做电泳检测：如果引物UgRFsr57622的扩增产物同时得到127bp和165bp的产物，则待鉴定草莓为红花草莓；如果引物UgRFsr94149的扩增产物得到265bp的产物，则待鉴定草莓为红花草莓；如果引物UgRFsr40142的扩增产物得到276bp的产物，则待鉴定草莓为红花草莓；如果引物UgRFsr54608的扩增产物得到250bp的产物，则待鉴定草莓为红花草莓。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明得到了可标记出红花草莓杂交后代红色系花(红色、深粉色、粉色、浅粉色)特异性标记。这能够在幼苗时期方便、有效的区分白花和其他花色，大大缩短了红花草莓的育种周期。
附图说明
图1转录组测序至SSR标记开发的示意图；
图2琼脂糖凝胶电泳图版，其中a为UgRFsr57622的扩增产物电泳图，b为UgRFsr94149的扩增产物电泳图，c为UgRFsr40142的扩增产物电泳图，d为UgRFsr54608的扩增产物电泳图。
具体实施方式
基于转录组测序，开发与红花草莓花色性状相关的特异性SSR分子标记，具体做法是：
一、红花草莓转录组测序
选取红花草莓粉公主×粉佳人的杂交后代中所有开红色花的实生苗(6株)和白花实生苗(6株)盛花期的花瓣，进行转录组测序。采用CTAB法提取花瓣总RNA，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA。加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以裂解后的短片段为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，再用AMPure XP beads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA先进行加A尾、末端修复并连接测序接头，再用AMPure XP beads进行片段大小选择，进行PCR扩增。并用AMPure XP beads继续纯化PCR产物，获得最终测序文库，分别命名为PH_R1、PH_R2、PH_W1和PH_W2。建好的测序文库用Illumina HiSeqTM2500进行测序，获得91 835个无冗余unigenes。
二、SSR引物开发
基于红花草莓转录组测序得到的91 835个unigenes，利用MISA软件寻找到12 077个unigenes含有SSR的重复基元，随机选择SSR的重复基元为单核苷酸重复次数≥10次，二核苷酸重复次数≥6次，三、四、五和六核苷酸重复次数≥5次的SSR序列，共105个，用软件Primer 5.0设计SSR引物。引物设计的原则为：①在引物中不存在SSR位点；②匹配获得总Unigenes的引物,不超过三个失配在5′端和不超过一个失配在3′端；③保持唯一匹配的引物，并丢弃多匹配引物；④引物长度在18～24bp；⑤PCR扩增片段长度在100～500bp；⑥SSR Finder验证SSR(http：//www.fresnostate.edu/长度/)，选择both-hit引物。
三、DNA提取
用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)法提取红花草莓基因组DNA，具体步骤：
粉公主×粉佳人的杂交后代实生苗，进行引物筛选；
粉公主×哈尼，俏佳人×哈尼和粉公主×俏佳人的杂交后代中选择材料进行验证分子标记。杂交组合后代的花色可分为5种花色：白色、浅粉色、粉色、深粉色和红色。分别采取所有杂交后代的新鲜嫩叶为试材。
(1)配制DNA提取缓冲液：2％CTAB(PVP),lM Tris-Hcl,0.5M EDTA(pH 8.0),5M NaCl和l0mg/mL的RNAase酶。
(2)对上述红花草莓材料分别进行如下处理：
A、提取：在65℃水浴锅中预热600μL CTAB+12μLβ-巯基乙醇提取液；将1/3体积的新鲜嫩叶在液氮中迅速研磨样品，将粉末状材料转入1.5mL离心管中，加入预热的提取液612μL，65℃保温30min，每隔l0min取出上下颠倒混匀；
B、抽提：加入等体积612μL的氯仿：异戊醇(24:1)，混匀，4℃下10000rpm/min离心l0min，取上清500μL转入新离心管，并再次加入等体积500μL氯仿/异戊醇(24:1)，混匀，10000rpm/min离心l0min，再次抽提250μL放入新的1.5mL离心管中；沉降：加入2倍体积预冷的无水乙醇(-20℃)上下颠倒混匀，置于-80℃冰箱中沉降20min，取出后10000rpm/min离心10min弃溶液；
C、清洗：加350μL TE溶解(大部分)后，10000rpm/min离心10min后，取300μL上清液于1.5mL，加入1μL RNAase 37℃水浴45min。取出冷却至室温加入1/10体积(30μL)3M的NaAc和2倍体积的无水乙醇(660μL)上下颠倒与-70℃静止30min。取出后10000rpm/min离心10min弃上清留沉淀，加入500μL 70％无水乙醇清洗8000rpm/min离心3min。弃上清液加入500μL 70％无水乙醇清洗8000rmp/min离心3min；
D、抽干：倒掉乙醇用移液枪尽量吸干附着液体，放超净工作台晾干。溶解：加入45μL TE溶解DNA后瞬时离心于-20℃保存。
E、紫外分光光度法检测上述步骤D所得的DNA样品的浓度，1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。
四、genic-SSR引物筛选
选择用于转录组测序的组合(粉公主×粉佳人)，不同花色的杂交后代，用于105对SSR引物的筛选。PCR扩增进行热循环(VeritiTM 96-well Thermal)，PCR扩增反应体系20μL：2×Es Taq Master Mix 10μL(CWBIO，China；2×Es Taq MasterMix含有Es Taq DNA Polymerase,3Mm MgCl2和400μΜdNTP)，10ng·μL-1DNA 0.5μL，10μmol·L-1上、下游引物各0.8μL，其余用无菌蒸馏水补充至20μL。PCR扩增程序：94℃预变性1min；94℃变性1min，最佳Tm退火2min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min。产物检测：PCR产物在8％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，染色显色后观察并照相记录结果，红白两个花色均能扩增出多态性清晰条带的4对引物对用于下一步的花色性状特异性引物验证。
五、验证特异性genic-SSR引物
根据步骤四分析结果，将经初步筛选出来的特异性引物，以不同的杂交组合后代中红花、白花、深粉、粉色、浅粉花为DNA模板，用以上PCR反应体系和条件，在3％(W/V)的琼脂糖凝胶验证引物特异性。
红花草莓杂交后代在植株开花后，在目视上才能够观察到红色系花表型。因此，trait-specific marker(性状特性标记)的开发将有助于苗期的选择，加速红花草莓新品种的选育过程。本研究中得到的4个trait-specific marker标记，UgRFsr57622(序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示)、UgRFsr94149(序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示)、UgRFsr40142(序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示)、UgRFsr54608(序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示)，利用3％琼脂糖凝胶电泳验证标记物扩增的PCR产物，只有UgRFsr57622是多态的，只是在白色花类型扩增出一条带，而在其他花色植株上的第二条带都显着扩增(图2中a)；UgRFsr94149和UgRFsr40142引物对，在有色花的表型中(红色、深粉色、粉色和浅粉色)均扩增出单一条带(图2中b和c)，而UgRFsr54608引物对不仅能在有色花的表型中均扩增出一条带，且还带着次要带(图2中d)，这3对引物在所有白色花表型中均不表达无扩增条带。
为了进一步确定微卫星序列的多态性，将4对引物共显性分离片段在TA克隆后被回收和测序。结果表明，序列与原始序列一致，表明开发的4对SSR性状特异性标记特异性高。
表1与红花草莓花色性状共分离的4个特异性引物序列
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
序列表
<110> 申请人名称 沈阳农业大学
<120> 用于鉴定红花草莓花色性状的SSR分子标记的引物及应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgatggcact gtacgatgag g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caccatcaac ttttggcgca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgcgacgat ctagtctggg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acggcataag accaagtgca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tactaggtcc cgtcgctctc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtcgacgtag gcttcaggag 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cattcaatgc atgagcgagg a 21
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcaggagttc aaataacaca ctca 24