本发明属于家禽基因工程的技术领域，更具体地，涉及一种与高邮鸭肌肉生长发育性状相关的SNP分子标记、其获取方法及应用。
背景技术：
我国是世界上肉鸭生产和消费的第一大国。鸭肉脂肪含量低，不饱和脂肪酸含量多，鸭肉产品的需求在我国肉食产品需求总量中呈现刚性增长。但每年市场仍有7-8亿只缺口，与我国鸭业的发展速度、资源利用和发展规模相差甚远。目前，由北京鸭成功选育的国外引入品种樱桃谷鸭(70日龄平均体重约为3.3kg，胸肌率为17％，腿肌率为9％)在国内肉鸭市场占有绝对优势，近年来法国的南特鸭也进驻国内市场，而我国优良地方品种资源未能得到合理的挖掘利用，造成了国内优良地方品种资源的浪费。肉鸭育种中，选择性提高生长早期肉鸭骨骼肌的生长发育，是育种成功和产业升级的壁垒。随着现代生物技术和信息技术的发展，分子育种正在越来越多的被应用于改良畜禽品种，加快育种进展。
TNNI1基因属于肌钙蛋白I(Troponin I，TnI)的亚单位。TnI定位于横纹肌，主要功能是通过与Ca2+结合来调节肌球蛋白ATP酶的活性，进而调节肌肉的收缩。TnI基因包含三种亚型，根据组织分布和表达特异性，分为慢速骨骼肌型肌钙蛋白(TNNI1)、快速骨骼肌型肌钙蛋白I(TNNI2)和心肌型肌钙蛋白I(TNNI3)。TNNI1基因主要在人的成年期的慢收缩性骨骼肌中特异性表达。猪上的研究表明，TNNI1在猪胚胎期不同类型肌纤维都有表达，在快白肌纤维为主的肌肉中，表达高峰出现在120天，以慢肌纤维为主的肌肉中，表达高峰出现在60天；在羊上的研究表明，TNNI1基因在肌肉中的表达量随年龄的增加呈逐渐上升的趋势，半岁时表达量最低，2岁之后趋于平衡。在羊上的研究表明，TNNI1基因表达量与羊肌纤维的直径、横切面积等具有相关性。这些报道都有力地证明了TNNI1基因在动物的肌肉发育和生长发育中扮演着重要角色。课题组前期研究表明，TNNI1 mRNA表达量与鸭胸肌和腿肌肌纤维的直径和横切面积都无显著相关。TNNI1基因在鸟类可能存在不同于哺乳动物的功能与作用方式。
胚胎期是动物肌肉形成的重要时期，肌纤维细胞的数量基本固定下来，出生后数量不再增加。出生后产肉量的增加主要是肌纤维直径和长度的增加。胸肌和腿肌是鸭主要的产肉部位。目前，尚无TNNI1基因遗传变异与鸭肌肉生长发育性状的相关报道。高邮鸭是全国三大名鸭之一，生长发育快，肉质好，属于肉蛋兼用型地方品种。在育种工作中，与改变个体遗传特性(人工诱变)相比较，改变品种遗传结构还是比较容易的。而且在现有基因的基础上，通过改变基因频率来改进品种的遗传结构，其潜力还是很大的。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP作为第三代分子标记，具有数量多、分布广、代表性强和遗传稳定性好等特点。目前已经在动植物的遗传多样性分析、基因作图、分子标记辅助育种和功能基因学的研究中得到了广泛的应用。
因此，研究与高邮鸭肌肉生长发育性状相关的SNP分子标记，用于高邮鸭早期的选育，具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种与高邮鸭肌肉生长发育性状相关的SNP分子标记、其获取方法及应用，通过寻找与高邮鸭肌肉生长性状关联的SNP位点作为分子标记，并将其与体重和肌肉重增长进行关联分析，加快育种进程。
本发明的技术方案如下：
一种与高邮鸭肌肉生长发育性状相关的SNP分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其来自TNNI1基因，该序列的第130位为SNP突变位点，该位点的碱基为A或G。
本发明还提供了一种获取所述的与高邮鸭肌肉生长发育性状相关的SNP分子标记的方法，该方法包括以下步骤：
(1)PCR扩增高邮鸭基因组DNA，获得PCR扩增产物；
(2)将PCR扩增产物进行测序，通过序列分析判定基因型；
(3)将不同基因型与高邮鸭肌肉生长发育性状进行关联分析，从而获取所述SNP分子标记。
需要进一步说明的，步骤(1)中，PCR扩增所用正向引物序列如SEQ ID NO:2所示，反向引物序列如SEQ ID NO:3所示。
步骤(2)中，所述基因型为AA、AG或GG。
步骤(3)中，高邮鸭肌肉生长发育性状包括体重、胸肌重和腿肌重。
本发明又提供了所述的与高邮鸭肌肉生长发育性状相关的SNP分子标记在筛选高邮鸭体重、胸肌重和腿肌重性状中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供了一种与高邮鸭肌肉生长发育性状相关的SNP分子标记，针对TNNI1基因的SNP多态性，设计特定的引物扩增包含SNP位点的基因片段，然后进行测序分析，能够简单、快速、低成本、精确地检测其单核苷酸的多态性。通过本发明的SNP分子标记所选育出来的高邮鸭的体重、胸腿肌重相关性状得到了提高，可以用于家系选育中的早期选择，也可在选配中提供分子依据。本发明的SNP分子标记为筛选高邮鸭体重、胸腿肌重提供了新的方法。
附图说明
图1是本发明实施例中的基因分型结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细地解释说明。
本发明的与高邮鸭肌肉生长发育性状相关的SNP分子标记，来自TNNI1基因，位于TNNI1基因的第1397382位，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该序列的第130位为SNP突变位点，该位点的碱基为A或G。
针对上述SNP分子标记，本发明还公开了其获取方法，包括以下步骤：
(1)PCR扩增高邮鸭基因组DNA，获得PCR扩增产物；
(2)将PCR扩增产物进行测序，通过序列分析判定基因型；
(3)将不同基因型与高邮鸭肌肉生长发育性状进行关联分析，从而获取所述SNP分子标记。
其中，步骤(1)中，PCR扩增所用正向引物序列如SEQ ID NO:2所示，反向引物序列如SEQ ID NO:3所示。步骤(2)中，所述基因型为AA、AG或GG。步骤(3)中，高邮鸭肌肉生长发育性状包括体重、胸肌重和腿肌重。
本发明的获取与高邮鸭肌肉生长发育性状相关的SNP分子标记的方法，具体包括以下步骤：
1、鸭肌肉样品的采集和DNA的提取：
本发明的鸭来自江苏省高邮鸭集团，在相同的日粮水平下饲喂的同日龄高邮鸭种群。高邮鸭称重后，采用一次性注射器从鸭翅下静脉中抽取约1mL血液，注入经高压灭菌并装有约200μl 2％无菌EDTA(Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝剂的1.5mL离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，-80℃保存备用。同时将鸭屠宰后，分别取下单侧胸大肌和腓肠肌外侧头并称重。参照血液/细胞/组织DNA提取试剂盒(天根，DP304)的说明书进行鸭血液DNA样品的采集。
2、PCR扩增SNP位点所在片段
根据TNNI1基因组序列，设计包含待测位点序列的引物，所述正向引物和反向引物的核苷酸序列如SEQNO:2-3所示以上述高邮鸭基因组为模板，在包含待测位点序列的正反向引物、Taq DNA聚合酶、缓冲环境、dNTPs存在的情况下，在PCR反应条件下进行扩增，PCR产物大小为389bp。所述引物对序列如下：
正向引物序列为：5’-CTCAGGGTCAGCAGTGTCC-3’(SEQ ID NO：2)；
反向引物序列为：5’-CTCAGCAGCTACACCGAGG-3’(SEQ ID NO：3)
PCR扩增反应的具体步骤为：
1)PCR扩增反应体系准备：50ng/μl DNA模板1μl、2mM dNTP 2μl、3mM Mg2+0.6μl、10×PCR反应缓冲液2μl、10μM正反向引物各0.4μl、1U/μl Taq聚合酶0.2μl，加ddH2O至总体积20μl。
2)PCR扩增反应程序设置：在Perkin-Elmer GeneAmp PCR Systems 9600上进行扩增反应，PCR扩增反应程序为：95℃变性2min，40次循环(94℃90s，50℃1min 30s，65℃30s)65℃延伸10min，得到PCR扩增产物。
3)反应结束后，取2μl反应产物在3.0％琼脂糖胶，0.5×TBE中电泳，检测反应是否成功，剩余反应产物在-20℃的条件下保存。
3、基因型判定与关联分析
将PCR扩增产物送上海生物工程有限公司进行测序。根据测序的结果判定该位点在检测群体中的基因型。基因分型结果如图1所示，如果该样本是纯合子的话，就只有一个产物峰：A峰或G峰。如果是杂合，那么就会出现2个峰：A峰和G峰。
对TNNI1基因多态位点不同基因型与鸭体重、胸肌重和腿肌重进行了关联分析，关联分析结果如表1所示，SEQ ID NO：1上的第130位与高邮鸭70日龄的体重、胸肌重、腿肌的腓肠肌外侧头重呈显著相关(P<0.05)；其中基因型AA在70日龄的体重、胸肌重、腿肌腓肠肌外侧头重显著高于基因型AG和GG(P<0.05)，所以AA基因型为优势基因型。在育种筛选中，只选择AA型，可以在群体中固定该基因型。
表1不同基因型与鸭体重、胸肌重和腿肌重的关联分析
注：在同一行中小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏省家禽科学研究所
<120> 一种与高邮鸭肌肉生长发育性状相关的SNP分子标记、其获取方法及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 389
<212> DNA
<213> 鸭(Anas platyrhynchos)
<400> 1
ctcagggtca gcagtgtcct gctacacaca ggggcatctt ctgcaaggca ctgactcccc 60
ccctgccctc ctcccgcaga ttaaggacct gaaaatcaaa gtgcttgacc tgcgggggaa 120
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<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 2
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<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
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