本发明涉及单核苷酸基因检测技术领域，具体是一种单核苷酸多态性基因检测方法。
背景技术：
人类基因组测序计划的完成，标志着人类已步人后基因组时代，该时代以基因组中个体遗传差异的研究为重点，而个体遗传差异最常见形式为单核苷酸多态性(SNP)，正是这些SNP的变异造成人类在身材、体形、肤色、对疾病的易感性、疾病表型和对药物治疗反应等诸多方面或多或少的差异，也可通过检测胆固醇酯转移蛋白(CETP)基因来分析与人类冠心病之间的联系，CETP基因的主要作用是在脂蛋白间转移中性脂质如胆固醇酯(CE)和甘油三酯(TG)，即催化了CE从HDL2(HDL-C的大颗粒的形式)向极低密度脂蛋白(VLDL)、LDLs及中间密度脂蛋白(IDL)的转运，同时也催化了TG以等分子比例向相反方向的转运，CETP是已知唯一具有这一功能的蛋白，在众多导致人类疾病的基因突变、病原亚型及耐药基因突变中，单碱基突变占相当大的比例，其检测方法的探索一直是基因诊断研究中的重要课题，特别对已知突变的检测，将是进行基础研究和临床基因诊断的重要手段之一。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种单核苷酸多态性基因检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种单核苷酸多态性基因检测方法，包括SNP的概念、研究现状、研究意义和SNP的分析检测方法，所述研究现状是与为数有限的蛋白质测序和DNA序列分析方法相比，SNP分析的基本方法已达几十种之多，主要的SNP分析方法的原理为:(1)利用碱基变化产生新的或消除已有的内切酶识别位点；(2)利用碱基变化造成的碱基互补性对引物延伸反应的影响；(3)利用碱基变异对核酸；研究意义为在诸多基因变异中，SNP是研究基因遗传与变异时一种高效的量化标志，在人类基因组中大约有30亿个碱基，SNP位点以百万的数量级存在，无论是将SNP作为快速扫描全基因组的物理标志，还是对全基因组与疾病相关或药物代谢相关的SNP进行选择性扫描，均需要使检测的SNP位点进一步从百万级的数量下降至数万或数千个，因此，应用SNP进行疾病相关性分析，只有通过对多基因疾病进行SNP连锁不平衡分析，才能加强疾病预防与治疗的针对性，所述胆固醇酯转移蛋白(CETP)基因分析检测是由于基因具有特定多态性，导致限制性内切酶酶切位点改变、消失或产生新的位点，若用某种限制性内切酶酶切基因组DNA，则酶切后产生与正常基因组不同长度的DNA片段，检测这DNA片段的大小和数量，判断是否具有特定多态性。
作为本发明进一步的方案：所述SNP分析方法取决于是找寻未知SNP，还是分析已知的SNP，对未知SNP的分析，现在主要通过测序完成，对已知SNP，需根据是对单一位点还是对多个位点分析和实验目的不同，而选用不同的分析方法，对大量SNP位点的分析方法，主要有3种，即寡核苷酸SNP分析芯片、单残基延伸SNP芯片和多孔板技术，如使用6孔板的适时聚合酶链式反应(PCR)的单碱基多态性分析方法，对单点的SNP分析可使用的方法相对较多，大多数以单点或为数不多的SNP位点为目的的基础和临床研究，选择不需荧光探测的方法，一般即可满足分子药理学和基因诊断的要求。
作为本发明再进一步的方案：所述SNP分析方法有限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)，此方祛仅适用于分析位于限制性内切酶酶切位点的SNP，步骤为：在需分析的单碱基多态性的上下游设计2个引物，并用这对引物放大相关核酸片段，然后对该核酸片段用限制性内切酶消化，分析等位基因是否含有内切酶位点，以得到不同长度的产物，最后通过凝胶电泳对酶解产物进行分离，从凝胶电泳所示核酸片段长度即可得知该片段是否被消化，若PCR产物被完全消化或不被消化，则分别为不同基因型的纯合子；若仅部分产物被消化，则其基因型为杂合子，使用RFIP时需注意，引物设计依据所需放大片段的长度或消化以后的长度决定，相对高浓度的凝胶适宜于分析长度较短的片段，相对低浓度的凝胶则有利于分析长度比较长的片段；凝胶浓度一般在1％到2％之间，通过设计酶解产物为不同长度的DNA片段，一个反应可同时分析几种不同的SNP多态性。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明设计思路新颖，通过引物设计依据所需放大片段的长度或消化以后的长度决定，相对高浓度的凝胶适宜于分析长度较短的片段，相对低浓度的凝胶则有利于分析长度比较长的片段；凝胶浓度一般在1％到2％之间，通过设计酶解产物为不同长度的DNA片段，一个反应可同时分析几种不同的SNP多态性，能够较为准确的分析检测出单核苷酸多态性基因，便于对SNP的变异造成人类在身材、体形、肤色、对疾病的易感性、疾病表型的治疗，同时研究抗CETP的单抗能阻断中性脂质的转运，减少了LDL中CE和TG的组成，使LDL抗氧化，巨噬细胞对氧化的LDL(ox-LDL)的摄入也减少，从而减少了发生动脉粥样硬化的危险，制造出相应的药物进行治疗，保护人们的身体健康。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中，一种单核苷酸多态性基因检测方法，包括SNP的概念、研究现状、研究意义和SNP的分析检测方法，所述SNP的概念是指由于转换、颠换、插人、缺失等原因，使不同个体在基因组DNA某特定核苷酸位置上存在不同种类碱基的多态性，即SNP是染色体DNA序列某个位点上的单个碱基，其可表现出因人而异的个体差异，如果在较大数量的人群中发生频率超过1％，即可认为是较古老的SNP，而不是新近发生的个体突变事件；研究现状是与为数有限的蛋白质测序和DNA序列分析方法相比，SNP分析的基本方法已达几十种之多，主要的SNP分析方法的原理为:(1)利用碱基变化产生新的或消除已有的内切酶识别位点；(2)利用碱基变化造成的碱基互补性对引物延伸反应的影响；(3)利用碱基变异对核酸；研究意义为在诸多基因变异中，SNP是研究基因遗传与变异时一种高效的量化标志，在人类基因组中大约有30亿个碱基，SNP位点以百万的数量级存在，无论是将SNP作为快速扫描全基因组的物理标志，还是对全基因组与疾病相关或药物代谢相关的SNP进行选择性扫描，均需要使检测的SNP位点进一步从百万级的数量下降至数万或数千个，因此，应用SNP进行疾病相关性分析，只有通过对多基因疾病进行SNP连锁不平衡分析，才能加强疾病预防与治疗的针对性，将SNP分析用于疾病诊断，可快捷而准确地将基因诊断提高到单碱基水平，目前，常规检测SNP技术已被广泛用于遗传药理学研究和促进遗传病诊断的普及领域，种类繁多的SNP分析方法，反映了SNP的研究在生物学和医学领域备受关注，然而任何一种方法均不可能独立地满足后基因组时代对SNP分析的要求，所述胆固醇酯转移蛋白(CETP)基因分析检测是由于基因具有特定多态性，导致限制性内切酶酶切位点改变、消失或产生新的位点，若用某种限制性内切酶酶切基因组DNA，则酶切后产生与正常基因组不同长度的DNA片段，检测这DNA片段的大小和数量，判断是否具有特定多态性，优选该方法与PCR技术结合，在设计PCR扩增实验时，引物位于基因多态性部位的两侧，先将目的基因扩增，使其易于检测是由于特定多态性引起已有的限制性内切酶位点改变，则可先用相应的限制性内切酶酶切扩增产物，再进行琼脂糖凝胶电泳观察，根据产物片段大小或数量与正常对照作出判断。
SNP分析方法有限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)，是在需分析的单碱基多态性的上下游设计2个引物，并用这对引物放大相关核酸片段，然后对该核酸片段用限制性内切酶消化，分析等位基因是否含有内切酶位点，以得到不同长度的产物，最后通过凝胶电泳对酶解产物进行分离，从凝胶电泳所示核酸片段长度即可得知该片段是否被消化，若PCR产物被完全消化或不被消化，则分别为不同基因型的纯合子；若仅部分产物被消化，则其基因型为杂合子，使用RFIP时需注意，引物设计依据所需放大片段的长度或消化以后的长度决定，相对高浓度的凝胶适宜于分析长度较短的片段，相对低浓度的凝胶则有利于分析长度比较长的片段；凝胶浓度一般在1％到2％之间，通过设计酶解产物为不同长度的DNA片段，一个反应可同时分析几种不同的SNP多态性，对所述PCR产物进行分析的方法为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合，将包含目的SNP位点的PCR产物用特定的限制性内切酶作酶切，则包含有该SNP位点的个体其PCR产物会产生切成两个或三个片段或切不动三种情况，在本发明中对于-971G/A位点，采用PCR扩增后，获得了309个碱基长的PCR产物，对309个碱基长的PCR产物选用AvaI限制性内切酶(上海生物技术工程有限公司)进行酶切，当切割后产生了210和99bp两种长度的片段时，说明-971G/A位点的等位基因为G，当只有309碱基长的PCR产物时，说明-971G/A位点的等位基因为A，当同时存在309、210和99bp三种长度的片段时，说明-971G/A位点的基因型为G/A杂合子。
本发明的工作原理是：在需分析的单碱基多态性的上下游设计2个引物，并用这对引物放大相关核酸片段，然后对该核酸片段用限制性内切酶消化，分析等位基因是否含有内切酶位点，以得到不同长度的产物，最后通过凝胶电泳对酶解产物进行分离，从凝胶电泳所示核酸片段长度即可得知该片段是否被消化，若PCR产物被完全消化或不被消化，则分别为不同基因型的纯合子；若仅部分产物被消化，则其基因型为杂合子，使用RFIP时需注意，引物设计依据所需放大片段的长度或消化以后的长度决定，相对高浓度的凝胶适宜于分析长度较短的片段，相对低浓度的凝胶则有利于分析长度比较长的片段；凝胶浓度一般在1％到2％之间，通过设计酶解产物为不同长度的DNA片段，一个反应可同时分析几种不同的SNP多态性，胆固醇酯转移蛋白(CETP)基因分析检测是由于基因具有特定多态性，导致限制性内切酶酶切位点改变、消失或产生新的位点，若用某种限制性内切酶酶切基因组DNA，则酶切后产生与正常基因组不同长度的DNA片段，检测这DNA片段的大小和数量，判断是否具有特定多态性。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。