专利名称：利用分子生物信息学鉴定高邮鸭品种的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用分子生物信息学鉴定高邮鸭品种的方法，属于生物品种鉴定 技术领域。
背景技术：
传统的高邮鸭和高邮双黄鸭蛋名扬海内外，是高邮的独特资源，但由于没有重视原种基地建立、品牌标准制定、专利保护，使一些假冒产品占领了市场，降低了传统产品的 声誉。市场上一些不法企业、养殖户非法销售假冒、仿冒高邮鸭的现象屡见不鲜，严重损害 了高邮鸭的声誉，影响了高邮鸭集团龙头企业的发展。目前对家禽品种的鉴定主要是以形态学标记为依据来审查育种档案和进行生产 性能测定。但随着育种水平的不断提高，亲本与杂交后代的外貌特征有较大的相似性，很 难从外貌特征进行区分。所以利用形态学标记来进行家禽品种(品系)鉴定就不够科学、 准确。如果进行生产性能测定，不仅耗费大量的人力、时间(蛋鸭约72周)和高昂的性能 测定费用，而且性能测定的结果还受饲养各个环节因素的影响，因此生产性能测定也难以 准确反映各品种(品系)的真实的生产性能和种质特性。另外也有学者运用同工酶、蛋白 质等生化标记等鉴定品种，但是生化标记数量少、变异程度低，只能间接反映品种的部分种 质特性。基于DNA测序技术发展的DNA分子标记能够准确的解释品种之间最根本的遗传差 异(碱基差异)。线粒体DNA分子标记就属于这类标记，它具有遗传自主性、严格的母系遗 传、拷贝数高、无组织特异性、进化速度快等特点，已经广泛应用于果蝇、鲸、鸟类等群体鉴 定。生物信息学是分子生物学、计算机技术和信息技术的结合，主要是基于分子生物学的研 究结果，借助于包括生物信息学软件等计算机信息技术，准确、直观地揭示不同品种间的遗 传信息差异，已经广泛应用于人类亲子鉴定、动物群体亲缘关系、品种鉴定等领域。
发明内容
本发明的目的是针对以形态学标记为依据来审查育种档案和进行生产性能测定 和运用同工酶、蛋白质等生化标记等鉴定品种存在的准确性不高、鉴定时间长、成本高等方 面的缺陷，提供一种利用分子生物信息学鉴定高邮鸭品种的方法，实现准确、快速鉴定高邮 鸭品种，有利于维护相关人员的利益。本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种利用分子生物信息学鉴定高邮鸭 品种的方法，其特征是，所述的方法是基于基因克隆和DNA测序技术准确获得高邮鸭和受 测鸭种的线粒体DNA(mtDNA)细胞色素b基因序列为基础，运用多种生物信息学软件，准确 计算出每个品种的单倍型、变异位点、单倍型多样度、平均核苷酸差异、核苷酸分歧度和净 遗传距离、品种间Kimura双参数遗传距离、品种群体聚类结果图和单倍型系统发生树，品 种间的遗传信息差异经软件精密计算和分析的结果鉴定真伪高邮鸭品种。本发明基于基因克隆和DNA测序列技术准确获得高邮鸭与受测鸭种线粒体DNA细 胞色素b基因的序列，运用多种生物信息学软件将品种间的碱基差异，准确、直观地反映出品种间种质差异，科学、准确地鉴别高邮鸭品种的真伪。
具体实施例方式结合实施例进一步说明本发明，其方法是(1)对受测蛋鸭品种与高邮鸭中随机抽取30只母鸭，翅静脉采血，血样用苯酚-氯 仿法提取包括线粒体DNA的总DNA。(2)按照GeneBank上发表的绿头鸭mtDNA细胞色素b基因序列(NC009684)设计 一对引物，引物序列为上游引物5，-GTAGCCGCAAGCAAAG-3，；下游引物5，-GGGAGCTGGAGATAAAGG-3，。
(3)利用设计的引物对高邮鸭和受测鸭种的mtDNA细胞色素b基因进行PCR扩增， PCR产物经克隆，并在ABI3730测序仪器上完成测序。(4)测序结果通过Chromasl. 49软件读取，并对测序结果进行人工逐碱基读取和 反复核对，以确保准确无误。(5)用DnaSP4. 10. 7软件统计单倍型、变异位点、单倍型多样度、平均核苷酸差异、 核苷酸分歧度和净遗传距离。(6)根据高邮鸭和受测鸭种序列的单倍型、变异位点、单倍型多样度、平均核苷酸 差异、核苷酸分歧度和净遗传距离，确定品种内及品种间基因序列变异程度，如果平均变异 程度小于2%，则为同一品种，大于2%则为不同品种。(7)运用MEGA4. 0软件计算品种间Kimura双参数遗传距离，并基于Kimura双参数 模型应用UPGMA/NJ法构建群体聚类图，单倍型系统发生树；运用NETW0RK4. 5. 0. 1软件构建 单倍型网络发生树；根据这两种软件分别分析得到的群体聚类图、单倍型系统发生树和单 倍型网络发生树的结果，若受测定鸭种与高邮鸭群体或单倍型聚为一类则为同一品种，否 则为不同品种。本发明中运用的Chromasl. 49 软件、DnaSP4. 10. 7 软件、DnaSP4. 10. 7 软件、 NETW0RK4. 5. 0. 1软件均为现有成熟的软件。<110>江苏省家禽科学研究所
<120>利用分子生物信息学鉴定高邮鸭品种的方法
<140>200910027047. 6
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<160>2
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>细胞色素b基因扩增上游引物 <400>1
GTAGCCGCAAGCAAAG 16 <210>2<211>18 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>细胞色素b基因扩增下游引物 <400>2 GGGAGCTGGAGATAAAGG 18
权利要求
一种利用分子生物信息学鉴定高邮鸭品种的方法，其特征是，所述的方法是基于基因克隆和DNA测序技术准确获得高邮鸭和受测鸭种的线粒体DNA(mtDNA)细胞色素b基因序列为基础，运用多种生物信息学软件，准确计算出每个品种的单倍型、变异位点、单倍型多样度、平均核苷酸差异、核苷酸分歧度和净遗传距离、品种间Kimura双参数遗传距离、品种群体聚类结果图和单倍型系统发生树，品种间的遗传信息差异经软件精密计算和分析的结果鉴定真伪高邮鸭品种(1)在高邮鸭品种和受测鸭品种中随机抽取若干只母鸭，翅静脉采血，血样用苯酚-氯仿法提取包括线粒体DNA的总DNA；(2)按照GeneBank上发表的绿头鸭线粒体DNA(mtDNA)细胞色素b基因序列设计引物；(3)利用设计的引物对高邮鸭和受测鸭种的mtDNA细胞色素b基因进行PCR扩增，PCR产物经克隆，并在ABI3730测序仪器上完成测序；(4)测序结果通过Chromas1.49软件读取，并对测序结果进行人工逐碱基读取和反复核对，以确保准确无误；(5)用DnaSP4.10.7软件统计单倍型、变异位点、单倍型多样度、平均核苷酸差异、核苷酸分歧度和净遗传距离；(6)根据受测鸭种和高邮鸭品种序列的单倍型、变异位点、单倍型多样度、平均核苷酸差异、核苷酸分歧度和净遗传距离，确定鸭品种内及品种间基因序列变异程度，平均变异程度小于2％，则为同一品种，大于2％则为不同品种；(7)运用MEGA4.0软件计算品种间Kimura双参数遗传距离，并基于Kimura双参数模型应用UPGMA/NJ法构建群体聚类图，单倍型系统发生树；运用NETWORK4.5.0.1软件构建单倍型网络发生树；根据这两种软件分别分析得到的群体聚类图、单倍型系统发生树和单倍型网络发生树的结果，若受测定鸭种与高邮鸭群体或单倍型聚为一类则为同一品种，否则为不同品种。
2.根据权利要求1所述的利用分子生物信息学鉴定高邮鸭品种的方法，其特征是，所 述鸭细胞色素b基因序列设计引物为上流引物 5，-GTAGCCGCAAGCAAAG-3，；下流引物 5，-GGGAGCTGGAGATAAAGG-3，。
全文摘要
本发明涉及一种利用分子生物信息学鉴定高邮鸭品种的方法，属于生物品种鉴定技术领域，本发明基于基因克隆和DNA测序列技术准确获得高邮鸭与受测鸭种线粒体DNA细胞色素b基因的序列，运用多种生物信息学软件，准确计算出每个品种的单倍型、变异位点、单倍型多样度、平均核苷酸差异、核苷酸分歧度和净遗传距离、品种间Kimura双参数遗传距离、品种群体聚类结果图和单倍型系统发生树，品种间的遗传信息差异经软件精密计算和分析的结果鉴定真伪高邮鸭品种。
文档编号C12Q1/68GK101812500SQ20091002704
公开日2010年8月25日 申请日期2009年5月25日 优先权日2009年5月25日
发明者宋卫涛, 徐文娟, 朱文奇, 李慧芳, 束婧婷, 汤青萍, 章明, 陈宽维, 韩威 申请人:江苏省家禽科学研究所