专利名称：：一种以动物肝脏为原料同时制备过氧化氢酶和促肝细胞生长液的工艺的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种以动物肝脏为原料同时制备过氧化氢酶和促肝细胞生长液的工艺，属生物活性物质的分离提取
技术领域：
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背景技术：
：过氧化氢酶(Catalase，CAT),是一种高效、安全、环保、节能的生物催化剂，可迅速的将过氧化氢分解为水和氧，在纺织、食品等工业中具有广泛的用途。目前市售的过氧化氢酶主要来源有三个从猪、牛等动物肝脏中提取纯化而得；由变种黑曲霉在通风搅拌等条件下培养而得；由纤维蛋白小球菌经深层发酵提取精致而得。2004年后，国内从猪、牛等动物肝脏中提取生产过氧化氢酶的关键技术有了很大突破。因为成本和价格上的优势，发展很快。目前，用该方法生产的过氧化氢酶因为价格上的优势，在纺织印染行业占领了大部分的市场份额。在纺织行业中，CAT应用于纺织品氧漂后的生物脱氧净化工艺，能在大幅度节约水和能源的情况下，清除氧漂后织物和水浴中对后续活性染料染色可能产生染料分解或染色疵病的残留过氧化氢，縮短工序时间，提高染色质量，减少印染废水排放。该酶也适用于宾馆、医院、洗衣房等使用过氧化氢进行漂白或消毒的纺织品，以防止由于织物中残留过氧化氢的存在而造成使用者皮肤过敏、引发炎症等不良后果，减少有害废水的排放，可避免织物氧化脆损，从而延长使用期限在食品工业中，CAT能迅速有效地分解食品加工后残留过氧化氢(双氧水)，适用于在食品加工过程中使用过氧化氢(双氧水)作为漂白剂、氧化剂、淀粉变性剂、防腐剂的食品除氧，可用于纸塑无菌包装材料杀菌后在包装之前的除氧；以及用于消除牛奶、蛋制品、干酪等生产中因紫外线照射产生过氧化氢而造成的特异臭味，是一种用于食品加工的新型除氧酶；产品也可用作烘焙食品的膨松剂；具有保护食品营养物质不被过氧化氢破坏，避免因过氧化氢随食品进入人体内造成对人体伤害的作用。目前，CAT已经得到广泛的普及应用，国内市场需求量在纺织行业已经达到每年1万吨以上；在食品行业也已达到近千吨的需求量，且随着对食品安全严格要求和过氧化氢酶应用领域的不断拓宽，这个量还在成倍地增长。CAT酶为节能减排，减少纺织、食品行业的环境污染做出了积极的贡献。随着我国产业调整的力度不断加大，环境保护政策的落实到位，作为纺织行业和食品行业实现清洁生产的必需产品之一，CAT的市场需求量将进一步加大。事实上提取CAT时所用原料一-动物的肝脏中，除了CAT之外，还有辅酶A、促肝细胞生长素、肝肽、人体必需氨基酸、优质蛋白质等许多可供开发利用的附加值极高的生物活性因子。"促肝细胞生长素"(H印atocyteGrowth-PromottingFactors)简称HGF，是从动物提取的肝源性的多肽类活性物质，分子量大部分在2万以下，高效液相色谱(HPLC)分析表明本品含有多个协同作用的活性组分，内含16种氨基酸和微量元素，特异性作用于肝脏器官，能直接促进肝细胞DNA合成，调节肝细胞内环磷腺苷水平，从而促进肝细胞再生，修复损伤的肝细胞，也可改善肝细胞膜脂质流动性，通过保护相关转移酶活性维持细胞内外离子平衡，起到抗肝纤维化作用。对四氯化碳诱导的细胞损伤有较好的保护作用，降低谷丙转氨酶，促使病变细胞恢复的功能。一般应用是将其制成注射液药物，应用于肝病，尤其是亚急性重症肝炎(病毒性，肝功衰竭早期或中期)的辅助治疗；对各种肝脏损伤及疾病都有预防和治疗作用。促肝细胞生长素注射液在我国首先由湖南医科大学数位教授历经十几年研究而获得应用于临床的新一代纯生物制剂的促肝类药物。在"促肝细胞生长素"出现以前，人们对重症肝炎患者的治疗束手无策，重症肝炎成为临床上死亡率极高的病种。在动物中，繁殖能力较强、容易获得且价廉的是乳猪肝，具备用其进行规模化工业生产的条件。在国内医学和生物界及医药厂的共同努力下，第一个来源于动物肝脏的促肝细胞素类的药物-注射用促肝细胞生长素于1992年被国家卫生部批准用于临床，其试用效果很快被证实。真正在工业上实现是在2001年以后的事。目前国内已经有几十家生产厂家。本发明是在提取过氧化氢酶时，通过分析检测及摸索发现工艺中产生的废水、废渣经过适当的处理，可以提取许多种对人体有益的营养物质。如将废渣经不同的蛋白酶水解，过滤除渣后，与工艺废水合并，再经一步或几步不同截留分子量的超滤、纳滤或反渗透膜处理，便可加工成不同的目的产物。"促肝细胞生长液"为其中的一种。该液体经过氨基酸谱检测证实，其中富含人体所需的17种氨基酸，总氨基酸达到62.91g/100g;经原子吸收法测定证实，内含丰富的对人体有益的微量元素，尤其是铁、锌、、镁、钙；动物实验证实毒性低，且实验结果显示该液体与对照组相比，对大鼠纤维化肝细胞有明显的修复作用；经药物活性检测(MTT法)刺激指数可达2，3，从而进一步说明该液体具有保肝、护肝功能。该液体经提纯后，可加工成药物一-促肝细胞生长素溶液，也可明经简单的低温干燥处理，加工成具保肝功能的功能食品原料，有极高的附加值。能够在分离提取过氧化氢酶的同时，联产促肝细胞生长液，不但提高了原料的利用率，而且在消除废水和废渣的同时实现企业的增值和增收，形成可实现经济效益与资源环境效益共贏的新工艺国内外尚未见任何报道。
发明内容本发明发明了一种以动物肝脏为原料同时制备过氧化氢酶和促肝细胞生长液的工艺。尤为独特的是，它充分考虑了原料的充分利用和"三废"减排对过氧化氢酶加工生产的可持续发展的意义，在不影响过氧化氢酶的得率和品质的前提下，对现有加工工艺所产生的废水废渣进行了综合利用，通过联产生化药物原料，对动物肝脏原料进行全利用，达到了既不影响过氧化氢酶的得率和品质，实现废渣废水废渣零排放的目的，又能形成一套以动物肝脏为原料同时制备过氧化氢酶和促肝细胞生长液的工艺。这对于过氧化氢酶加工制造业的可持续发展而言是至关重要的。促肝细胞生长素是从动物提取的肝源性的多肽类活性物质，分子量大部分在2万以下。动物肝脏提取了过氧化氢酶后剩余部分废水，经检测发现富含大量的人体必需氨基酸和各种具有保肝作用的肽类活性因子。废渣经过适当的酶解加工处理，酶解液过滤除渣后与工艺废水(初级膜透过液)，经过适当截留分子量的膜处理，截取分子量在2万以下的液体部分，经低温浓縮，即可得到目的产物-一促肝细胞生长液。具体来说，本发明的步骤由以下几步构成1)原料的准备将检验合格的原料切碎后经胶体磨磨成肝浆；2)溶液浸泡将肝浆与一定比例的纯净水混匀后在一定的温度下浸泡一定的时间，使目的产物自溶于溶液中；3)固液分离用适当的分离方式进行固液分离，分别得到液体——提取原液和固体废渣；4)初级膜(过氧化氢酶)分离将得到的提取原液通过适当的膜分离设备进行提取，并根据工艺要求浓縮至适当的酶活单位。分别得到初级膜分离截留液——目的产物之一，过氧化氢酶和膜透过液；5)废渣的酶法水解将步骤3)收集的固体废渣在合适的工艺条件下，利用合适的酶进行酶法水解，过滤除渣后得到酶解液；6)料液的预处理将酶解液与初级膜透过液合并，用夹套加热至90。C，并保持10分钟后冷却至20。C以下；7)次级膜分离提取用截留分子量在15CT500Da的纳滤膜设备分离提取，浓缩至原体积的15-20分之一，收集次级膜截留液；8)目的产物之二的获得收集的该截留液即为目的产物之二一一促肝细胞生长液。具体实施例方式下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。实例11)原料的准备取检验合格的10kg猪肝去除包膜切碎，用无菌蒸馏水反复洗涤2-3次，用胶体磨磨成猪肝浆；2)溶液浸泡向肝浆中加入40kg无菌蒸馏水混匀后储于提取罐中，在28-32。C的温度下浸泡6-9小时，使目的产物自溶于溶液中；3)固液分离离心分离，得到大约46L液体，13kg固体废渣；4)初级膜(过氧化氢酶)分离将得到的液体通过40KDa中空纤维膜超滤膜进行分离提取，并根据工艺要求浓缩，得到18L酶活单位为53，OOOU/mL的过氧化氢酶液；5)废渣的酶法水解将步骤3)收集的13kg固体废渣，加入15L无菌蒸馏水，在pH2-2.5，35-38°C下，用胃蛋白酶酶解12-16小时，液化的液体过滤除渣后得到酶解液13L;7)料液的预处理将13L酶解液与28L初级膜透过液合并，用夹套加热至90'C，并保持10分钟后冷却至20°C以下,得到液体40L;7)次级膜分离提取用截留分子量在15CT500Da的纳滤膜设备分离提取，浓縮至原体积的15-20分之一，收集次级膜截留液，得到2L液体；9)目的产物之二的获得-得到促肝细胞生长液2L。实例2将促肝细胞生长液冷冻干燥后取粉5g，分析其微量元素含量、氨基酸谱,结果分别见表1和表2:表1总蛋白质含量及维生素和矿物质组成<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>该样品经过氨基酸谱检测证实，其中富含人体所需的17种氨基酸，总氨基酸达到62.91g/100g。表2氨基酸组成<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>酸酸(g/100g)5.669.009.3114.802.804.451.772.814.326.872.754.374.176.634.176,372.353.730.430.684.226.711.552.463.044.833.285.215.618.925.048.012.614.1562.91经原子吸收法测定证实，该样品内含丰富的对人体有益的微量元素，尤其是铁、锌、、镁、钙含量非常丰富。实例3:取促肝细胞生长液适量做动物实验-1)动物模型建立SD大鼠，雌雄各半,安静条件常规饲养一周后，以纯玉米渣加胆固醇为饲料，30%乙醇为饮料饲养。实验第1天按0.5mL/kg皮下注射40%0:14液体石蜡液，以后每隔3天注射1次，第8周末杀鼠2只，做普通病理切片，光镜显示早期肝硬化病变；2)治疗将8只大鼠随机分成2组，其中一组用高浓度促肝细胞生长液拌入饲料饲养，另一组按常规饲养，饲养90天后，做普通病理切片，光镜显示，治疗组较对照组早期肝硬化病变明显好转。3)毒性试验a:急性毒性相当于人体用量400倍给小鼠灌胃，72小时无一例死亡；b:慢性毒性相当于人体用量20倍给小鼠灌胃6个月未见任何毒性反应，任何组织器官均未见损伤氨酸酸酸酸酸酸酸酸酸酸酸氨氨酸酸酸基冬氨氨氨氨氨氨氨氨氨氨氨丙亮氨氨氨氨天谷丝组甘苏精丙酪胱缬蛋苯异亮赖脯总8权利要求1、一种以动物肝脏为原料同时制备过氧化氢酶和促肝细胞生长液的工艺。该工艺组成步骤如下1)对动物肝脏进行切碎、磨浆、浸泡提取、固液分离，得到料液和料渣；2)将料液进行初级膜分离和浓缩，得到膜浓缩液和膜透过液；3)将膜浓缩液的酶活力单位调整到规定要求，即得过氧化氢酶成品；4)将固体废渣在合适的工艺条件下，利用合适的酶进行酶法水解，过滤除渣后得到酶解液；5)料液的预处理将酶解液与初级膜透过液合并，用夹套加热至90℃，并保持10分钟后冷却至20℃以下；6)次级膜分离提取用合适的膜设备分离提取，浓缩至一定体的积，收集次级膜截留液；7)收集的该截留液即为目的产物之二----促肝细胞生长液。2，如权利要求1所述，其特征是分离提取促肝细胞生长液的原料是提取过氧化氢酶后的废水和废渣。3、如权利要求1所述，其特征是原料可以是含过氧化氢酶的各种动物肝脏。4、如权利要求1所述，其特征是浸泡提取的溶液可以是水或各种有机溶剂。5、如权利要求1所述，其特征是固液分离可以是离心分离、过滤分离或他们的组合。6、如权利要求1所述，其特征是所采用的初级膜为截留分子量20-60KDa的超滤膜，膜组件的构型是管式膜、巻式膜、平板膜、中空纤维膜或它们的组合。7、如权利要求l所述，其特征是所采用的次级膜为截留分子量150-500Da的纳滤膜，膜组件的构型是管式膜、巻式膜、平板膜、中空纤维膜或它们的组合。8、如权利要求l所述，其特征是可供选用的酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶，或它们的某种组合。全文摘要本发明属生物活性物质的分离提取
技术领域：
。具体涉及一种从提取过氧化氢酶后的废水、废渣中提取促肝细胞生长液的工艺。本工艺适用于以动物肝脏为原料，经匀浆、溶液浸泡、固液分离、初级膜分离，得到过氧化氢酶；将废渣经酶法水解、过滤除渣后与初级膜透过液合并，经次级膜分离、低温浓缩，得到促肝细胞生长液。该液体经提纯后可制备药品——促肝细胞生长素溶液，或经低温干燥后制成具保肝作用的功能食品。按照本发明操作，以猪肝为例，每加工1kg猪肝能够获得50,000U/mL液体过氧化氢酶2L，同时获得刺激指数为2.3，总氨基酸为62.91g/100g的促肝细胞生长液200mL。文档编号C12P21/06GK101560506SQ20091002711公开日2009年10月21日申请日期2009年5月22日优先权日2009年5月22日发明者冯志强,吴保承,栋张,杨春霞,汤鲁宏申请人:江苏省江大绿康生物工程技术研究有限公司