专利名称：一种多粘类芽孢杆菌及利用其制备光学纯r,r型2,3-丁二醇的方法
技术领域：
本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种多粘类芽孢杆菌及利用其制备光学纯尺i 型2,3-丁二醇的方法。
背景技术：
能源植物——菊芋是一种多年生草本植物，俗称洋姜、鬼子姜，具有耐盐碱、产量 大等优点。菊芋中含有菊粉(又称菊糖)，系多聚果糖，可占湿重的15~20%、干重的 80%左右，滩涂荒地生物量可达3~6吨/亩。利用荒地及滩涂资源面积发展菊芋的规模化 种植，并以之为基础形成生物基产品开发的产业链，能充分利用和改良广袤的滩涂盐碱 地，提高菊芋的附加值和沿海农民的种植积极性。在获得产业经济效益的同时，还能实 现生态治理，解决资源和环境的问题，潜力巨大。利用菊芋菊粉水解产果糖或低聚果糖， 近年来引起了国内外学者的广泛关注，成为研究热点。
2,3-丁二醇是重要的四碳平台化合物，用途广泛，可应用到化工、食品、燃料以及 航空航天等多个领域，具有生物降解性。2，3-丁二醇存在3个旋光异构体，分别为尺及型、
S，S型和m^o型(内消旋型)，结构式如下
<formula>formula see original document page 3</formula>
&及型2， 3-丁二醇 SS型2' 3-T二醇 Meso型2， 3-丁二醇
手性尺i -2，3-丁二醇可用于抗冻剂等，此外，合成手性化合物如药物等底物必然要 求具有单一构型的2,3-丁二醇。
目前化学法生产2,3-丁二醇主要是以石油裂解时产生的四碳类碳氢化合物在高温、 高压下水解得到的，且产物为混合型的2，3-丁二醇。生物法生产2,3-丁二醇的主要菌种有 克雷伯氏菌属(K/e&wW/a入芽孢杆菌属(^aem'6ad//1^、假单胞菌属(PwMfitowo"fl^和沙雷 氏菌属(Sen^/a)，在这些菌种中，克雷伯氏菌属的产酸克雷伯氏菌(^:/^ '￡//0! oc声oc^ 和芽孢杆菌属的多粘类芽孢杆菌(paem力aa7/iwpo(ym，yxa)显示出较高的生产2,3-丁二醇 的潜力。上述微生物发酵产2,3-丁二醇的研究均以单糖作为原料，如葡萄糖、木糖等， 尚未发现以未经任何水解处理的多糖直接作为底物、边糖化边发酵的做法。另外，微生 物合成的2，3-丁二醇大多数是旋光异构体的混合物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能产菊粉酶的多粘类芽孢杆菌，用于制备光 学纯尺及型2，3-丁二醇。
本发明还要解决的一个技术问题是提供上述多粘类芽孢杆菌利用未经任何水解处 理的菊芋菊粉作为唯一碳源制备光学纯尺及型2,3-丁二醇的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下
本发明人实验室选育并保藏的微生物菌株为多粘类芽孢杆菌(/7flew/km7/"s ，(vm^fl)ZJ-9，目前该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简 称CGMCC)，保藏单位地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，登记 入册的编号是CGMCC No. 3044，保藏日期是2009年4月29日。以此菌作为生产菌
株o
CGMCCNo. 3044菌株具有下述性质
1、 菌落形态学特征
在营养琼脂上，30'C培养48h出现白色小菌落(9=0.6~1.2111111)，菌落呈圆形，表面 光滑，粘状，中央凸起，透明。适当延长培养，菌落增大，细胞的尺寸和形状变化很小。
2、 生理与生化特性
a. 培养温度28~39°C，最适温度为30。C;
b. 在pH5.0 7.5范围内生长；
c. 色素产生情况不产色素；
d. 耐NaCl浓度在5%浓度可以生长。
3、 16SrDNA序列分析
测得16S rDNA大部分序列1498bp ,具体如SEQ ID No.l所示。将所测序列从 GeneBank数据库中的相关种进行比较，构建16S rDNA全序列为基础的系统发育树。结 果表明菌株ZJ-9与多粘类芽孢杆菌达到99.9o/。同源。结合形态学观察、生理生化鉴定 认定本发明使用的是多粘类芽孢杆菌，具体为多粘类芽孢杆菌ZJ-9(CGMCC No. 3044)。
4、 营养特征
多粘类芽孢杆菌ZJ-9的培养基中不需要添加生长因子，可以利用多种化合物作为 碳源，这些物质既可以单独使用，也可以适当的比例复配充当碳源。有机氮或无机氮都 可以作为氮源使用。培养基中各组分用量为碳源40 100g/L，氮源6 15g/L，无机盐 0.1-10 g/L，其余为水。碳源一般采用菊芋菊粉、葡萄糖、木糖、果糖、乳酸和甘油等， 氮源可采用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米桨、豆饼粉、棉子饼粉、尿素以及(NH4)2S04、 NH4C1等，培养基中还包括钾盐、钴盐、钠盐、钙盐、镁盐、锌盐、铁盐、锰盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐等常用的无机盐类。
利用上述多粘类芽孢杆菌制备光学纯iU 型2,3-丁二醇的方法将保藏号为 CGMCCNo.3044的菌株接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行培养， 发酵生产光学纯尺及型2,3-丁二醇，其中，所述碳源为未经任何水解处理的菊芋菊粉。
其中，所述培养基中，各组分用量为碳源40~100g/L，氮源6~15 g/L，无机盐0.1~10 g/L，其余为水。
其中，培养基中，所述氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼 粉、尿素、(NH4)2S04和NH4C1中的一种或多种；所述无机盐为钾盐、钴盐、钠盐、钙 盐、镁盐、锌盐、铁盐、锰盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的一种或多种。
其中，将保藏号为CGMCC No. 3044的菌株进行培养的条件为初始pH范围为 5.0~7.5，培养温度为28 39'C，通风，搅拌培养，培养时间为48~84小时。
具体地说
本发明提供的是利用菊芋菊粉一步发酵法制备光学纯尺及型2,3-丁二醇的方法，是 将保藏号CGMCC No. 3044的多粘类芽孢杆菌ZJ-9菌株斜面活化一天后(斜面培养基 采用牛肉膏蛋白胨培养基)，在不经任何水解处理的菊芋菊粉为唯一碳源、添加氮源和 无机盐的培养基上培养48 84小时，可以生成10 60g/L光学纯尺i 型2,3-丁二醇，光 学纯度达98。/。以上。优选发酵条件为培养基:不经任何水解处理的菊芋菊粉40 100g/L， 玉米浆5.9~10 g/L， (NH4)2SO40,l~5g/L， K2HPO40.1~5 g/L;发酵温度28 39。C，更优选 28~32°C;培养基的初始pH范围为5.0~7.5，更优选为5.4~6.3;通风、搅拌培养48~55 小时。
有益效果本发明的一种多粘类芽孢杆菌及利用其制备光学纯尺i 型2,3-丁二醇的
方法与现有技术相比，具有如下优势
O)本发明筛选到一株直接利用菊芋菊粉产光学纯尺i 型2,3-丁二醇，该菌产菊 粉酶，能直接利用不经水解处理的菊芋菊粉作为唯一碳源发酵生产光学纯尺i 型2，3-丁二醇，集产酶、糖化和光学纯尺及型2，3-丁二醇发酵为一体的一步法发酵，操作方便 简单，培养条件十分粗放。
(2) 可以使用豆饼粉(替代酵母膏或蛋白胨)作为光学纯尺i 型2，3-丁二醇发酵 培养基的氮源，使发酵原料成本大幅下降。
(3) 利用本发明筛选到的生产菌及本发明所提供的培养方法生产的2,3-丁二醇为 光学纯尺i 型，光学纯度达98%以上，提高了产品生产价值及其附加值。
具体实施例方式
5根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，实施例所描述的具体的物料配比、 工艺条件及其结果仅用于说明本发明，使本领域的技术人员容易理解，而不应当也不会 限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1:
斜面培养基蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L， NaC15g/L，琼脂20g/L， pH7.0。 种子培养基菊芋菊粉20g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L， NaC15g/L， pH7.0。 发酵培养基菊芋菊粉40 g/L，牛肉膏6 g/L， K2HP04 1.5 g/L， MgS047H20 0.3 g/L， CaCl20.3g/L， pH6.0; 250 mL三角瓶装液量50 mL， 115。C灭菌30分钟。
将保藏号为CGMCCNo. 3044的多粘类芽孢杆菌ZJ-9接两环于种子培养基中，30 °C 培养24 h得种子液，将种子液按发酵液体积4%的接种量接入冷却后的发酵液中，30°C ， 120 rpm/min培养48 h，发酵液中含光学纯i ，i 型2，3-丁二醇19.7 g/L，光学纯度达99%。
实施例2:
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基菊芋菊粉40g/L，牛肉膏3g/L， (NH4)2S044g/L， K2HP04 1.75 g/L， KH2P04 2.9g/L， MgS04.7H20 0.05 g/L， FeS047H20 0.01 g/L， ZnS04.7H20 0.001g/L， MnS047H20 0.05 g/L， CaCl20.3g/L， pH 7.0。 250 mL三角瓶装液量50 mL， 115。C灭 菌30分钟。
将保藏号为CGMCC No. 3044的多粘类芽孢杆菌ZJ-9接两环于种子培养基中，30 °C 培养24h得种子液，将种子液按发酵液体积4%的接种量接入冷却后的发酵液中，37°C， 120 rpm/min培养50小时，发酵液中含光学纯尺及型2，3-丁二醇19.5 g/L，光学纯度达 98%。
实施例3:
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基菊芋菊粉100g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨6g/L， (NH4)2S04 3 g/L， K2HP044g/L， KH2P04lg/L， MgS04.7H20 0.3 g/L, CaCl20.3g/L， Co(NO3)20.04 g/L， pH5.0。 500mL三角瓶装液量lOOmL， 115。C灭菌30分钟。
将保藏号为CGMCC No. 3044的多粘类芽孢杆菌ZJ-9接两环于种子培养基中，30°C 培养24h得种子液，将种子液按发酵液体积4%的接种量接入冷却后的发酵液中，35°C， 120rpm/min，培养48小时，发酵液中含光学纯尺及型2,3-丁二醇41.8 g/L,光学纯度 达98%。实施例4:
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基菊芋菊粉60g/L，玉米浆10g/L， (NH4)2S042g/L， K2HP04 4 g/L， pH6.0; 500mL容积的三角瓶中装液量100mL， 115。C灭菌30分钟。
将保藏号为CGMCC No. 3044的多粘类芽孢杆菌ZJ-9接两环于种子培养基中，30°C 培养24h得种子液，将种子液按发酵液体积4%的接种量接入冷却后的发酵液中，30°C， 120 rpm/min培养55 h后，发酵液中光学纯尺及型2,3-丁二醇的含量为28.6 g/L，光学 纯度达99%。
实施例5:
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基在40g/L、 3L的菊粉粗提液中加入18g玉米浆、10g (NH4)2S04、 7.5 gK2HP04， pH6.0，配成发酵液，装入一个5 L的玻璃搅拌发酵罐中，115'C蒸汽灭菌 30分钟。
将保藏号为CGMCC No. 3044的多粘类芽孢杆菌ZJ-9接两环于种子培养基中，30 °C， 120rpm/min培养24h得种子液，将种子液按发酵液体积5%的接种量接入冷却后的 发酵液中，30。C培养(通风量0.5wm，搅拌转速160rpm/min) 50h。发酵液中含光学 纯尺i 型2，3-丁二醇19.4 g/L，光学纯度达99%。
实施例6:
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基将420 g豆饼粉、60 g K2HP04、 10.5 g MgS04.7H20和10.5 g CaCl2， 加入到40g/L、 35L的菊粉粗提液中，调节pH为6.0，装入50 L机械搅拌发酵罐中， 115'C蒸汽灭菌30分钟。
将保藏号为CGMCC No. 3044的多粘类芽孢杆菌ZJ-9接两环于种子培养基中，30 °C， 120rpm/min培养24h得种子液，将种子液按发酵液体积5%的接种量接入冷却后的 发酵液中，30。C培养48h。发酵液中含光学纯尺及型2,3-丁二醇182g/L，光学纯度达 98%。SEQUENCE LISTING
〈110〉盐城工学院
〈120〉 一种多粘类芽孢杆菌及利用其制备光学纯R，R型2，3-丁二醇的方法 〈130〉 YIT090512 〈160> 1
〈170〉 Patentln version 3. 3
〈210> 1 〈211〉 1498 〈212〉 DNA
〈213> 多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)
〈400> 1
agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc 60 ggtagagaga agcttgcttc tcttgagagc ggcggacggg tgagtaaagc ctaggaatct 120 gcctggtagt gggggataac gttcggaaac ggacgctaat accgcatacg tcctacggga 180 gaaagcaggg gaccttcggg ccttgcgctei tcagatgagc ctaggtcgga ttagctagtt 240 ggtgaggtaa tggctcacca aggcgacgst ccgtaactgg tctgagagga tgstcagtca 300 cactggaact gagaceicggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca 360 atgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag 420cactttaagt tgggaggaag ggcattaacc taatacgtta gtgttttgac gttaccgaca 480
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aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 960
aagaacctta ccaggccttg acatccaatg aactttctag agatagattg gtgccttcgg 1020
gaacattg已g acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080
gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca cgtaatggtg ggcactxtaa 1140
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ggagctaatc ccacaaaacc gatcgtagtc cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga 1320
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9tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgcaccag aagtagctag tctaaccttc 1440 gggaggacgg ttaccacggt gtgattcatg actggggtga agtcgtaaca aggtaacc 1498
权利要求
1、一种多粘类芽孢杆菌，其分类命名为多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)ZJ-9，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCCNo.3044。
2、 利用权利要求1所述多粘类芽孢杆菌制备光学纯尺及型2，3-丁二醇的方法，其 特征在于将保藏号为CGMCC No. 3044的菌株接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌 培养基中进行培养，发酵生产光学纯尺i 型2，3-丁二醇，其中，所述碳源为未经任何水 解处理的菊芋菊粉。
3、 根据权利要求2所述的利用多粘类芽孢杆菌制备光学纯尺及型2，3-丁二醇的方 法，其特征在于所述培养基中，各组分用量为碳源40 100g/L，氮源6 15g/L,无机 盐0.1 10g/L，其余为水。
4、 根据权利要求2或3所述的利用多粘类芽孢杆菌制备光学纯尺及型2，3-丁二醇 的方法，其特征在于培养基中，所述氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、 棉籽饼粉、尿素、(NH4)2S04和NH4C1中的一种或多种。
5、 根据权利要求2或3所述的利用多粘类芽孢杆菌制备光学纯尺i 型2,3-丁二醇 的方法，其特征在于培养基中，所述无机盐为钾盐、钴盐、钠盐、钙盐、镁盐、锌盐、 铁盐、锰盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的一种或多种。
6、 根据权利要求2所述的利用多粘类芽孢杆菌制备光学纯尺及型2，3-丁二醇的方 法，其特征在于将保藏号为CGMCCNo.3044的菌株进行培养的条件为初始pH范围 为5.0~7.5，培养温度为28 39。C，通风，搅拌培养，培养时间为48~84小时。
全文摘要
本发明公开了一种多粘类芽孢杆菌，其分类命名为多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)ZJ-9，其保藏号为CGMCC No.3044。本发明还公开了利用上述多粘类芽孢杆菌制备光学纯R，R型2，3-丁二醇的方法，即将保藏号为CGMCC No.3044的菌株接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行培养，发酵生产光学纯R，R型2，3-丁二醇，其中，所述碳源为未经任何水解处理的菊芋菊粉。通过上述方法生成的光学纯R，R型2，3-丁二醇，光学纯度可达98％以上。该菌株能直接利用菊芋菊粉，培养条件粗放，操作方便简单，光学纯R，R型2，3-丁二醇产量大，光学纯度高，生产成本低，有利于产业化大规模生产。
文档编号C12N1/20GK101565683SQ20091002680
公开日2009年10月28日 申请日期2009年6月1日 优先权日2009年6月1日
发明者斌 彭, 李凤伟, 荣 邵, 健 高 申请人:盐城工学院