专利名称：属于芽孢杆菌属的肌苷生产细菌和生产肌苷的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产肌苷的方法，肌苷是一种重要的物质，可用作合成原料以生产5’-肌苷酸，本发明还涉及一种用来生产肌苷的新的微生物。
背景技术：
存在已知的利用芽孢杆菌属微生物发酵生产肌苷的方法，所述的微生物是腺嘌呤营养缺陷型菌株或者进一步被赋予了对各种物质，包括嘌呤类似物抗性的腺嘌呤营养缺陷型菌株(日本专利公开(KOKOKU)号38-23099，54-17033，55-2956，55-45199，57-14160，57-41915和日本专利待审公开(KOKAI)号59-42895)，短杆菌属微生物(日本专利公开(KOKOKU)号51-5075，58-17592，Agric.Biol.Chem.，42，399(1978))，等等。
为获得这样的突变菌株，常规使用的一种方法是进行诱变处理如紫外线照射或者亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)处理，用合适的选择培养基筛选目标突变菌株。另一方面，已经在芽孢杆菌属微生物运用基因工程技术繁育产核酸菌株(日本专利待审公开(KOKAI)号58-158197，58-175493，59-28470，60-156388，1-27477，1-174385，3-58787，3-164185，5-84067，5-192164，11-346778(美国专利号6,284,495))和短杆菌属微生物(日本专利待审公开(KOKAI)号63-248394)。特别地，例如，已经公开了一种用嘌呤操纵子的阻遏蛋白基因(purR)被破坏的杆状细菌，来有效地生产核酸化合物如次黄嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤和腺嘌呤的方法(日本专利待审公开(KOKAI)号11-346778(美国专利号6,284,495))。
此外，对于枯草芽孢杆菌来说，除嘌呤操纵子的基因外，已得知前述的阻遏蛋白控制参与腺嘌呤生物合成的purA基因和参与嘧啶生物合成的嘧啶操纵子的基因的表达(H.Zalkin et al.，J.Bacteriol.，179，7394-7402，1997)。
此外，对于大肠杆菌来说，已知通过破坏琥珀酰-AMP合酶基因(purA)而赋予腺嘌呤营养缺陷型来改善其嘌呤核苷生产的能力(国际专利公开WO99/03988)。而且，也已知通过破坏嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)而阻遏肌苷和鸟苷降解为次黄嘌呤和鸟嘌呤来改善嘌呤核苷生产的能力(国际专利公开WO99/03988)。
发明内容
本发明的一个目的是制备出一种适用于通过发酵生产肌苷的微生物并且提供一种使用该微生物生产肌苷的方法。
本发明的进一步目的是提供一种经过修饰而使受6-乙氧基嘌呤生长抑制减少，且其具有肌苷生产能力的芽孢杆菌。
本发明的进一步目的是提供上述的芽孢杆菌，其是源自属于芽孢杆菌属的亲本菌株的一种突变菌株，且在含有6-乙氧基嘌呤的培养基中培养时显示出相对于亲本菌株有利的生长。
本发明的进一步目的是提供上述的细菌，其中培养基具有2000mg/L含量的乙氧基嘌呤。
本发明的进一步目的是提供上述的细菌，其中培养基是固体培养基。
本发明的进一步目的是提供上述的细菌，其中通过接种细菌悬液至含有6-乙氧基嘌呤的固体培养基和不含6-乙氧基嘌呤的固体培养基中培养细菌时，细菌显示出80或更高的相对生长度，相对生长度由以下等式定义 相对生长度(％)＝[在含有6-乙氧基嘌呤的培养基中观测的菌落直径(mm)]/[在不含有6-乙氧基嘌呤的培养基中观测的菌落直径(mm)]×100 本发明的进一步目的是提供上述的细菌，其中含有6-乙氧基嘌呤的固体培养基具有2000mg/L含量的6-乙氧基嘌呤。
本发明的进一步目的是提供上述的细菌，其中固体培养基是基本培养基。
本发明的进一步目的是提供上述的细菌，其一个或者多个基因缺陷，这些基因负作用于肌苷的生物合成或者参与肌苷的降解，并选自嘌呤操纵子阻遏蛋白基因、琥珀酰-AMP合酶基因和嘌呤核苷磷酸化酶基因。
本发明的更进一步目的是提供一种生产肌苷生产能力改善的芽孢杆菌的方法，该方法包括从芽孢杆菌群中选择在含有6-乙氧基嘌呤的培养基中表现为有利生长的菌株，并从获得的菌株中选择显示出肌苷生产能力高的菌株。
本发明的更进一步目的是提供上述的方法，其中芽孢杆菌群是通过诱变处理属于芽孢杆菌属的亲本菌株获得的。
依照本发明，提供了一种具有肌苷生产能力的微生物和一种使用该微生物生产肌苷的方法。
图1是表示一种6-乙氧基嘌呤抗性菌株的肌苷(HxR)和次黄嘌呤(Hyp)生产量的图表。
具体实施例方式 为达到上述目的，本发明的发明人进行了研究。结果，通过修饰芽孢杆菌而使受6-乙氧基嘌呤生长抑制减少，能够改善芽孢杆菌的肌苷生产能力，发明人因此完成了本发明。
本发明的芽孢杆菌是经过修饰而使受6-乙氧基嘌呤生长抑制减少，且其具有肌苷生产能力。
本文使用的“肌苷生产能力”的表述是指本发明的芽孢杆菌具有的一种使肌苷在培养基中积累的能力，其量足以能够从培养基中收集肌苷。例如，当细菌在培养基中培养时，有4g/L或者更多的肌苷和相当肌苷含量的次黄嘌呤。
芽孢杆菌的例子包括但不限于枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，短小芽孢杆菌等等。
枯草芽孢杆菌的例子包括但不限于枯草芽孢杆菌168Marburg菌株(ATCC6051)、枯草芽孢杆菌PY79(Plasmid，1984，12，1-9)等等，解淀粉芽孢杆菌的例子包括但不限于解淀粉芽孢杆菌T(ATCC 23842)，解淀粉芽孢杆菌N(ATCC23845)等等。
本发明的芽孢杆菌可以通过修饰具有肌苷生产能力的菌株致使受6-乙氧基嘌呤生长抑制减少而获得。本发明的芽孢杆菌也可以通过修饰已修饰过的菌株致使受6-乙氧基嘌呤生长抑制减少而获得，以便赋予肌苷生产能力或者改善其肌苷生产能力。
通过例如赋予芽孢杆菌腺嘌呤营养缺陷或者，除了腺嘌呤营养缺陷以外，对药物如嘌呤类似物的抗性，可以获得具有肌苷生产能力的芽孢杆菌(日本专利
发明者富永美佐, 岛崎敬士, 松野洁, 山下穰 申请人:味之素株式会社