专利名称：芽孢杆菌属细菌和杀虫蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及消除虫害有效的苏云金芽孢杆菌新菌株，由该菌株产生的晶状蛋白质包含体，包含所说的包含体的杀虫蛋白质，和编码这一蛋白质的基因。此外，本发明还涉及昆虫消除剂和消除昆虫的方法。
背景技术：
与化学合成杀虫剂相比，微生物杀虫剂对天然环境影响小，而且被认为是化学合成杀虫剂的一种有效的替代品。事实上，从19世纪60年代早期起，含有作为有效成分的苏云金芽孢杆菌菌体细胞(下文称作″Bt菌″)或由这些细菌产生的晶状包含体(下文称作″CIs″)的微生物杀虫剂(下文称作″Bt剂″)已被用来防治鳞翅目的各种昆虫。
Bt菌是革兰氏-阳性菌，在孢子形成期细胞中产生CIs(H.Hofte和H.R.Whiteley；微生物评论，53，242，1989)。昆虫摄食一定的它们敏感的CIs后，几个小时内将终止摄食并死去。由于CIs的这种作用对昆虫是特异性的，Bt剂对其它动物与植物没有毒性，因此被认为是十分安全的杀虫剂。
包含CIs的杀虫蛋白质由Bt菌的质粒或基因组DNA中编码的基因的转录和翻译产生。迄今为止，已分离了一百种以上编码杀虫蛋白质的基因，但是已经知道所说的编码蛋白质的杀虫活性不同，是它们的氨基酸序列的函数(P.A.Kumar等，应用微生物进展，42，1，1996)。因此认为，具有新的杀虫活性的Bt菌株具有新的杀虫蛋白质基因。
苏云金芽孢杆菌血清变型Kurstaki HD-1(下文称作″HD-1″)(害虫和植物病害的微生物防治，1970-1980，编者H.D.Burges，学院出版社，pp.35-44，1981)是市售Bt剂中最常用的Bt菌株。
包含作为有效成分的HD-1的Bt剂已经在消除对合成农业化学品已产生显著抗性的鳞翅目小昆虫(如小菜蛾)方面有效。然而，最近报道了小菜蛾田间菌株的检测结果，发现其已产生了对HD-1的抗性，这在害虫防治中形成一个严重的问题。
此外，归类为鳞翅目的夜蛾科斜纹夜蛾大昆虫，由于对合成杀虫剂灵敏度低，防治起来困难，而且它们可以对植物造成毁坏性的破坏。事实上，没有这类昆虫(如夜蛾科的斜纹夜蛾)能通过常规的Bt剂有效地防治，开发有效的Bt剂是合乎需要的。
夜蛾科的昆虫，特别是Spodoptera sp对Bt剂极端不灵敏有以下可能的原因(1)Spodoptera sp没有任何可以结合到CIs中杀虫蛋白质上的受体(Shuichiro Inagaki，Seibutsu to Kagaku，30，74，1992)(2)CIs中的蛋白质被消化，吸收，或者在Spodoptera的消化液中失活，使所说的蛋白质不可能达到靶受体。
同样，已经需要开发对夜蛾科昆虫具有杀虫活性的新CIs。
大多数由天然环境分离的Bt菌对鳞翅目昆虫或任何其它昆虫没有杀虫活性。极少数菌株显示出防治目标昆虫的实用的杀虫活性，可能是因为Bt菌产生的CIs通过以下过程杀死所说的昆虫(1)昆虫摄食CIs，(2)CIs在消化道中溶解产生前毒素(杀虫蛋白质)，(3)前毒素通过酶活化为毒素(加工过程)，(4)活化的毒素(所加工的杀虫蛋白质)结合在昆虫的中肠(mid-gut)细胞的受体上，形成微孔，和(5)昆虫的中肠细胞分解。
消化道环境因昆虫不同各异，并与昆虫的膳食密切相关。因此，只有当昆虫将它们和其它食物一起摄入时，CIs失活或活化成为杀虫的，不同昆虫也不同，因此相信，只有步骤(1)到(5)在昆虫中肠完成，CIs才对该昆虫具有杀虫活性。
另一方面，已知孢子(在Bt菌的生活史中的一个阶段)具有对CIs的杀虫活性的显著协同作用。R.Milne等(苏云金芽孢杆菌的分析化学，编者L.A.Hickle美国化学学会p22，1990)曾报道由于孢子的存在，两种CIs的杀虫活性被反转。W.J.Mear等(应用环境微生物61，2086，1995)曾报道仅摄食Bt菌产生的CIs的昆虫比摄食CIs和孢子混合物的昆虫易变得更有抗性。这些报道表明由Bt菌产生的两个组分，即CIs和孢子，在与昆虫相互作用中密切相关。因此，研究者正专心研究孢子在昆虫中抑制对Bt剂抗性的发展中的作用。
发明概要本发明发明人现已成功地分离了一种Bt菌株，其可有效防治广谱昆虫。这一菌株在防治昆虫(包括夜蛾科家族的昆虫)上非常有效。
而且，本发明发明人已发现所说的Bt菌株产生的CIs与菌株HD-1产生的CIs相比，在碱性条件(pH9至10)下具有更大的可溶性和稳定性；单是CIs即对斜纹夜蛾和小菜蛾具有高水平的杀虫活性；CIs和孢子组合比单纯的CIs对斜纹夜蛾具有更高的杀虫活性；而且加溶的(solubilized)CIs和孢子共存时，杀虫活性可以再现。
此外，本发明发明人已确定了这一Bt菌株产生的杀虫蛋白质的氨基酸序列，并且分离了编码这一氨基酸序列的基因。
因此，本发明的一个目的是，提供不仅对鳞翅目昆虫而且对其它昆虫具有杀虫活性Bt菌。本发明的另一个目的是，提供由所说的Bt菌产生的杀虫蛋白质、编码所说蛋白质的基因、具有所说基因的载体、以及具有所说基因的宿主。
本发明的另一个目的是提供能产生杀虫蛋白质的转化的植物、消除虫害的药剂和消除虫害的方法。
按照本发明的新菌株是菌株SSK-10，其以保藏号PERM BP-6162保藏在工业科学技术机构的国立生物科学和人体技术研究所。这一菌株被分类为苏云金芽孢杆菌。
按照本发明的杀虫蛋白质具有以下氨基酸序列，(a)SEQ ID NO2的氨基酸序列，或(b)SEQ ID NO2的氨基酸序列，其具有杀虫活性，其中在SEQ ID NO2中的一个或多个氨基酸被取代或被缺失，或者一个或多个氨基酸被添加或被插入到SEQ ID NO2的氨基酸序列中。微生物的保藏按照本发明的新菌株SSK-10已于1996年11月12日保藏在工业科学技术机构的国立生物科学和人体技术研究所(1-3Higashi 1-Chome，Tsukuba city，Ibaraki，日本)，保藏号为FERM BP-6162。
附图简要描述
图1说明按照本发明的杀虫蛋白质的基因的转录分析的结果。有RT利用有RT的反应溶液。没有RT利用没有RT的反应溶液。
发明详述微生物SSK-10菌株是从Sakado市Saitama县的家庭尘埃中分离的。其特征在表1中显示。
表1菌落特性典型的Bt菌大菌落，有一个无色的表面。生长期细胞形态典型的Bt菌。形态特性可变的杆菌(1.0~1.2μ×3.0~5.0μ)。革兰氏染色阳性。孢子形态椭圆。观察不到由孢子造成的孢子囊显著膨胀。鞭毛的血清型分类为H7(或者血清变型aizawai)*细胞内含物大的双金字塔形晶状蛋白质包含体(SDS-PAGE测得分子量大约130kDa)。杀虫蛋白质分类为Cry9n。同源性研究显示即使与同源性最大的Cry9Cal(应用环境微生物，62，p80，1996)也仅有71％的同源性。需氧/厌氧特性兼性厌氧细菌。生化特性过氧化氢酶反应阳性卵磷脂酶反应 阳性VP反应阳性*H血清的制备和菌株的分类根据M.Ohba和K.Aizawa，无脊椎动物病理学杂志，15，139-140，1978进行。
有关本发明新菌株产生的CIs和孢子的非常特别的特性更具体地解释如下。
J.D.Tang(应用环境微生物，62，564，1996)曾报道CryI杀虫蛋白质的特征，已知CryIC对夜蛾科的noctuids特别有效，但是对小夜蛾的昆虫，它的杀虫活性大约仅是HD-1菌株产生的CryIA(a)的杀虫活性1/10。而且，包含CryIC和CryIA的Bt菌，正如日本公开专利出版物509235/1993所揭示的，其杀虫活性比HD-1菌株的杀虫活性对Spodoptera fruqiperda而言高三倍，对小夜蛾而言高两到数倍。相对而言，由菌株SSK-10的细胞产生的CIs比由菌株HD-1的细胞产生的CIs，对斜纹夜蛾的杀虫活性至少高30倍，对小夜蛾的杀虫活性至少高五倍。在碱性条件下(pH9～10)，菌株SSK-10的CIs比菌株HD-1的CIs有更特异的溶解性和更高的稳定性。
此外，菌株SSK-10的杀虫蛋白质基因碱基序列的同源性检索(GenBank，EMBL，DDBJ，PDB序列)显示与已知Bt杀虫蛋白质基因的小的同源性。即使是与同源性最高的Cry9Cal相比，在氨基酸水平仅发现71％的同源性(B.Lambert等，应用环境微生物，62，80，1996)。Bt杀虫蛋白质以分子量为130kd～140kd的前毒素产生，然后在昆虫中肠中消化成60kd～70kd的毒素。事实上，已知这一毒素有杀虫活性，前毒素的C-末端位点是不需要的(H.Hofte和H.R.Whiteley，微生物回顾，53，242，1989)。这样，在有限的氨基酸序列(即对杀虫活性所需的从N-末端位点的第1个到第700个氨基酸)上进行同源性检索(GenBank CDS翻译物，PDB，SwissProt，PIR)。观察到所说的杀虫蛋白质基因与同源性最高的Cry9Cal只有60％的同源性，清楚地表明这一基因是一个新基因。
这些研究结果表明菌株SSK-10是一种新菌株，产生一种新的CI。
此外，杀虫活性由将菌株SSK-10细胞产生的孢子与CIs组合得到提高，杀虫活性由组合自身没有任何杀虫活性的加溶的CIs(下文称作SCIs)与所说的孢子得到恢复。而且发现，这些作用可以以与普通培养中相同的孢子/CIs比，达到相当可观的程度。因此，利用CIs(或SCIs)和本发明新菌株SSK-10产生的孢子，可提供一种虫害防治的高效Bt剂。
本发明的SSK-10菌株的细胞可在普通条件下培养。例如，利用包含碳源(如葡萄糖)和氮源(如大豆粉)的培养基，在20到40摄氏度间的一适当培养温度下，可进行培养。培养优选地在需氧条件下进行，同时通气搅拌1至4天。杀虫蛋白质及其基因本发明提供了由菌株SSK-10的细胞产生的杀虫蛋白质。
按照本发明的杀虫蛋白质具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。此外，按照本发明的杀虫蛋白质可以具有SEQ ID NO2的氨基酸序列，其具有杀虫活性，其中一个或多个(例如一个到几个)氨基酸添加或者插入到SEQ ID NO2的氨基酸序列中，或者SEQ ID NO2中的一个或多个(例如一个到几个)氨基酸被取代或缺失。应当清楚，通过参考SEQ ID NO2的序列，本领域技术人员可以添加，插入，取代或缺失SEQ ID NO2的氨基酸序列中的氨基酸而没有任何特殊的困难。
在本发明中，术语“具有杀虫活性的蛋白质”指本领域技术人员评估为杀虫的蛋白质；例如，在与试验实施例1～3和5～7相同的条件下进行的实验中评估为杀虫的蛋白质。
如实施例所示，按照本发明杀虫蛋白质对鳞翅目，鞘翅目和/或双翅目具有杀虫活性。尤其对分类为鳞翅目夜蛾科的斜纹夜蛾和小菜蛾具有高的杀虫活性。
分类为鳞翅目的昆虫例子包括斜纹夜蛾(Spodoptera litura)，甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)，甘蓝夜蛾(Mamesta brassicae)，小菜蛾(Plutella xylostella)，美国白蛾(Hyphantria cunea)，褐带卷蛾的种(Adoxophyes sp.)，Autographa nigrisigna，及小菜粉蝶(Pieris rapae)。
分类为鞘翅目的昆虫例子包括Anomala cuprea，日本弧丽金龟(Popillia japonica)，Lissorhoptrus oryzophilus，及Aulacophora femoralis。
分类为双翅目的昆虫例子包括埃及伊蚊(Aedea aegypti)和尖音库蚊(Culex Pipiens)。
按照本发明杀虫蛋白质可以是晶状蛋白质包含体形式的。这种形式的蛋白质可以通过在微生物中(尤其是在转化的大肠杆菌中)表达本发明的杀虫蛋白质获得，或通过培养本发明新菌株SSK-10的细胞获得。在大肠杆菌中表达的方法将在下文阐述。
按照本发明杀虫蛋白质可以是加溶(solubilized)晶状蛋白质包含体形式的。这种形式的蛋白质可以通过在碱性溶剂中溶解本发明的蛋白质获得。
本发明提供了编码本发明的杀虫蛋白质的核苷酸序列。这一核苷酸序列的典型序列具有SEQ ID NO1的全部或部分DNA序列。
当给出本发明的杀虫蛋白质的氨基酸序列时，也就容易确定编码这一蛋白质的核苷酸序列，可以选择编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的各种核苷酸序列。因此，编码按照本发明的杀虫蛋白质的核苷酸序列包括，作为SEQ ID NO1的DNA序列的遗传密码简并结果的DNA序列，相对应于所说DNA序列的RNA序列。
本发明的核苷酸序列可以是天然衍生物，采用部分天然序列全合成或半合成的。
编码本发明的杀虫蛋白质的基因可以从菌株SSK-10中分离，例如，按以下方法首先，从菌株SSK-10的细胞中抽提DNA，用适当的限制性酶切割，然后用噬菌体载体或质粒载体构建包含菌株SSK-10的DNA的文库。从SEQ ID NO1的核苷酸序列合成适当的引物，然后以来自SSK-10的DAN为模板进行PCR，扩增所说基因的DNA片段。以所说的DNA片段作为探针来筛选文库以分离所说基因的全长DNA。
或者，可以通过制备本发明的杀虫蛋白质的抗体，然后利用这一抗体筛选基因组文库或者cDNA文库来分离所说的基因。
此外，可以通过以来自菌株SSK-10的DNA为模板合成编码本发明的杀虫蛋白质的基因的开放读框的5’末端和3’末端引物，并利用它们进行PCR扩增来分离新基因全长DNA。
也可以用遗传工程领域的常规方法，经筛选染色体文库或cDNA文库来获得所说基因的全长DNA；例如，利用基于部分氨基酸序列构建的适当DNA探针。
突变可以引入到基因中，例如，通过利用市售的诱变试剂盒，或者利用包含突变的引物进行PGR(“PCR及其应用”，编者YoshiyukiSakakibara等，Yodosha，pp63-67，1990)。
本发明提供了一种载体，在该载体中本发明的核苷酸序列以这样的方式存在在宿主细胞中其可复制，该核苷酸序列编码的蛋白质可以表达。
此外，本发明提供了一种载体转化的宿主细胞。这一宿主-载体系统不受特别限制；例如，可以利用与另一蛋白质融合的蛋白质的表达系统。
载体的例子包括质粒载体，如Ti质粒载体。
为了经把载体引入宿主细胞来表达靶蛋白，除本发明的核苷酸序列之外，本发明的载体可以具有控制表达的序列(例如，启动子序列，终止子序列，增强子序列，转录调节区和SD序列)，选择宿主细胞的基因标记(例如，新霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因)。而且，载体可以具有重复形式(例如，一前一后形式)的本发明的核苷酸序列。所说的序列可用任何普通的方法置入载体，可以使用本领域常规的方法用这一载体转化宿主细胞。可以用遗传工程领域常用的方法和技术构建本发明的载体。
宿主细胞的例子包括微生物(例如，革兰氏-阴性菌如大肠杆菌和假单胞菌属的种，革兰氏-阳性菌如芽孢杆菌属的种，及真菌纲如真菌和酵母)。
转化的宿主细胞(例如，大肠杆菌)在合适的介质中培养，可以从这一培养产物获得本发明的杀虫蛋白质。因此，本发明的另一个实施方案提供了制备本发明的杀虫蛋白质的方法，转化的细胞可以在与源细胞实质上相同的条件下培养。而且，用常规方法回收和纯化从培养液得到的本发明的杀虫蛋白质。
因此，本发明的杀虫蛋白质稳定大量的供给不仅可以在Bt菌中进行，而且也可以在其它异种生物体(意即，微生物，植物，等等)中进行。本发明的核苷酸序列插入Bt菌(而不是插入菌株SSK-10)被认为提高杀虫活性，使得构建有效防治更广范围的昆虫的转化的Bt菌株成为可能。
此外，本领域技术人员清楚一个或多个外源Bt杀虫蛋白质基因可以导入菌株SSK-10以提高杀虫活性，以便产生可以有效防治或杀死更广范围的昆虫的转化的Bt菌菌株。
按照本发明，可以选择植物细胞或植物作为宿主。因此，本发明提供了对昆虫具有抗性的转化的植物。转化的植物的例子包括单子叶植物(例如，稻米，玉米，小麦，芦笋)和双子叶植物(例如，土豆，甜菜，胡萝卜，花椰菜，莴苣，番茄，茄子，烟草，甜瓜，黄瓜，黄豆，苹果，桔子，草莓，杨树，棉花，康乃馨，矮牵牛，苜蓿，薄荷)。
基因可以导入植物细胞或者植物，例如，通过直接基因转移(如粒子枪，PEG，电穿孔法，及显微注射)，或者利用农杆菌的Ti质粒载体进行间接基因转移。例如，用Vaeck M.等的方法(自然，328，33-37，1987)可以转化双子叶植物及其细胞，例如，用Hong Y.等的方法(Scientia Agricultura sinica，22，1-5，1989)可以转化单子叶植物及其细胞。本领域技术人员清楚，转化的植物细胞可以再分化以获得完整的植物。
本发明提供了具有对昆虫的抗性的转化的植物的种子。本发明的种子可以由转化的植物细胞再分化获得的植物、或转化的植物获得。虫害消除剂和虫害消除方法按照本发明的蛋白质具有杀虫活性。因此，本发明可以提供包含作为有效成分的本发明的杀虫蛋白质的虫害消除剂。术语“用于消除虫害的药剂(虫害消除剂)”如本文所用的包括植物保护剂，昆虫防治剂，杀虫剂，以及虫害防护剂。
为了提高本发明的虫害消除剂中蛋白质的杀虫活性，优选地使用与菌株SSK-10产生的孢子组合的所说蛋白质。
如果与孢子组合起来，加溶晶状蛋白质包含体的杀虫活性将再生(参见实施例，稍后论述)。因此，如果的晶状蛋白质包含体用作有效成分，优选地利用所说的加溶蛋白质包含体与孢子的组合。优选地使用加溶蛋白质包含体消除有少量消化酶的害虫。
本发明的新菌株产生如上所述的杀虫蛋白质。因此，本发明的另一个实施方案提供了包含本发明的新菌株的虫害消除剂。
本发明的另一个实施方案提供了包含如此转化以产生本发明的杀虫蛋白质的微生物的虫害消除剂。
本发明的虫害消除剂可以包含本发明的新菌株的细胞，转化的微生物，或者杀虫蛋白质，单独地或者它们的任意组合体。
本发明的虫害消除剂可以用于被虫害侵染的植物或有可能被侵染的植物，可以用未稀释的药剂喷射或用以水或其它合适的稀释剂稀释的药剂喷射。
本发明的虫害消除剂可以用来保护宽范围的植物，在这些植物上虫害有可能成倍增加。用本发明的方法保护的重要植物的例子包括蔬菜(如甘蓝，椰菜和其它有花的蔬菜)，玉米，棉花，土豆，稻米，柑橘类水果，以及落叶水果树。也包括非农业树木(如在街道上，公园中，人造林地和天然森林中的树木)。
可以用本发明的方法防治的虫害是以上所论及的那些。
本发明的虫害消除剂可以由例如以下方法得到浓缩(例如，通过离心或者过滤)菌株SSK-10的培养液或转化的微生物(其中导入了编码本发明的杀虫蛋白质的基因)的培养液，然后将所说的浓缩物与所需的合适的药剂(例如，表面活性剂，润湿剂，固体稀释剂，分散剂，及UV稳定剂)组合，以产生所需的制剂，如可湿性粉剂，粉剂，可流动药剂等。
如果必要和/或如果需要，当制备制剂或者在喷射时，本发明的虫害消除组合物可以与各种杀虫剂，杀菌剂或杀真菌剂，杂草防治剂，植物生长调节剂，增效剂(包括培养上清液中包含的活性增强物质)，诱导剂，植物营养物，肥料等组合。此外，组合物可以含有不同于本发明的菌株的Bt菌菌株，以及不同于本发明的蛋白质的杀虫蛋白质。
本发明提供了用本发明的杀虫蛋白质、本发明的新菌株的细胞和/或被转化以产生本发明的杀虫蛋白质的微生物经处理植物(这些植物已被或可能被害虫侵染)来消除虫害的方法。
本文所使用的术语“用于消除虫害的方法”包括保护植物使之免受虫害侵害的方法，防治虫害的方法，杀虫方法，抗虫害的方法等。
按照本发明，在消除虫害中，本发明的杀虫蛋白质，本发明的新菌株的细胞，和/或被转化以产生本发明的杀虫蛋白质的微生物，可以不经进一步的配制即可喷射，或者在稀释或不稀释的情况下喷射。防治的虫害和保护的植物与以上有关虫害消除剂中的描述是相同的。
实施例本发明进一步通过下列实施例加以说明，但它们不用来限制本发明。实施例1Bt菌的SSK-10菌株的选择从日本各处收集土壤和尘埃样品，并根据Ohba等描述的方法(无脊椎动物病理学杂志，47，12，1986)分离Bt菌。将分离的Bt菌培养在常规的琼脂营养培养基(1.0％肉膏，1.0％蛋白胨，0.5％NaCl，2.0％琼脂，pH值7.2)上，然后到下所形成的孢子和CIs的混合物并悬浮在无菌水中，以制备特定浓度的孢子与CIs的悬液。用该悬浮处理一些甘蓝叶的小片(直径为5cm)，并喂给各种昆虫以估价Bt菌的杀虫活性。
结果，选择到对斜纹夜蛾具有最高杀虫活性的菌株SSK-10。实施例2CIs的纯化将本发明的SSK-10菌株的细胞悬浮在无菌水中，均匀地平板接种在常规琼脂营养培养基上，并在28℃下培养5天。当确认已形成孢子及产生CI后，添加无菌蒸馏水至平板培养基中，通过离心回收混合的孢子和CIs的离心沉淀，然后以无菌蒸馏水洗涤3次。接着，将所形成的离心沉淀悬浮在少量的无菌蒸馏水中，根据R.Milne的方法(无脊椎动物病理学杂志，29，230，1977)通过urografin密度梯度法(40％至70％)分离CIs，并且用水洗涤3次。再一次用urografin密度梯度法(60％至70％)纯化所分离的CIs，然后用水洗涤纯化的CIs 5次。用相差显微镜鉴定分离的CIs，其至少为99％，然后冻干。结果，从1g(湿重)孢子-CIs混合物离心沉淀中获得35mg(干重)的CIs。利用菌株HD-1以相同的方式制备CIs以作为对照。实施例3菌株SSK-10细胞的液体培养物将一铂环的SSK-10菌株的培养物(其培养在琼脂培养基上)接种在常规的液态营养培养基(0.3％肉膏，0.5％葡萄糖，0.4％蛋白胨，0.1％NaCl，pH值7.2，5ml/试管)上。将试管放置在往复运动的振荡器中并在28℃下培养10至24小时。将这样获得的培养液的0.5ml部分接种在位于500ml锥形瓶中的100ml常规液态营养培养基上。将该锥形瓶放置在旋转摇床(250rpm)上并在28℃培养2天，接着离心该培养液20分钟(15,000rpm)以获得离心沉淀的固体残渣。用适量的水洗涤离心沉淀3次，再一次以15,000rpm离心20分钟，然后冻干以获得每锥形瓶约400mg的冻干产物。称重这样获得的干燥产品，用蒸馏水稀释，然后进行抗各种昆虫的杀虫活性的试验。利用菌株HD-1以相同的方式制备干燥产物作为对照。试验实施例1CI抗斜纹夜蛾的杀虫活性将通过实施例2的方法所制备的CIs稀释至特定的浓度，并添加润湿剂。用该试验的液体喷射甘蓝叶片，并置于塑料杯子中在空气中干燥，然后释放斜纹夜蛾的第三龄幼虫(每个杯子5只幼虫)。然后盖上杯子放置在温箱中(25℃)。3天后观察存活或死亡的情况，用概率值法计算中值致死浓度(LC50)。结果见表2。表2CIs抗斜纹夜蛾的杀虫活性
该试验显示菌株SSK-10的CIs抗小菜蛾的杀虫活性比菌株HD-1的杀虫活性高5倍。试验实施例3菌株SSK-10对具有Bt-剂抗性能力的小菜蛾的作用在Hyogo县Iwaoka区捕获小菜蛾昆虫(Iwaoka系)，这种昆虫对现有的由菌株HD-1的细胞作为主要组分组成的Bt剂具有抗性。将菌株SSK-10对这些抗性系的昆虫的功效与对敏感系昆虫的功效进行比较。将通过实施例3的方法所制备的干产物用补充了润湿剂的溶液稀释至特定的浓度。用该试验的液体喷射甘蓝叶片，并置于塑料杯子中在空气中干燥，然后释放小菜蛾Iwaoka系的第二龄幼虫(每个杯子5只幼虫)。然后盖上杯子放置在温箱中(25℃)。3天后观察存活或死亡情况。利用Toaro-CT可湿性粉剂(Towagosei Chem.KK)作为对照化学药品。用概率值法计算中值致死浓度(LC50)，抗性比通过Iwaoka系昆虫的致死浓度值除敏感系昆虫的致死浓度值进行计算。
致死浓度＝(Bt-剂抗性昆虫的LC50)/(Bt-剂敏感系昆虫的LC50)结果见表4。表4抗Bt-剂抗性小菜蛾的杀虫活性
Towagosei Chem.KK试验实施例4菌株SSK-10产生的CIs的溶解性和稳定性将用实施例2的方法制备的菌株SSK-10的CIs和HD-1悬浮在50mM Na2CO3-NaNCO3溶液(pH 9.5)中，并保持在37℃。30分钟后，收取样品并离心。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析离心前的悬液及离心后的上清液。溶解度通过130kd蛋白质在上清液中的量除以离心前的悬液中的130kd蛋白质的量进行计算。结果见表5。表5CIs的溶解度
此外，在规定的时间从保持在37℃下的悬液中收取样品，并用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析130kd蛋白质的量。悬浮时(0小时)蛋白质量为100，时间稳定性以剩下蛋白质的百分比形式进行表达。结果见表6。表6CIs的稳定性
试验实施例5CIs和SCIs抗斜纹夜蛾的杀虫活性(1)CI溶液的制备添加补充了润湿剂的溶液至用实施例2的方法所制备的菌株SSK-10的CIs中，并将混合物稀释至特定的浓度。
(2)SCI溶液的制备将用实施例2的方法制备的菌株SSK-10的CIs悬浮在50mMNa2CO3-NaNCO3溶液(pH 9.5)中，并将该悬液保持在37℃1小时。溶解后，离心得到上清液，添加补充了润湿剂的溶液至该悬液中，并将混合物稀释至特定的浓度。
(3)杀虫活性的测量及结果用上述(1)和(2)制备的CI溶液和SCI溶液喷射甘蓝叶片，并置于塑料杯子中在空气中干燥，然后释放斜纹夜蛾的第三龄幼虫(每个杯子5只幼虫)。然后盖上杯子放置在温箱中(25℃)。3天后观察存活或死亡情况。
结果见表7。表7CIs和SCIs抗斜纹夜蛾的杀虫活性
试验实施例6孢子对抗斜纹夜蛾的杀虫活性的作用将用实施例3的方法制备的菌株SSK-10的细胞的干产物(其含有CIs和孢子)悬浮在50mM Na2CO3-NaNCO3溶液(pH 9.5)中，并将该悬液保持在37℃下1小时。在用显微镜下确认CIs完全溶解后，通过离心获得上清液(该组分含有SCIs)及沉淀(该组分含有孢子)。单独地，将用实施例2的方法获得的CIs制备成与菌株SSK-10的干产物的浓度相同的浓度，并进行试验。用补充了润湿剂的溶液稀释每个样品至特定的浓度，用该样品溶液喷射甘蓝叶片，并置于塑料杯子中在空气中干燥，然后释放斜纹夜蛾的第三龄幼虫(每个杯子5只幼虫)。然后盖上杯子放置在温箱中(25℃)。3天后观察存活或死亡情况。
结果见表8。表8孢子对抗斜纹夜蛾的杀虫活性的协同作用
试验实施例7抗尖音库蚊的杀虫活性用去离子水稀释通过实施例3的方法制备的菌株SSK-10细胞的干产物至特定浓度，并放置在陪替氏培养皿中。将孵育了4天的20只尖音库蚊幼虫释放在平皿中，将平皿放置在温箱中25℃。
24小时后观察存活或死亡情况，用概率值法计算中位值致死浓度(LC50)为37.2ppm。这样，该试验表明菌株SSK-10细胞的干产物也具有抗分类为双翅目的昆虫的杀虫活性。实施例4菌株SSK-10产生的新杀虫蛋白质的基因的克隆(1)菌株SSK-10的基因组文库的构建28℃下在Luria-Bertani(LB)培养基中过夜培养菌株SSK-10(FERM BP-6162)的细胞。通过离心收集细胞，利用ISOPLANT(Nippon基因)按照所附手册分离DNA。利用Sau3部分消化分离的DNA，并用碱性磷酸酶进行处理，则所产生的DNA片段的5′端被去磷酸化。将该DNA片段插入到噬菌体载体中，λDASH II(Stratagene)。按照所附的手册利用Gigapack III Gold包装物(Stratagene)对这样获得的重组噬菌体载体进行体外包装。接着，用所说的重组噬菌体感染大肠杆菌XL1-Blue MRA(P2)菌株的细胞，然后在平板上进行培养以获得噬菌斑。
(2)探针的构建也假定菌株SSK-10的杀虫蛋白质基因具有在已知Bt杀虫蛋白质基因中的完全保守区。因此，分析已知Bt的杀虫蛋白质基因中的碱基序列，并合成与2个完全保守区(SEQ ID NO3和4)对应的引物。利用这些引物和从SSK-10分离的DNA作为模板经PCR扩增了约1kb的DNA片段。这证明利用这些引物可扩增菌株SSK-10的杀虫蛋白质基因。在下述(3)描述的筛选中，将荧光素-标记的DNA片段(其通过反应溶液中混合了荧光素-11-dUTP(Amersham)的PCR进行扩增)作为探针。
(3)新杀虫蛋白质基因的筛选将Hybond-N＋膜(Amersham)放置在平板上，上述(1)的噬斑在该膜上形成，并且噬斑粘附在该膜上。用碱处理膜，使膜上的重组噬菌体DNA变性成单链，变性的DNA吸附在膜上。将具有吸附的噬菌体DNA的膜放置在聚乙烯袋子中，添加利用杂交缓冲液片剂制备的缓冲液(Amersham)，然后密封袋子，并在65℃温育1小时。在添加荧光素-标记的探针(其通过加热已变性)后，65℃下杂交过夜。然后，洗涤膜，并用碱性磷酸酶标记的抗荧光素抗体标记荧光素标记的噬斑。利用氮蓝四唑氯化物和X-磷酸处理这些以碱性磷酸酶标记的噬斑以显色，其中这些与探针牢固杂交的噬斑是可视的，从这些中选择阳性克隆。利用限制酶从阳性克隆上切割下包含与探针同源的5′上游和3′下游区的DNA片段并亚克隆到pBluescript II(Stratagene)中。
(4)碱基序列的测序由上述(3)构建的重组pBluescript II，利用Kilo-序列(Takara)的缺失试剂盒按照所附手册制备缺失克隆，这些缺失克隆每个均缺失一段已掺入的DNA片段的约300bp的序列。用染色终止循环测序制备反应仪(Perkin Elmer)按照所附手册对这些缺失克隆的序列进行测序，接着用373A DNA测序仪(Perkin Elmer)进行分析。这样测定的3867bp的DNA片段的碱基序列(其含有菌株SSK-1的新杀虫蛋白质基因)见SEQID NO1。该碱基序列有3453bp的ORF，其编码129.9kd，pI4.79，并具有1150个氨基酸的蛋白质。该蛋白质的氨基酸序列见SEQ ID NO2。
(5)同源性检索利用数据库(GenBank，EMBL，DDBJ。PDB序列)的同源性检索的结果表明从菌株SSK-10获得的新杀虫蛋白质基因的碱基序列与已知的Bt杀虫蛋白质的基因几乎无同源性，并且在氨基酸水平上，与即使是最同源的Cry9Cal也仅仅为71％的同源性(B.Lambert等，环境微生物应用，62，80，1996)。Bt杀虫蛋白质先以130kd至140kd的毒素前体产生，然后其在昆虫的中肠内被消化成60kd至70kd的毒素。实际上已知，该毒素有杀虫活性，并且毒素前体的C端位点不为活性所需(H.Hofte和H.R.Whiteley，微生物回顾，53，242，1989)。因此，对一段有限的氨基酸序列上进行同源性检索(GenBank CDS翻译物，PDB，SwissProt，PIR)，即在杀虫性所需的从N端位点的第1个至第700个氨基酸的序列上进行同源性检索。即使是与最同源的Cry9Cal也只发现60％的同源性，这清楚地表明该基因是一个新基因。实施例5新杀虫蛋白质基因的转录(1)从菌株SSK-10中分离RNA将一环SSK-10菌株的细胞接种在20ml的LB培养基上，并在28℃下培养。在开始培养后，在13.0，16.5，20.0，23.5小时分别取样0.5ml的培养物。开始培养后，16.5小时时用相差显微镜观察CIs。立即离心取样的培养液以收集细胞，利用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)按照所附手册分离RNA。用脱氧核糖核酸酶处理这样分离的RNA以分解任何DNA污染物，然后用于如下述通过反转录酶(RT)-PCR进行的分析。
(2)通过RT-PCR的转录分析利用SEQ ID NO5(与SEQ ID NO1的461至480位氨基酸相对应)和SEQ ID NO6(与SEQ ID NO1的1021至1040位氨基酸相对应)作为PCR引物。通过RT-PCR利用RNA PCR试剂盒(AMV)Ver.2.1(Takara)分析转录。按照所附手册利用随机九-核苷酸作为逆转录反应的引物并利用上述的引物作为PCR的引物进行该反应。以相同的方式但无转录酶处理样品以确认RNA样品没有被DNA污染。在反应之后，在2％琼脂糖凝胶上进行电泳，之后在溴化乙锭溶液中培养凝胶，然后在紫外线灯下拍下所形成凝胶的照片。结果见图1。该分析结果表明菌株SSK-10的新杀虫蛋白质基因明显与CI产生协同转录。实施例6新杀虫蛋白质在大肠杆菌中的表达及该蛋白质的杀虫活性(1)蛋白质表达载体的构建用CAT取代新基因中紧挨着翻译起始密码子(ATG，SEQ ID NO1的211)上游的三个碱基(AGT)以将该位点改变成NdeI的识别序列(CATATG)。将从NdeI位点至位于新基因终止密码子的7个碱基下游的BamHI位点(GGATCC，SEQ ID NO1的3670)的片段插入到pET-lla(一种蛋白质表达(Stratagene)的载体)的NdeI位点和BamHI位点之间。这样构建了在大肠杆菌中产生新杀虫蛋白质的载体。
(2)新杀虫蛋白质在大肠杆菌中的表达及该蛋白质的纯化将上述(1)构建的载体引入至大肠杆菌菌株BL21(DE3)内以表达蛋白质。按照所附手册以异丙基-β-D-巯基-吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达从而使新杀虫蛋白质得以表达。通过SDS-聚丙烯酰胺蛋白凝胶电泳确认在IPTG存在下培养的大肠杆菌菌体已产生约130kd的新杀虫蛋白质。该蛋白质在大肠杆菌中以包含体的形式产生。利用溶菌酶和脱氧核糖核酸酶I处理大肠杆菌菌体，然后离心，纯化为沉淀的包含体。
(3)新杀虫蛋白质的杀虫活性a)新杀虫蛋白质对斜纹夜蛾的杀虫活性将上述(2)中纯化的新杀虫蛋白质作为试验样品，添加试验实施例6中制备的孢子直至最后的孢子浓度为100mg/L。用补充了润湿剂的溶液稀释每个样品至特定的浓度，用该样品溶液喷射甘蓝叶片，并置于塑料杯子中在空气中干燥，然后释放斜纹夜蛾的第三龄幼虫(每个杯子5只幼虫)。然后盖上杯子放置在温箱中(25℃)。3天后观察存活或死亡情况。结果见表9。表9新杀虫蛋白质对斜纹夜蛾的杀虫活性
已知由于夜蛾的消化液的强蛋白酶活性，加溶的CIs对Spodoptera sp.的杀虫活性通常比其在溶解前的活性更低。同样，已知Bt杀虫蛋白质(其由大肠杆菌产生，并且不具有晶状结构)与来源于Bt菌所产生的相同基因的CIs相比具有更低的抗夜蛾的杀虫活性(M.Keller等，昆虫生物，分子生物学，26，365，1996)。用菌株SSK-10的CIs也观察到了该现象，如表7所示，但是因溶解度而减少的活性通过添加孢子得到恢复。大肠杆菌菌体产生的新杀虫蛋白质单独无杀虫活性，如表9所示；然而，通过添加菌株SSK-10的孢子恢复了杀虫活性。这样，得出结论新杀虫蛋白质再现菌株SSK-10的CIs的活性。
b)新杀虫蛋白质对Bt-剂抗性的小菜蛾的作用将新杀虫蛋白质抗Osaka区捕获的小菜蛾(抗性系)的作用与抗敏感系的作用进行比较。将通过实施例3的方法所制备的干产物用作为菌株SSK-10的试验样品。每个样品用补充了润湿剂的溶液稀释至特定的浓度。用该试验的液体喷射甘蓝叶片，并置于塑料杯子中在空气中干燥，然后释放小菜蛾的抗性系或敏感系的第三龄幼虫(每个杯子5只幼虫)。然后盖上杯子放置在温箱中(25℃)，3天后观察存活或死亡情况。利用Toaro-CT可湿性粉剂(Towagosei Chem.K)作为对照化学药品。用概率值法计算中值致死浓度(LC50)，抗性比通过抗性系昆虫的致死浓度值除敏感系昆虫的致死浓度值进行计算。
结果见表10。表10新杀虫蛋白质对Bt-剂抗性的小菜蛾的杀虫活性
>*Towagosei Chem.KK这表明，新杀虫蛋白质具有对Bt-剂抗性小菜蛾更高的杀虫活性。
如下给出了本发明各种制剂的组合物的例子制剂实施例1可湿性粉剂本发明的含有CI和孢子的物质50％Sorpol 807010％(阴离子型表面活性剂，商品名，Toho化学 10％工业有限公司)Newkalgen WG-2(阴离子型表面活性剂，商品名，Takemoto 5％Oil及Fat有限公司)Cellogen(羰甲基纤维素，商品名，Daiichi-Kogyo Seiyaku 3％有限公司中性无水硫酸钠16％钠沸石#20016％将上述组分粉碎，并均匀地混合成可湿性粉剂。
应用时，将该可湿性粉剂稀释500至4000倍，然后喷射。制剂实施例2粉剂本发明的含有CI和孢子的物质3％Carplex#80(碳黑，商品名，Shionogi有限公司)1％二异丙基磷酸 2％滑石 94％将上述组分粉碎，并均匀地混合成粉剂。制剂实施例3可流动的药剂本发明的含有CI和孢子的物质 30％聚乙二醇 5％黄原胶 0.2％Newkalgen FS-1(阴离子型表面活性剂，商品名，Takemoto 3％Oil及Fat有限公司)Newkalgen FS-4(阴离子型表面活性剂，商品名，Takemoto 5％Oil及Fat有限公司)聚硅氧烷 0.1％水 6.7％除了本发明的含有CI和孢子的物质外，将上述组分均匀地溶解，添加本发明的含有CI和孢子的物质，然后充分振荡所形成的混合物，并在潮湿条件下粉碎以得到可流动的制剂。应用时，稀释可流动的药剂25至2000倍，并喷射。
序列表SEQ ID NO1序列长度3867序列类型核酸链型双链拓扑结构线型分子类型基因组DNA假设否反义否原始来源有机体苏云金芽孢杆菌菌株名称SSK-10特征名称/关键词CDS位置211..3663特征P名称/关键词mat肽位置211..3660特征P序列描述GAACCGAAGG TTTGTAAAAA AGAAATTGGA ATAAATACCA TCCATTTTTT CAAGAAAGAT 60TTTTTTATTA GAAAGGAATC TTTCTTACAC AGGAGAATAC TAAGATTGAG AGTAGAGATA 120TATAGATGTC AATACAATAA AGAGTCTGTC AGGTTTTTTG AAAGATATGA TTTGAACATG 180TAATAGATTT ATAGTATAGG AGGAAAAAGT ATG AAT CGA AAT AAT CCA AAT GAA 234Met Asn Arg Asn Asn Pro Asn Glu1 5TAT GAA ATT ATT GAT GCC CCC TAT TGT GGG TGT CCG TCA GAT GAT GAT282Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro Tyr Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp10 15 20GTG AGG TAT CCT TTG GCA AGT GAC CCA AAT GCA GCG TTC CAA AAT ATG330Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp Pro Asn Ala Ala Phe Gln Asn Met25 30 35 40AAC TAT AAA GAG TAT TTA CAA ACG TAT GAT GGA GAC TAC ACA GGT TCT378Asn Tyr Lys Glu Tyr Leu Gln Thr Tyr Asp Gly Asp Tyr Thr Gly Ser45 50 55CTT ATC AAT CCT AAC TTA TCT ATT AAT CCT AGA GAT GTA CTA CAA ACA426Leu Ile Asn Pro Asn Leu Ser Ile Asn Pro Arg Asp Val Leu Gln Thr60 65 70GGT ATT AAT ATT GTG GGA AGA ATA CTA GGG TTT TTA GGT GTT CCA TTT 474Gly Ile Asn Ile Val Gly Arg Ile Leu Gly Phe Leu Gly Val Pro Phe75 80 85GCG GGT CAA CTA GTT ACT TTC TAT ACC TTT CTC TTA AAT CAG TTG TGG 522Ala Gly Gln Leu Val Thr Phe Tyr Thr Phe Leu Leu Asn Gln Leu Trp90 95 100CCA ACT AAT GAT AAT GCA GTA TGG GAA GCT TTT ATG GCG CAA ATA GAA 570Pro Thr Asn Asp Asn Ala Val Trp Glu Ala Phe Met Ala Gln Ile Glu105 110 115 120GAG CTA ATC GAT CAA AAA ATA TCG GCG CAA GTA GTA AGG AAT GCA CTC 618Glu Leu Ile Asp Gln Lys Ile Ser Ala Gln Val Val Arg Asn Ala Leu125130 135GAT GAC TTA ACT GGA TTA CAC GAT TAT TAT GAG GAG TAT TTA GCA GCA 666Asp Asp Leu Thr Gly Leu His Asp Tyr Tyr Glu Glu Tyr Leu Ala Ala140 145 150TTA GAG GAG TGG CTG GAA AGA CCG AAC GGA GCA AGA GCT AAC TTA GTT714Leu Glu Glu Trp Leu Glu Arg Pro Asn Gly Ala Arg Ala Asn Leu Val155 160 165ACA CAG AGG TTT GAA AAC CTG CAT ACT GCA TTT GTA ACT AGA ATG CCA762Thr Gln Arg Phe Glu Asn Leu His Thr Ala Phe Val Thr Arg Met Pro170 175 180AGC TTT GGT ACG GGT CCT GGT AGT CAA AGA GAT GCG GTA GCG TTG TTG810Ser Phe Gly Thr Gly Pro Gly Ser Gln Arg Asp Ala Val Ala Leu Leu185 190 195 200ACG GTA TAT GCA CAA GCA GCG AAT TTG CAT TTG TTA TTA TTA AAA GAT858Thr Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Leu Leu Leu Lys Asp205 210 215GCA GAA ATC TAT GGG GCA AGA TGG GGA CTT CAA CAA GGG CAA ATT AAC906Ala Glu Ile Tyr Gly Ala Arg Trp Gly Leu Gln Gln Gly Gln Ile Asn220 225 230TTA TAT TTT AAT GCT CAA CAA GAA CGT ACT CGA ATT TAT ACC AAT CAT954Leu Tyr Phe Asn Ala Gln Gln Glu Arg Thr Arg Ile Tyr Thr Asn His235 240 245TGC GTG GAA ACA TAT AAT AGA GGA TTA GAA GAT GTA AGA GGA ACA AAT 1002Cys Val Glu Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Glu Asp Val Arg Gly Thr Asn
250 255 260ACA GAA AGT TGG TTA AAT TAC CAT CGA TTC CGT AGA GAG ATG ACA TTA 1050Thr Glu Ser Trp Leu Asn Tyr His Arg Phe Arg Arg Glu Met Thr Leu265 270 275 280ATG GCA ATG GAT TTA GTG GCC CTA TTC CCA TTC TAT AAT GTG CGA CAA 1098Met Ala Met Asp Leu Val Ala Leu Phe Pro Phe Tyr Asn Val Arg Gln285 290 295TAT CCA AAT GGG GCA AAT CCA CAG CTT ACA CGT GAA ATA TAT ACA GAT 1146Tyr Pro Asn Gly Ala Asn Pro Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asp300 305 310CCA ATC GTA TAT AAT CCA CCA GCT AAT CAG GGA ATT TGC CGA CGT TGG 1194Pro Ile Val Tyr Asn Pro Pro Ala Asn Gln Gly Ile Cys Arg Arg Trp315 320 325GGG AAT AAT CCG TAT AAT ACA TTT TCT GAA CTT GAA AAT GCT TTT ATT 1242Gly Asn Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu Glu Asn Ala Phe Ile330 335 340CGC CCG CCA CAT CTT TTT GAA AGG TTG AAC AGA TTA ACT ATT TCT AGA 1290Arg Pro Pro His Leu Phe Glu Arg Leu Asn Arg Leu Thr Ile Ser Arg345 350 355 360AAC CGA TAT ACA GCT CCA ACA ACT AAT AGC TTC CTA GAC TAT TGG TCA 1338Asn Arg Tyr Thr Ala Pro Thr Thr Asn Ser Phe Leu Asp Tyr Trp 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Gly1065 107010751080TAT GTT ACG ATC CAA GAT GGC GCT CAT CAC CGA GAA ACA CTG ACA TTC3498Tyr Val Thr Ile Gln Asp Gly Ala His His Arg Glu Thr Leu Thr Phe108510901095AAT GCA TGT GAC TAC GAT GTA AAT GGT ACG CAT GTA AAT GAT AAT TCG3546Asn Ala Cys Asp Tyr Asp Val Asn Gly Thr His Val Asn Asp Asn Ser110011051110TAT ATT ACA AAA GAA TTG GTG TTC TAT CCA AAG ACG GAA CAT ATG TGG3594Tyr Ile Thr Lys Glu Leu Val Phe Tyr Pro Lys Thr Glu His Met Trp111511201125GTA GAG GTA AGT GAA ACA GAA GGT ACC TTC TAT ATA GAC AGC ATT GAG3642Val Glu Val Ser Glu Thr Glu Gly Thr Phe Tyr Ile Asp Ser Ile Glu1130 11351140TTC ATT GAA ACA CAA GAG TAGAAGAGGG GATCCTAACG TATAGCAACT 3690Phe Ile Glu Thr Gln Glu1145 1150ATGAGGGGAC ACTCTGTATA AATAAAGATT AAAAAGAATA GAAAATGAAT AGAACCCCCT 3750ACTGGTCTTT TTACCAGTAG GGGGTTTTTC ACATAAAAAA ATGGATTTGT TTACTAAGGT 3810GTATAAAAAA CGGAATACCT GATAGAAAAA AGGGAGTACC TTATAAAGAA AGAATTC 3867SEQ ID NO2序列长度1150序列类型氨基酸拓扑结构线型分子类型蛋白质原始来源有机体苏云金芽孢杆菌菌株名称SSK-10序列描述Met Asn Arg Asn Asn Pro Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro Tyr1 5 10 15Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp20 25 30Pro Asn Ala Ala Phe Gln Asn Met Asn Tyr Lys Glu Tyr Leu Gln Thr35 40 45Tyr Asp Gly Asp Tyr Thr Gly Ser Leu Ile Asn Pro Asn Leu Ser Ile50 55 60Asn Pro Arg Asp Val Leu Gln Thr Gly Ile Asn Ile Val Gly Arg Ile65 70 75 80Leu Gly Phe Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly Gln Leu Val Thr Phe Tyr85 90 95Thr Phe Leu Leu Asn Gln Leu Trp Pro Thr Asn Asp Asn Ala Val Trp100 105 110Glu Ala Phe Met Ala Gln Ile Glu Glu Leu Ile Asp Gln Lys Ile Ser115 120 125Ala Gln Val Val Arg Asn Ala Leu Asp Asp Leu Thr Gly Leu His Asp130 135 140Tyr Tyr Glu Glu Tyr Leu Ala Ala Leu Glu Glu Trp Leu Glu Arg Pro145 150 155 160Asn Gly Ala Arg Ala Asn Leu Val Thr Gln Arg Phe Glu Asn Leu His165 170 175Thr Ala Phe Val Thr Arg Met Pro Ser Phe Gly Thr Gly Pro Gly Ser180 185 190Gln Arg Asp Ala Val Ala Leu Leu Thr Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn195 200 205Leu His Leu Leu Leu Leu Lys Asp Ala Glu Ile Tyr Gly Ala Arg Trp210 215 220Gly Leu Gln Gln 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权利要求
1.一种菌株SSK-10，其以保藏号FERM-6162保藏。
2.一种蛋白质，其包含下列氨基酸序列(a)或者(b)(a)SEQ ID NO2的氨基酸序列，或者(b)SEQ ID NO2的氨基酸序列，其具有杀虫活性，其中在SEQ ID NO2中的一个或多个氨基酸被取代或被缺失，或者一个或多个氨基酸被添加或被插入到SEQ ID NO2的氨基酸序列中。
3.一种核苷酸序列，其编码按照权利要求2的蛋白质。
4.按照权利要求3的核苷酸序列，其具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
5.一种载体，其包含按照权利要求3的核苷酸序列。
6.一种宿主细胞，其包含按照权利要求3的核苷酸序列或按照权利要求5的载体。
7.按照权利要求6的宿主细胞，其是微生物。
8.按照权利要求6的宿主细胞，其是大肠杆菌。
9.按照权利要求2的蛋白质，其是晶状蛋白质包含体形式的。
10.按照权利要求2的蛋白质，其是加溶晶状蛋白质包含体形式的。
11.按照权利要求2的蛋白质，其是由按照权利要求1的菌株或者按照权利要求6的宿主细胞产生的。
12.一种用于消除虫害的药剂，其包含作为有效成分的按照权利要求1的菌株、按照权利要求6的宿主细胞和/或按照权利要求2的蛋白质。
13.一种用于消除虫害的药剂，其包含作为有效成分的按照权利要求2的蛋白质和按照权利要求1的菌株的孢子。
14.一种用于消除虫害的药剂，其包含作为有效成分的按照权利要求9的晶状蛋白质包含体和按照权利要求1的菌株的孢子。
15.一种用于消除虫害的药剂，其包含作为有效成分的按照权利要求10的加溶晶状蛋白质包含体和按照权利要求1的菌株的孢子。
16.一种用于消除虫害的方法，该方法包括用按照权利要求1的菌株、按照权利要求7的微生物和/或按照权利要求2的蛋白质处理已经受到或者可能受到所说的虫害损害的植物。
17.按照权利要求16的方法，其中所说的虫害属于鳞翅目，鞘翅目或者双翅目。
18.按照权利要求16的方法，其中所说的昆虫是选自由斜纹夜蛾(Spodoptera litura)，小菜蛾(Plutella xylostella)和尖音库蚊(Culex Pipiens)组成的组的昆虫。
19.一种植物细胞，其包含按照权利要求3的核苷酸序列或按照权利要求5的载体。
20.按照权利要求19的植物细胞，其再生为能够产生种子的植物。
21.一种种子，其包含按照权利要求3的核苷酸序列或按照权利要求5的载体。
22.按照权利要求21的种子，其可以被培育成能够产生种子的植物。
23.一种植物，其包含按照权利要求3的核苷酸序列或按照权利要求5的载体。
24.按照权利要求23的植物，其能够产生种子。
25.一种植物，其可以通过使权利要求21的种子发芽获得。
全文摘要
本发明的目的是提供不仅具有针对鳞翅目昆虫，而且具有针对其它昆虫的杀虫活性的Bt菌，由所说的Bt菌产生的杀虫蛋白质，编码所说的蛋白质的基因，产生所说的杀虫蛋白质的宿主，以及虫害消除剂。根据本发明的新菌株是菌株SSK－10，其被分类为苏云金芽孢杆菌，以保藏号FERM BP－6162保藏。根据本发明的蛋白质包含(a)在SEQ ID NO1中所描述的氨基酸序列，或者(b)SEQ ID NO2中所描述的氨基酸序列，其具有杀虫活性，其中一个或多个氨基酸被取代、缺失、添加或插入。
文档编号C12N15/32GK1240002SQ97180416
公开日1999年12月29日 申请日期1997年12月10日 优先权日1996年12月10日
发明者尾山和彦, 今村圭一, 御堂直树, 谷野茂树, 加藤明子, 岩田道显 申请人:明治制果株式会社