一株甲基营养型芽孢杆菌zy3a及其在促进油麦菜生长上的应用
【专利摘要】本发明公开了一株甲基营养型芽孢杆菌ZY3A及其应用，该菌株的分类命名为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）ZY3A，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO:M2015547。本发明的甲基营养型芽孢杆菌ZY3A可以在LB培养基上良好的生长。经过测量油麦菜株高可知甲基营养型芽孢杆菌ZY3A稀释溶液能促进油麦菜生长。实验室拮抗实验表明，ZY3A具有明显的拮抗效果，可见，甲基营养型芽孢杆菌ZY3A可以开发为微生物肥料，在促进油麦菜生长的以及抗病虫害中具有广泛的应用。CCTCC NO:M201554720150916
【专利说明】
一株甲基营养型芽孢杆菌ZY3A及其在促进油麦菜生长上的应用
技术领域
[0001]本发明属于微生物肥料技术领域，具体涉及一株甲基营养型芽孢杆菌ZY3A及其在促进油麦菜生长上的应用。【背景技术】
[0002]芽孢杆菌是一种革兰氏阳性，产芽孢的细菌。芽孢杆菌属于细菌界(fecteria)、厚壁菌门、芽抱杆菌和乳杆菌组(a/3c/ Zacto/?aci_/_/i)、芽抱杆菌纲、芽抱杆菌目、芽抱杆菌科(ifeci_/_/aceae)、芽抱杆菌属以及其他21个近似属，其中仅芽孢杆菌属就包含200多种菌。而目前广泛研究的芽孢杆菌指的即是芽孢杆菌属的各种菌种。芽孢杆菌产生的芽孢抗逆性极强，芽孢杆菌本身营养需求简单，对植物发育安全，更可以产生多种活性代谢物质，对土壤中多种病原细菌，病原真菌等具有拮抗作用，所以芽孢杆菌是开发微生物肥料和微生物农药的重要菌种来源。[〇〇〇3]甲基营养型芽孢杆菌(ifeciDus ffietAj^/otrOjoAicus)是一类广泛存在于土壤当中的好氧性细菌。它最先发现于水稻根系的土壤中。近期的研究表明，甲基营养型芽孢杆菌是解淀粉芽抱杆菌植物亚种a?7_/o_/i<7t/e/acie/3s st/fej0.j〇_/a/3tar腫)的同义词。 根据目前的研究，许多甲基营养性细菌不仅可以促进土壤矿物及有机物的分解，为植物提供营养；同时还可以分泌IAA，Butanid1l等植物激素以及小分子气调物质;此外，甲基营养性细菌还可以诱导植物提高自身抗病害能力(ISR)，并可以通过合成脂肽类，细菌素，抗菌蛋白等抑菌物质，以及形成生物菌膜(B1film)等物理屏障，而直接帮助植物抵御病原微生物。总的来讲，甲基营养型芽孢杆菌(解淀粉芽孢杆菌植物亚种)是目前国内外公认的无毒安全的植物促生土壤细菌，也是目前我国使用量最为广泛的微生物肥料菌种来源之一。甲基营养型芽孢杆菌不仅能够促进植物生长，还可以帮助植物抵御病害，因此，分离筛选具有高效植物促生抗病活性的甲基营养型芽孢杆菌菌株，进而开发为微生物肥料，对于减少我国化学肥料，化学农药的使用量，提升我国土壤质量，促进我国农林业的可持续发展来讲， 具有十分重要的意义。[〇〇〇4] 油麦菜(Lactuca sativa var longifoliaf.Lam)也称莜麦菜、生菜或者苦菜，是一年生或二年草本植物，属于菊科莴苣属的植物。油麦菜嫩芽和嫩梢均可食用而且味道鲜美，是常见的食叶蔬菜。油麦菜植株高25-100厘米。油麦菜的茎是单生直立，在茎的上部是圆锥状花序的分枝，茎枝为白色。油麦菜的基生叶片和下部茎叶片比较大，叶片不分裂呈倒披针形、椭圆形或椭圆状倒披针形;油麦菜叶片长6-15厘米，宽1.5-6.5厘米，叶片顶端为急尖、短渐尖或圆形，没有叶柄；油麦菜叶片的边缘呈波状或者有细锯齿并且向上的渐渐变小，油麦菜的圆锥花序分枝下部的叶片和圆锥花序分枝上的叶片非常小，叶片呈卵状心形并且没有叶柄，叶片的基部为心形或箭头状抱茎，边缘全缘，叶片的上下两面没有毛。油麦菜的头状花序为多数或者极多数，在茎枝顶端排成圆锥花序。
[0005]油麦菜的种植历史悠久。在公元50年就有了关于油麦菜的描述，中世纪时期一些作品中有许多关于油麦菜的描写，其中包括草药方面的应用。油麦菜最早可能来源于古埃及人从一些杂草中筛选出来优良的种植品种，由于油麦菜有肥大的肉质叶片，所以古埃及人将油麦菜用作食用蔬菜，并用其种子榨油。后来油麦菜被引种到了希腊和古罗马地区，当地人将它命名为“莴苣”。从16-18世纪，油麦菜在欧洲发展出许多品种，通过18世纪中期的作品描述可以知道在当时油麦菜在花园中也有种植。后来油麦菜成为了欧洲和北美洲地区的蔬菜市场的主导者。到了 20世纪末，油麦菜成为在全世界都大规模种植和消费的蔬菜品种。
【发明内容】
[0006]发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一株甲基营养型芽孢杆菌ZY3A，具有促进油麦菜生长中的应用能力。本发明的另一目的是提供上述甲基营养型芽孢杆菌ZY3A在促进油麦菜生长中的应用。
[0007]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为:一株甲基营养型芽孢杆菌ZY3A，其分类命名为甲基营养型芽孢杆菌 tAWotro/7Aicus)ZY3A，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号:CCTCC NO: M2015547;保藏时间2015.09.16，保藏地址为中国典型培养物保藏中心(中国.武汉.武汉大学)。
[0008]所述的甲基营养型芽孢杆菌ZY3A在促进油麦菜生长中的应用。
[0009]所述的甲基营养型芽孢杆菌ZY3A在抗油麦菜病害中的应用。
[0010]所述的甲基营养型芽孢杆菌ZY3A的培养物在促进油麦菜生长中的应用。
[0011]所述的甲基营养型芽孢杆菌ZY3A的培养物在抗油麦菜病害中的应用。
[0012]该甲基营养型芽孢杆菌ZY3A，于2011年9月中旬从南京菜园土壤中筛选分离所得， 其主要生物学特征:浅白色，不透明，菌落平坦而不隆起，略显干燥，菌落边缘不整齐;细菌呈杆状，革兰氏染色结果阳性。主要生理生化特性:在牛肉膏蛋白胨培养基上生长良好;接触酶实验呈阳性;过氧化氢酶活性测试呈阳性。[〇〇13] 甲基营养型芽孢杆菌ZY3A菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID N0.1所示，采用 BLAST(http:/www.ncb1.nlm.nih.gov)将菌株 16S rRNA 基因序列与GenBank 中序列进行比对，并选择代表性的模式种构建系统发育树。结果表明，ZY3A与Bacillus sp.Pc3和 Bacillus methylotrophicus strain YJ11-1-4相近度最高，确定该菌株为甲基营养型芽抱杆菌Bacillus methylotrophicus ZY3A〇[〇〇14]有益效果:与现有技术相比，本发明的甲基营养型芽孢杆菌ZY3A可以在LB培养基上良好的生长。经过测量油麦菜株高可知甲基营养型芽孢杆菌ZY3A稀释溶液能促进油麦菜生长。实验室拮抗实验表明，ZY3A具有明显的拮抗效果，可见，甲基营养型芽孢杆菌ZY3A可以开发为微生物肥料，在促进油麦菜生长的以及抗病虫害中具有广泛的应用。【附图说明】
[0015]图1是甲基营养型芽孢杆菌ZY3A的菌落形态图；图2是甲基营养型芽孢杆菌ZY3A革兰氏染色结果图；图3是甲基营养型芽孢杆菌ZY3A促进油麦菜生长结果图；图4是甲基营养型芽孢杆菌ZY3A拮抗病原真菌实验结果图；上左:甲基营养芽孢杆菌 ZY3A对峙镰刀菌;上右:解淀粉芽孢杆菌AK03对峙镰刀菌；下左:甲基营养芽孢杆菌ZY3A 对峙拟丝核菌;下右:解淀粉芽孢杆菌AK03对峙拟丝核菌；图5是甲基营养型芽孢杆菌ZY3A拮抗细菌实验结果图。【具体实施方式】
[0016]下面的具体实施例，可以使本领域技术人员更好地理解本发明。实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0017]实施例1:甲基营养型芽孢杆菌ZY3A的活化培养用接种环取少量甲基营养型芽孢杆菌ZY3A菌种划线于LB平板(胰蛋白胨10g，酵母粉 5g，氯化钠5g，琼脂粉15g，去离子水1000mL)上，待表面菌液干后，倒置于37°C温箱培养过夜，平板上长出菌落，菌落形态图如图1所示，浅白色，不透明，菌落平坦而不隆起，略显干燥，菌落边缘不整齐;细菌呈杆状。检测其重要理化性质，具体为:革兰氏染色，阳性;接触酶，阳性;过氧化氢酶，阳性;VP实验，阳性;磷酸酶，阳性;淀粉水解，阳性;甘油，阳性;纤维素，阴性；明胶，阴性;吐温20,阴性;吐温60,阴性;果胶，阴性;葡萄糖，阳性;果糖，阳性;甘露糖，阳性;麦芽糖，阳性;乳糖，阳性；山梨糖醇，阳性;纤维二糖，阳性;鹿糖，阳性;梓檬酸酸盐，阳性。
[0018]实施例2:甲基营养型芽孢杆菌ZY3A的革兰氏染色实验试剂:结晶紫染色液，复红染色液，碘液。
[0019]方法:1)涂片，取一块干净的载玻片，平放，在载玻片中央滴一小滴生理盐水;用接种环无菌操作从琼脂斜面上挑取适量菌苔;将挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混匀并涂成薄膜。2)干燥，将涂好菌膜的载玻片平放在室温下自然干燥。3)固定，将已干燥的涂有菌膜的载玻片，涂面朝上，在酒精灯火焰上通过2?3次。4)染色，将热固定的细菌涂片平放于在载玻片架上，滴加草酸铵结晶紫，染色1分钟后用清水洗去染色液。5)加碘液覆盖涂面染约1分钟，用清水冲洗。6)加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。 7)复红染色液复染1分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。
[0020]革兰氏染色结果如图2所示，结果呈阳性。[0021 ]实施例3:甲基营养型芽孢杆菌ZY3A促进油麦菜生长以油麦菜为对象进行田间试验。试验地为上一年度发生过严重白菜根腐病的土壤。试验共设6个处理，每个处理进行5次重复，每个重复包含20棵从盆钵中移植的油麦菜幼苗。 [〇〇22]方法:用接种环取少量甲基营养型芽孢杆菌ZY3A菌种划线于LB平板(配方同上)， 过夜培养；待长出菌落之后，接种于培养基中(牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水 1 OOOmL，pH7.0-7.5)，培养8h后获得种子液;按2%体积接种种子液到发酵培养基(配方同种子培养基)中；在发酵罐中30 °C培养12h后，取培养液中备用。将甲基营养型芽孢杆菌ZY3A培养液，分别稀释50倍、稀释100倍、200倍、500倍、1000倍之后，和无菌培养基(CK)分别各取 100mL，灌根于油麦菜幼苗根部。除每天浇水之外不做其他田间管理，不喷施其他药物。四周之后，收获植株地上部分，烘干后称重。[〇〇23] 结果如图3所示，可以看出，当甲基营养型芽孢杆菌ZY3A稀释50-1000倍时，对油麦菜的生长均有明显促进作用。且在50-500倍区间，不同稀释度没有明显差别，考虑到生产成本，菌液稀释500倍是一个合适的施用浓度。
[0024]实施例4:甲基营养型芽孢杆菌ZY3A拮抗病原真菌试验将冰箱保存的病原真菌(镰刀菌和拟丝核菌)分别活化于TOA平板，然后用接种针挑取一小块含有菌丝的琼脂块，置于新的PDA平板中央，培养三天。同上述方法，培养甲基营养芽孢杆菌ZY3A至OD600值约为1.0，吸取5uL培养液，点在前述TOA培养培养基的边缘，每个平板点四处。将不具有病原真菌拮抗活性的解淀粉芽孢杆菌AK03,用同样的方法点板，作为对照。
[0025]结果如图4所示，与对照菌株AK3相比，甲基营养芽孢杆菌ZY3A对两种病原真菌的生长均有明显的抑制作用。
[0026]实施例5甲基营养型芽孢杆菌ZY3A的拮抗细菌试验，方法:1)获得巨大芽孢杆菌(CJCL2 )的单菌落，液体培养约5h至其OD600值为1.0时停止培养， 将LB固体培养基121°C20min灭菌后置于65°C水浴锅保存，在干净平板中先加入lmL菌液，再加入20mL温热的LB固体培养基，趁热轻轻摇晃使菌液均匀分布于平板中。冷却后置于4°C 冰箱保存待用。[〇〇27] 2)同上述方法，获得甲基营养细菌ZY3A的液体培养液，按1%的接种量再接种于 10mL LB液体培养基中，37°C摇床培养。在培养20 h和40 h之后分别吸取2 mL培养液置于离心管中，12000 rpm离心lOmin，然后取出上清液，用0.45um滤膜过滤除菌。将无菌滤液置于 4度冰箱保存待用。
[0028] 3)取制备好的巨大芽孢杆菌平板，用平板边缘用打孔器打一系列小孔(直径约 0.5mm)，取40uL待测菌株上清液于小孔中，待液体全部渗透至周围琼脂平板中，再重复添加一次，待滤液在此风干之后，37 °C温箱培养过夜，观察抑菌圈大小。
[0029]结果如图5所示，对巨大芽孢杆菌的抑菌圈表明，甲基营养芽孢杆菌ZY3A具有潜在的抑制土壤病原细菌的功能。
【主权项】
1.一株甲基营养型芽孢杆菌ZY3A，其分类命名为甲基营养型芽孢杆菌tAWotro/7Aicus)ZY3A，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号:CCTCC NO: M2015547;保藏时间2015.09.16，保藏地址为中国典型培养物保藏中心(中国.武汉.武汉大学)。2.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌ZY3A在促进油麦菜生长中的应用。3.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌ZY3A在抗油麦菜病害中的应用。4.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌ZY3A的培养物在促进油麦菜生长中的应用。5.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌ZY3A的培养物在抗油麦菜病害中的应用。6.—种制备权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌ZY3A的培养物的方法，其特征在于: 配制培养基:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.5;按2%体积接入ZY3A 的预培养物，在发酵罐中30°C培养12h后，获得的培养液即为培养物;预培养物为用接种环 取少量甲基营养型芽孢杆菌ZY3A菌种划线于LB平板，过夜培养所得到的菌落。
【文档编号】A01N63/00GK105925504SQ201610338092
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】樊奔, 李昱龙, 陈晟, 陆鸣, 陆一鸣
【申请人】南京林业大学