专利名称：基于ercc1和ts表达确定化疗方案的方法
技术领域：
本发明涉及有效用于医学，特别是癌症化疗中的预测方法。更特别是，本发明涉及评估患者中的肿瘤细胞的基因表达。通过检测人类中参与核苷酸合成和DNA修复的基因表达的mRNA，测定肿瘤细胞对细胞毒性化疗剂，特别是抗代谢药和以铂制剂的方式破坏DNA的试剂的抗性。
背景技术：
当正常细胞经历致癌性转化并成为恶性细胞时癌症发生。转化的(恶性)细胞逃离可规定细胞表型并抑制细胞增殖的正常生理控制。个体机体中的转化细胞因此增殖，形成肿瘤。当发现肿瘤时，临床目标是选择性地破坏恶性细胞，同时减轻在个体进行治疗过程中对正常细胞的任何损害。
化疗方案是以对癌细胞具有选择毒性(细胞毒性)的药物的使用为基础的。人们已经研制出了很多类化疗药物，包括干扰核酸合成，蛋白合成，及其它重要代谢过程的药物。这些通常被称作抗代谢药物。其它类的化疗药物是损害细胞的DNA。这些类药物通常被称作是基因毒性的。
然而，个体肿瘤对预期化疗药物或药物联合的敏感性常常只能在治疗的试验期之后才能准确地测定。在不成功试验期投入的时间会在临床处理侵入性恶性肿瘤时造成重大的危险。
对细胞DNA损伤的修复是由细胞的酶促DNA修复机制进行的一种重要生物过程。细胞基因组中的未修复病变可以阻碍DNA复制，损害新合成DNA的复制保真性和/或阻碍细胞存活所需基因的表达。因此，一般认为基因毒性药物对涉及DNA合成的活跃分裂的细胞比对静止、不分裂的细胞毒性更强。然而，许多机体组织的正常细胞更静止，并且不经常重新进入细胞周期和分裂。细胞分裂的各轮之间的时间更长，因此提供给由化疗基因毒性导致的正常细胞中DNA破坏的修复。因此，杀灭癌细胞达到了一定的选择性。许多治疗方案中尝试通过属于两种或更多这些类的化疗药的共同给药而改进选择性。
因为对实体瘤进行有效的化疗通常需要联合给药，而对每种单一药物的敏感性或抗性决定因素的鉴定和测量成为设计个体联合化疗的重要工具。
已经发现损害细胞DNA的广泛使用的基因毒性抗癌是顺铂(DDP)和卡铂。目前顺铂和/或卡铂用于治疗选定的、各种上皮和间质来源的肿瘤，包括呼吸道、胃肠道和生殖道、中枢神经系统的癌和肉瘤，以及头和颈的鳞状细胞癌。顺铂和其它试剂的联合目前优选用于睾丸癌的控制，在许多情况下产生持续的缓解(Loehrer等，1984，100 Ann.Int.Med.704)。顺铂(DDP)通过形成链内加合物而破坏DNA结构。DDP等铂制剂的抗性是由于对铂加合物的耐受、药物积聚减少、或DNA修复增加。
另一种具有1，2-二氨基环己烷环的基于铂的化疗剂奥沙利铂在体外和体内都表现出了抗肿瘤效力。认为这种大的携带基团导致铂-DNA加合物，该加合物比其它铂制剂形成的加合物具有更强的细胞毒性并且更有效阻断DNA复制。最近的数据表明，错配修复系统(MMR)的缺陷和复制复合物跨DNA破坏位点合成DNA(增强的复制旁路)的能力增加导致对顺铂的抗性，对奥沙利铂则并非如此(Raymond等，SeminOncol 25，Suppl 54-12，1998)。
大的DNA加合物，如铂制剂形成的加合物的切除修复似乎由参与DNA破坏识别和切除的基因介导。Cleaver等，Carcinogenesis11875-882(1990)；Hoeijmakers等，Cancer Cells 2311-320(1990)；Shivji等，Cell 69367-374(1992)。实际上，在酶促DNA修复机制的一个或多个元件中具有遗传缺陷的细胞对顺铂极为敏感。Fraval等(1978)，51 Mutat.Res.121，Beck和Brubaker(1973)，116 J.Bacteriol 1247。
切除修复交叉互补(ERCC1)基因在DNA加合物的修复中是关键的。已经克隆了人ERCC1。Westerveld等，Nature(London)310425-428(1984)；Tanka等，Nature 34873-76(1990)；(编号XM-009432，在此引入作为参考，SEO ID NO10)。一些研究使用了该基因缺陷的突变人和仓鼠细胞系，并且人肿瘤组织的研究表明，由ERCC1编码的产物参与铂-DNA加合物的切除修复。Dabholkar等，J.Natl.Cancer Inst.841512-1517(1992)；Dijt等，Cancer Res.486058-6062(1998)；Hansson等，Nucleic Acids Res.1835-40(1990)。
当转染到DNA修复缺陷的CHO细胞中时，ERCC1通过其修复铂-DNA加合物的能力赋予了对基于铂的化疗的细胞抗性。Hansson等，Nucleic Acids Res1835-40(1990)。目前接受的切除修复模型表明，破坏识别/切除是切除修复过程的限速步骤。
已经检测了接受基于铂的化疗的癌症患者的恶性细胞中ERCC1等切除修复基因表达的相对水平。Dabholkar等，J.Natl.Cancer Inst.841512-1517(1992)。已经报道，用基于铂和基于抗代谢药的联合化疗方案(顺铂/氟尿嘧啶)治疗时，胃癌患者中ERCC1的过量表达对肿瘤反应和最终存活率具有负影响。因此，ERCC1的肿瘤内表达水平是确定单独的基于铂的化疗或其与基于抗代谢药的治疗的联合是否对治疗患者有效的主要预测因子。
抗代谢细胞毒性化疗化合物包括干扰核酸合成、蛋白合成和其它重要代谢过程的药物。例如，5-氟尿嘧啶(5-FU)是一种在许多不同的癌症类型，包括如胃肠道和乳腺的主要癌症中广泛使用的药物(Moertel，C.G.New Engl.J.Med.，3301136-1142，1994)。5-FU在40多年中一直是结直肠癌标准一线治疗的单一试剂，但最近将5-FU和CPT-11的联合作为晚期结直肠癌的替代一线治疗(Saltz等，Irinotecan Study Group.New England Journal of Medicine，343905-14，2000)。5-FU和奥沙利铂的联合在结直肠癌中产生了高有效率(Ray等，Semin.Oncol.254-12，1998)。因此，很可能5-FU将在许多年中用于癌症治疗，因为它仍然是当前化疗方案中的核心成分。此外，单独的5-FU治疗仍然用于一些患者，5-FU与CPT-11或奥沙利铂的联合对这些患者特别具有毒性。
5-FU是大多数抗癌药中最典型的，因为只有少数患者对治疗产生有利的反应。大量的随机化临床试验证明，转移性结直肠癌患者对作为单一试剂的5-FU的总体肿瘤反应率为15-25％(Moertel，C.G.New Engl.J.Med.，3301136-1142，1994)。与上述其它化疗联合时，对基于5-FU的方案的肿瘤反应率为约40％。然而，大多数受治疗的患者没有从接受基于5-FU的化疗中得到明显的益处，并且经历了显著的危险、不适和花费大量开支。由于目前还没有可靠的在治疗前预测个体肿瘤对治疗的反应的方法，标准的临床实践是让所有患者接受5-FU治疗，发现大多数患者的结果不满意。
为了鉴定药物的抗肿瘤活性的最重要生化决定因素，一直在广泛研究5-FU的活性和代谢途径。最终的目的是通过a)调节5-FU的细胞内代谢和生化以及b)通过在治疗前测量患者中的反应决定性因素以预测哪些患者最可能反应(或不反应)于药物，从而改进5-FU的临床有效性。
对基于5-FU的治疗的肿瘤反应预测领域的第一个研究是对其在结直肠癌中的靶酶，胸苷酸合成酶(TS)进行的。已经克隆了TS。(Kaneda等，J.Biol.Chem.265(33)，20277-20284；编号为NM-001071，在此引入参考，即SEQ ID NO11)。Leichman等(Leichman等，J.ClinOncol.，153223-3229，1997)进行了一项前瞻性临床试验，用于在肿瘤对5-FU的反应和TS基因的表达之间建立联系，这是通过RT-PCR在结直肠癌的预治疗活检物中测定的。该研究表明1)在这些肿瘤中TS基因表达水平有大的50倍范围；和2)反应和无反应肿瘤的TS基因表达水平之间具有显著差异。反应组TS水平的范围(0.5-4.1×10-3，相对于内部对照)窄于无反应组的范围(1.6-23.0×10-3，相对于内部对照)。研究者确定了所得到的TS表达的“无反应截断值”域水平，在该水平之上仅有无反应者。这样，TS表达水平高于该“无反应截断值”域的患者可以在治疗前被阳性鉴定为无反应者。“无反应”分类包括所有肿瘤缩小＜50％，进展性生长导致肿瘤增加＞25％和非进展性肿瘤缩小＜50％，无改变或增加＜25％。这些肿瘤具有最高的TS水平。因此，高TS表达特别鉴定了具有抗性的肿瘤。TS表达水平高于某域值鉴定为对5-FU无反应的肿瘤亚型，而TS表达低于该数值的肿瘤预测具有稍高的反应率。
令人感兴趣的是，Papamichael等得出了奥沙利铂增加联合治疗的5-FU的合成代谢途径的结论(Br.J.Cancer，78(suppl.2)，98p.12.1998；Oncologist 1999；4(6)478-87)。这可以解释5-FU和奥沙利铂联合化疗在癌症中的有效性。而且，由于已知基于5-FU和基于铂的化疗分别依赖于TS和ERCC1表达水平，准确确定得到肿瘤组织的患者中ERCC1表达和TS表达对预测基于5-FU和基于铂的化疗是特别重要的。
绝大多数患者的病理样品都是按常规固定且用石蜡包埋的(FPE)，然后用于组织学分析及随后的存档。因此，绝大多数活检组织样品都不能用于基因表达的分析，这是因为这种研究需要高度完整的RNA，才能进行基因表达的准确测量。目前，基因表达水平只能通过免疫组织化学染色在这种固定且包埋的样品中定量监测，从而监测蛋白表达水平。
迄今为止，包括ERCC1和TS表达的定量基因表达研究都限于来自于新鲜和冷冻组织的RNA的逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)扩增。Reed等的美国专利5,705336公开了定量卵巢肿瘤组织中的ERCC1mRNA并确定该组织是否对基于铂的化疗敏感的方法。如Leichman等，Reed等的文章中所描述，定量冷冻肿瘤活检物的mRNA。
由健康护理专业人员使用冷冻组织具有相当大的不便。在设计任何一种基于RNA的定量遗传标记测定法时，迅速递送活检样品，以避免组织及后来的mRNA降解是首先要考虑的。进行活检的健康护理专业人员必须把组织样品迅速递送到所装备的设备上，从而在收到组织样品后立即进行RNA提取。如果没有这种设备，临床医师必须迅速将样品冷冻，从而防止mRNA降解。为了在组织和RNA降解之前使用诊断设备进行有效的RNA提取，组织样品必须保持冷冻，直到它到达诊断设备，但可以位于较远处。在转移过程中，可使用带有液氮和干冰的专用设备维持冷冻组织的完整性，但花费较高。
常规的活检样品通常含有基质和肿瘤组织的不均一混合物。与新鲜或冷冻组织不同，FPE活检组织样品可很容易地被显微解剖，分成基质和肿瘤组织，因此优于使用新鲜或冷冻组织。而RNA从固定组织，特别是固定且石蜡包埋组织中的分离会产生高度降解的RNA，这通常被认为不适于基因表达的研究。
现在有很多从生物样品中纯化RNA的技术，但还没有一种可靠的从FPE样品中分离RNA的方法。例如，Chomczynski(美国专利US5,346,994)描述了一种从组织中纯化RNA的方法，它是以液相分离为基础，使用苯酚和异硫氰酸胍进行的。在苯酚和异硫氰酸胍的水溶液中匀化生物样品，然后将匀浆与氯仿混合。离心后，匀浆分成有机相，中间相和水相。蛋白螯合在有机相中，DNA在中间相中，RNA在水相中。RNA可从水相中沉淀出来。不幸的是，该方法不适于固定且石蜡包埋的(FPE)组织样品。
分离RNA的其它已知技术通常是利用胍盐或苯酚提取，如Sambrook，J.等，(1989)pp.7.3-7.24，和Ausubel，F.M.等，(1994)pp.4.0.3-4.4.7中实施例所述。同样，在从石蜡包埋的组织样品中分离RNA方面，还没有一种已知方法能够提供可再现的测量结果。
因此，特别需要一种从石蜡包埋组织中分离RNA的技术，从而研究肿瘤组织中的基因表达，然后将某些受体或酶的表达水平用于测定特定疗法成功的可能性或适合性。
目前还没有测定对奥沙利铂的抗性或敏感性的预测标记。需要确定基于奥沙利铂/5-FU的治疗的成功可能性。我们报道了切除修复基因ERCC1的细胞内mRNA表达和胸苷酸合成酶基因(TS)的细胞内mRNA表达与进行奥沙利铂/5-FU联合化疗的肿瘤患者的临床结局具有显著的反相关。
因此，本发明的目的是提供一种定量肿瘤组织中ERCC1和/或TSmRNA的方法，以便为基因毒性化疗提供早期预测。本发明另一个目的是通过检测患者肿瘤细胞中ERCC1和/或TS mRNA的量，并把它与预定的阀表达水平进行比较，而提供一种评估固定且石蜡包埋(FPE)的组织中ERCC1和/或TS的水平，并预测患者肿瘤对5-FU和奥沙利铂治疗的可能抗性的方法。
发明内容
本发明一方面提供一种评估固定或固定且石蜡包埋(FPE)的肿瘤细胞中ERCC1 mRNA表达水平的方法。
本发明另一方面提供一种评估固定或固定且石蜡包埋(FPE)的肿瘤细胞中TS mRNA表达水平的方法。
本发明另一方面提供一种测量固定且石蜡包埋(FPE)的组织样品中相对于内部对照的ERCC1mRNA表达量的方法。该方法包括分离所述样品的总mRNA，并测定相对于内部对照基因的mRNA量的ERCC1 mRNA的量。
本发明另一方面提供一种测量固定且石蜡包埋(FPE)的组织样品中相对于内部对照的TS mRNA表达量的方法。该方法包括分离所述样品的总mRNA，并测定相对于内部对照基因mRNA量的TS mRNA的量。
在本发明这方面的其中一个实施方案中，提供具有ERCC1-504F(SEQ ID NO1)或ERCC1-574R(SEQ ID NO2)序列和具有基本上与其相同序列的寡核苷酸引物。本发明还提供这样一种寡核苷酸引物，其序列在严格条件下可与SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或它们的互补序列杂交。
在本发明这方面的另一个实施方案中，提供具有TS-763F(SEQ IDNO3)或TS-825R(SEQ ID NO4)序列和具有基本上与其相同序列的寡核苷酸引物。本发明还提供这样一种寡核苷酸引物，其序列在严格条件下与SEQ ID NO3或SEQ ID NO4或它们的互补序列杂交。
本发明另一方面提供一种确定患者的基于5-FU和奥沙利铂的化疗方案的方法，包括从固定且石蜡包埋(FPE)的肿瘤样品中分离RNA；测定样品中ERCC1的基因表达水平；把ERCC1基因表达水平与ERCC1基因的预定阈水平进行比较；根据ERCC1基因表达水平和预定阈水平的比较结果确定化疗方案。
本发明另一方面提供一种确定患者的基于5-FU和奥沙利铂的化疗方案的方法，包括从固定且石蜡包埋(FPE)的肿瘤样品中分离RNA；测定样品中TS的基因表达水平；把TS基因表达水平与TS基因的预定阈水平进行比较；根据TS基因表达水平和预定阈水平的比较结果确定化疗方案。
本发明另一方面提供一种确定患者的基于5-FU和奥沙利铂的化疗方案的方法，包括从固定且石蜡包埋(FPE)的肿瘤样品中分离RNA；测定样品中的TS和ERCC1基因表达水平；把TS和ERCC1基因表达水平与TS和ERCC1基因的预定阈水平进行比较；根据TS和ERCC1基因表达水平与预定阈水平的比较结果确定化疗方案。
本发明还涉及一种标准化组织样品中相对于内部对照基因的ERCC1和TS的未校正基因表达(UGE)的方法，其中所述组织样品是使用TaqMan技术分析的，所述方法是通过利用pre-TaqMan技术，相对于样品的内部对照，对已知的ERCC1和TS表达水平进行分析而进行的。
图1表示具有高(高于约7.5×10-3倍β肌动蛋白基因表达；n＝7)和低水平(低于约7.5×10-3倍β肌动蛋白基因表达；n＝43)的校正TS表达水平的结直肠腺癌患者接受5-FU和奥沙利铂治疗方案时估计的存活概率和以月表示的存活。
图2表示具有高(高于约4.9×10-3倍β肌动蛋白基因表达；n＝7)和低水平(低于约4.9×10-3倍β肌动蛋白基因表达；n＝40)的校正TS表达水平的结直肠腺癌患者接受5-FU和奥沙利铂治疗方案时估计的存活概率和以月表示的存活。
图3表示具有高(TS表达高于约7.5×10-3倍β肌动蛋白基因表达；ERCC1表达高于约4.9×10-3倍β肌动蛋白基因表达；n＝14)和低水平(TS表达高于约7.5×10-3倍β肌动蛋白基因表达；ERCC1表达高于约4.9×10-3倍β肌动蛋白基因表达；n＝36)的校正TS表达水平的结直肠腺癌患者接受5-FU和奥沙利铂治疗方案时估计的存活概率和以月表示的存活。
图4是表示与通过单变量分析得到的ERCC1和TS表达相关的奥沙利铂/5-FU治疗的结直肠癌患者的存活的表。
图5是表示与通过分层分析得到的ERCC1和TS表达相关的奥沙利铂/5-FU治疗的结直肠癌患者的存活的表。
图6表示采用5-FU和奥沙利铂化疗方案的结直肠腺癌患者的反应。患者分为具有进展性疾病(PD)、部分反应(PR)和稳定疾病(SD)。具有低水平TS和ERCC1表达的患者具有最佳反应。
图7是举例说明如何计算相对于内部对照基因的ERCC1表达的图表。所述图表包括用两种试验样品获得的数据，(未知1和2)，并举例说明如何测定未校正基因的表达数据(UGE)。该图表还举例说明了如何利用通过pre-TaqMan技术测定的已知相对ERCC1值，标准化TaqMan仪器所产生的UGE。这是通过用UGE乘以校正因子KERCC1完成的。图中的内部对照基因是β-肌动蛋白，校准RNA是人肝总RNA(Stratagene，目录号735017)。
图8是举例说明如何计算相对于内部对照基因的TS表达的图表。所述图表包括用两种试验样品获得的数据，(未知1和2)，并举例说明如何测定未校正基因的表达数据(UGE)。该图表还举例说明了如何利用先前公开的TS值，标准化TaqMan仪器所产生的UGE。这是通过用UGE乘以校正因子KTS完成的。图中的内部对照基因是β-肌动蛋白，校准RNA是Universal PE RNA(Applied Biosystems，目录号4307281；批号3617812014)。
图9是表示与TS表达相关的结直肠癌患者肿瘤对奥沙利铂/5-FU治疗的反应。
具体实施例方式
本发明部分依赖于TS和ERCC1 mRNA量分别与5-FU和奥沙利铂制剂抗性相关的发现。表达高水平TS和/或ERCC1 mRNA的肿瘤被认为可能对基于铂的化疗具有抗性。相反，表达低水平TS和ERCC1 mRNA的那些肿瘤可能对基于铂的化疗敏感。患者肿瘤的TS和ERCC1 mRNA表达状态是通过把它与预定的阈表达水平进行比较而确定的。
本发明提供一种测量固定或固定且石蜡包埋(FPE)的组织中，TS和/或ERCC1 mRNA相对于内部对照基因表达的表达量的方法。本发明人已经开发了可准确评估固定或固定且包埋组织中的TS和ERCC1基因表达的寡核苷酸引物。本发明的寡核苷酸引物，ERCC1-504F(SEQ IDNO1)，ERCC1-574R(SEQ ID NO2)，或基本上与其相同的寡核苷酸引物，优选与从固定且石蜡包埋(FPE)的肿瘤样品中提取出来的RNA一起使用。本发明还提供寡核苷酸引物，TS-763F(SEQ ID NO3)，TS-825R(SEQ ID NO4)，或基本上与其相同的寡核苷酸引物，优选与从固定且石蜡包埋(FPE)的肿瘤样品中提取出来的RNA一起使用。然后可将TS和/或ERCC1基因表达的这种测量值用于预测基于铂的化疗。
本发明的该实施方案包括，第一，一种确实可靠的，从FPE样品中提取RNA的方法，第二，通过使用一对寡核苷酸引物，使用逆转录酶聚合酶链式反应测定样品中ERCC1 mRNA含量的方法，其中优选寡核苷酸引物对ERCC1-504F(SEQ ID NO1)和ERCC1-574R(SEQ ID NO2)，或基本上与其相同的寡核苷酸。
“基本上相同”的核酸是指在严格条件下与靶杂交的核酸，及适当比对时，与具有适当核苷酸插入和缺失的核酸相比较时，至少约60％，优选至少约70％，更优选至少约80％，优选至少约90％，更优选至少约95-98％的核苷酸相同的核酸片段，或它们的互补链。当选择性高于特异性时，存在选择性杂交。见，Kanehisa，NucleicAcids Res.，12203-213(1984)。
本发明的该实施方案进一步包括，通过使用一对寡核苷酸引物，使用逆转录酶聚合酶链式反应测定样品中ERCC1 mRNA含量的方法，其中优选寡核苷酸引物对TS-763F(SEQ ID NO3)和TS-825R(SEQ IDNO4)或基本上与其相同的寡核苷酸。RNA是通过1999年12月20日提交的美国专利申请09/469,338中描述的任意mRNA分离的方法从FPE细胞中提取的，该专利申请在此引用作为参考。
本发明的方法适用于患者的任意组织类型。对于检验肿瘤组织的抗性，优选检验肿瘤组织。在优选实施方案中，检验得到肿瘤组织的患者的一部分正常组织。然后可以用更高量的化疗组合物治疗那些预计正常组织对基于铂的化疗化合物具有抗性，即表现出高水平TS和/或ERCC1基因表达，但预计肿瘤组织对所述化合物敏感，即表现出低水平TS和/或ERCC1基因表达的患者。
本发明的方法适用于各种肿瘤类型。它可制备个体“肿瘤表达分布”，由此在个体患者的样品中测定TS和/或ERCC1的表达水平，并预测对各种化疗的反应。优选，本发明的方法适用于实体瘤，最优选结直肠癌。
此处定义的ERCC1表达的“预定阈水平”是一种ERCC1表达水平，当高于此水平时，肿瘤可能对基于5-FU和/或奥沙利铂的化疗方案有抗性。表达水平低于该域值的肿瘤可能对基于5-FU和/或奥沙利铂的化疗方案敏感。表示为ERCC1β-肌动蛋白之比的相对ERCC1表达在反应于基于铂的化疗方案的肿瘤中的范围为低于约4.9×10-3。不反应于基于铂的化疗方案的肿瘤中表示为ERCC1β-肌动蛋白之比的相对ERCC1表达范围为高于约4.9×10-3。
此处定义的TS表达的“预定阈水平”是一种TS表达水平，当高于此水平时，肿瘤可能对基于5-FU或5-FU以及奥沙利铂的化疗方案有抗性。表达水平低于该域值的肿瘤可能对基于5-FU或5-FU以及奥沙利铂的化疗方案敏感。表示为TSβ-肌动蛋白之比的相对TS表达在反应于基于5-FU或5-FU以及奥沙利铂的化疗方案的肿瘤中的范围为低于约7.5×10-3。不反应于基于5-FU或5-FU以及奥沙利铂的化疗方案的肿瘤中表示为TSβ-肌动蛋白之比的相对TS表达范围为高于约7.5×10-3。
在进行本发明的方法时，测定患者肿瘤样品中的ERCC1表达水平或TS表达水平，从而预测基于5-FU和奥沙利铂的化疗方案的效力。此外，在本发明的方法中，测定患者肿瘤样品的TS表达水平，从而预测基于5-FU和奥沙利铂的化疗方案的效力。此外，在本发明的方法中，测定患者肿瘤样品的ERCC1表达水平，从而预测基于奥沙利铂的化疗方案的效力。可选择地，测定患者肿瘤样品的ERCC1表达水平和TS表达水平，从而预测基于5-FU和奥沙利铂的联合化疗方案的效力。
在进行本发明该实施方案的方法时，优选分离患者的肿瘤细胞。实体或淋巴瘤或其一部分是通过手术从患者切除下来的，或通过常规的活检获得。从冷冻或新鲜肿瘤样品中分离出来的RNA是通过本领域任何一种典型的方法从细胞中提取出来的，例如Sambrook，Fischer和Maniatis，Molecular Cloning，alaboratory manual，(2nded.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork，(1989)。优选在提取过程中，注意避免RNA降解。
然而，患者的组织在活检后常常被固定，例如，通常用福尔马林(甲醛)或gluteraldehyde固定，或用醇浸渍。通常是使固定的生物样品脱水，并将其包埋在石蜡或本领域那些技术人员已知的其它固体支持物中。见Plenat等，Ann Pathol 2001 Jan；21(1)29-47。没有包埋的固定组织及固定且包埋的组织都可用于本发明的方法中。将包埋固定组织的固体支持物设计为可用有机溶剂除去，随后使保存的组织再水合。
RNA是通过1999年12月20日提交的美国专利申请US 09/469,338中描述的任何一种方法从FPE细胞中提取出来的，所述专利申请全部引入此处作为参考。此处所述固定且石蜡包埋(FPE)的组织是指可储存或存档的组织样品。RNA可从存档的病理样品或活检样品中分离出来，其首先脱石蜡。代表性的脱石蜡方法包括用有机溶剂，如二甲苯洗涤石蜡包埋的样品。脱石蜡样品还可用低级醇的水溶液再水合。适宜的低级醇包括，例如甲醇，乙醇，丙醇和丁醇。脱石蜡样品可用逐渐降低浓度的低级醇溶液连续洗涤而再水合。可选择地，样品可同时脱石蜡和再水合。然后提取样品中的RNA。
为了提取RNA，可利用机械，声波或其它匀化工具匀化固定或固定且脱石蜡的样品。再水合的样品可在含有离液剂，如硫氰酸胍(也可作为异硫氰酸胍销售)的溶液中匀化。将离液溶液中的匀化样品加热至约50-约100℃，所述离液溶液含有有效量的离液剂，如胍化合物。优选的离液剂是硫氰酸胍。
“有效浓度的离液剂”的选择是指从石蜡包埋的样品中纯化的RNA量比没有离液剂情况下分离出来的RNA量高大约10倍。离液剂包括，如，胍化合物，脲，甲酰胺，碘化钾，硫氰酸钾及类似的化合物。本发明方法的优选离液剂是胍化合物，如异硫氰酸胍(也作为硫氰酸胍销售)和盐酸胍。很多阴平衡离子都是有用的，本领域的技术人员可用这种适宜的阴离子制备多种胍盐。本发明所用胍溶液的有效浓度通常约为1-5M，优选约4M。如果RNA已存在于溶液中，那么胍溶液的浓度可以更高，这样，样品中获得的最终浓度约为1-5M。优选用适当的生化缓冲液，如Tris-HCl把胍溶液缓冲至pH约3-6，更优选约4。离液溶液还可含有还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)和β-巯基乙醇(BME)。离液溶液还可含有RNA酶抑制剂。
然后通过苯酚-氯仿萃取，离子交换色谱或大小排阻色谱回收离液溶液中的RNA。然后，利用提取，电泳，层析，沉淀技术或其它适宜技术进一步纯化RNA。
TS或ERCC1 mRNA的定量优选使用本领域常用的逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)进行，其中所述TS或ERCC1 mRNA来源于新鲜，冷冻，或固定组织的纯化总mRNA。定量TS或ERCC1 mRNA的其它方法包括，例如，使用多重PCR中所用的分子指标和其它标记探针。此外，本发明还利用没有PCR的系统测量TS和/或ERCC1的mRNA，其中没有PCR的系统使用的是与Invader测定(ThirdWave Technologies，Inc.)中使用的探针相似的荧光标记探针。最优选，TS和/或ERCC1cDNA及内部对照或管家基因(例如，β-肌动蛋白)的定量是利用基于荧光的实时检测法(ABIPRISM 7700或7900 Sequence DetectionSystem[TaqMan]，Applied Biosystems，FosterCity，CA.)或与Heid等(Genome Res 1996；6986-994)和Gibson等(Genome Res 1996；6995-1001)所述相似的系统进行的。ABI7700(TaqManInstrument)的输出量是以Ct’s或“循环阈”表示的。使用TaqMan系统，样品中具有较高数量靶分子的高水平表达基因产生一种信号，并且PCR循环(较低的Ct)比具有较少靶分子(较高的Ct)的低水平相对表达的基因要少。
此处所用“管家”基因或“内部对照”是任何一种组成型或全局型表达基因，它的存在可评估TS和/或ERCC1 mRNA的水平。这种评估包括测定基因转录的总体组成型水平和RNA回收中变异的对照。“管家”基因或“内部对照”包括，但不限制于亲环蛋白基因，β-肌动蛋白基因，转铁蛋白受体基因，GAPDH基因等。最优选内部对照基因是β-肌动蛋白基因，如Eads等，Cancer Research 1999；592302-2306所述。
RNA回收中变异的对照需要使用“校准RNA”。“校准RNA”可以是任何一种可得到的精确预定量的对照RNA。优选使用人肝总RNA(Stratagene，目录号735017)定量ERCC1，使用Universal PE RNA(Applied Biosystems，目录号4307281，批号3617812014)定量TS。
此处所用“未校正基因表达(UGE)”是指由TaqMan仪器产生的相对于内部对照基因的TS和/或ERCC1表达的数字输出。用于确定UGE的公式在实施例3和4中表示，并用图7和8的样品计算结果举例说明。
本发明另一方面提供一种校准化未校正基因表达(UGE)值的方法，所述未校正基因表达(UGE)值是利用源于非-TaqMan技术的“已知相对基因表达”值，从TaqMan仪器获得的。优选，源于TaqMan的组织样品TS和/或ERCC1 UGE值是相对于样品，用已知源于非-TaqMan的相对TS和/或ERCC1β-肌动蛋白表达值标准化的。
此处所用“校正的相对ERCC1表达”是指标准化的ERCC1表达，UGE乘以ERCC1特异性校正因子(KERCC1)得到一个值，该值可与ERCC1相对于内部对照基因的已知表达水平范围相比较。实施例3和图7详细说明了这些计算结果。这些数值可确定特定样品的“校正相对ERCC1表达”是高于还是低于“预定阈”水平。相对于β-肌动蛋白水平的校正的相对ERCC1表达的预定域水平为约4.9×10-3。ERCC1，内部对照β-肌动蛋白和校准人肝总RNA(Stratagene，目录号735017)的特异性KERCC1为1.54×10-3。
“已知的相对基因表达”值源于先前分析的组织样品，且它是以靶基因的RT-PCR信号与组成型表达的内部对照基因(例如，β-肌动蛋白，GAPDH等)的比值为基础的。优选这种组织样品是用福尔马林固定并用石蜡包埋(FPE)的样品，RNA是按照实施例1描述的方案从它们之中提取出来的。为了测量相对于内部对照的基因表达，使用了本领域已知的标准定量RT-PCR技术。Pre-TaqMan技术PCR反应进行固定的循环数(即，30次)，并报告每份样品的终点值。然后按照ERCC1表达与β-肌动蛋白表达的比值报道这些值。见Reed等的美国专利5,705,336。
除了β-肌动蛋白和/或不同于人肝总RNA(Stratagene，目录号735017)的校准RNA之外，还可测定其它内部对照基因的KERCC1。为此，人们必须校准内部对照基因和校准RNA，其中已经测定了相对于特定内部对照基因ERCC1的表达水平(即，“已知的相对基因表达”)。优选这种组织样品是福尔马林固定且石蜡包埋的(FPE)样品，RNA是按照实施例1和1999年12月20日提交的美国专利申请09/469,338描述的方案从它们之中提取出来的，该专利申请在此全文引入作为参考。这种测定可使用本领域熟知的标准pre-TaqMan定量RT-PCR技术进行。根据这种测定，这种样品具有ERCC1的“已知相对基因表达”水平，可用于测定对实施例3所述的新内部对照和/或校准RNA特异的新KERCC1。
此处所用“校正的相对TS表达”是指标准化的ERCC1表达，UGE乘以TS特异性校正因子(KTS)得到一个值，该值可与相对于内部对照基因的TS已知表达水平范围相比较。实施例4和图8详细说明了这些计算结果。这些数值可确定特定样品的“校正相对TS表达”是高于还是低于“预定阈”水平。相对于β-肌动蛋白水平的校正的相对ERCC1表达的预定域水平为约7.5×10-3。ERCC1，内部对照β-肌动蛋白和校准Universal PE RNA(Applied Biosystems，目录号4307281，批号3617812014)的特异性KERCC1为12.6×10-3。
除了β-肌动蛋白和/或不同于Universal PE RNA(AppliedBiosystems，目录号4307281，批号3617812014)的校准RNA之外，还可测定相对于其它内部对照基因的KTS。为此，人们必须校准内部对照基因并校准RNA，其中已经测定了相对于特定内部对照基因TS的表达水平(即，“已知的相对基因表达”)。优选这种组织样品是福尔马林固定且石蜡包埋的(FPE)样品，RNA是按照实施例1和1999年12月20日提交的美国专利申请09/469,338描述的方案从它们之中提取出来的，该专利申请在此全文引入作为参考。这种测定可使用本领域熟知的标准pre-TaqMan定量RT-PCR技术进行。根据这种测定，这种样品具有TS的“已知相对基因表达”水平，可用于测定对实施例4所述的新内部对照和/或校准RNA特异的新KTS。
“以前公开的”相对基因表达结果是基于靶基因的RT-PCR信号与组成型表达的基因(β-激动蛋白)的比值。在pre-TaqMan技术研究中，进行固定循环数(即30)的PCR反应，报道每个样品的终点值。这些值然后报道为ERCC1或TS表达与β-激动蛋白表达的比。Salonga等，Clinical Cancer Research，61322-1327，2000，在此全文引入作为参考。
本发明的方法可适于各种组织和肿瘤类型，可用于评估患者的临床治疗，并作为各种癌症，包括乳腺癌，头颈癌，肺癌，食管癌，结肠直肠癌等的诊断或预后工具。在优选实施方案中，本发明的方法适于结直肠腺癌的预后。
化疗前治疗肿瘤活检样品通常只对固定且石蜡包埋(FPE)的组织有效，这些组织通常只含有非常少量的不均一组织。这种FPE样品可很容易经过显微解剖，这样就可测定没有污染非恶性基质组织的肿瘤组织中的TS和/或ERCC1基因表达。此外，比较还可在活检组织样品内的非恶性基质组织和肿瘤组织间进行，因为这种样品常常含有两种类型的组织。
通常，如SEQ ID NO10所示，与ERCC1基因的一个区侧面连接的任何寡核苷酸对都可用于进行本发明的方法。在严格条件下与ERCC1基因的一个区杂交，用于本发明的引物可扩增20-1000个碱基对，优选50-100个碱基对，最优选少于100个碱基对的产物。
本发明提供特异性的寡核苷酸引物对和与其基本上相同的寡核苷酸引物，可利用FPE组织精确评估ERCC1表达。优选寡核苷酸引物，ERCC1-504F(SEQ ID NO1)和ERCC1(SEQ ID NO2)，(此处也称为寡核苷酸引物对ERCC1)和基本上与其相同的寡核苷酸引物。寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO1)和ERCC1(SEQ ID NO2)显示出对测量ERCC1 mRNA的水平特别有效，所述测量是使用通过任何一种mRNA分离方法从FPE细胞中提取出来的RNA进行的，如实施例1所述。
此外，如SEQ ID NO11所示，与TS基因的一个区侧面连接的任何寡核苷酸对都可用于进行本发明的方法。在严格条件下与TS基因的一个区杂交，用于本发明的引物可扩增20-1000个碱基对，优选50-100个碱基对，最优选少于100个碱基对的产物。
本发明提供特异性的寡核苷酸引物对和与其基本上相同的寡核苷酸引物，可利用FPE组织精确评估TS表达。优选寡核苷酸引物，TS-763F(SEQ ID NO3)和TS(SEQ ID NO4)，(此处也称为寡核苷酸引物对TS)和基本上与其相同的寡核苷酸引物。寡核苷酸引物TS-763F(SEQ ID NO3)和TSSEQ ID NO4)显示出对于测量TS mRNA的水平特别有效，所述测量是使用通过任何一种mRNA分离方法从FPE细胞中提取出来的RNA进行的，如实施例1所述。
本发明包括基本上相同的寡核苷酸，其在严格条件下(如此处所定义的)与ERCC1-504F(SEQ ID NO1)，其互补序列，或ERCC1-574R(SEQ ID NO2)，或其互补序列的寡核苷酸引物序列，或TS-763F(SEQ ID NO3)，其互补序列，或TS-825R(SEQ ID NO4)或其互补序列的核苷酸引物序列的全部或一部分杂交。
在严格的杂交条件下，只有高度互补的，即，与此处所定义的基本上相似的核酸序列才能进行杂交。优选，这种条件会阻碍20个连续核苷酸中有4个或更多错配，更优选20个连续核苷酸中有2个或更多错配，最优选20个相连核苷酸中有1个或更多错配的核酸进行杂交。
核酸的杂交部分通常至少约为10个(例如，15个)核苷酸长。核酸进行杂交的部分与寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO1)，其互补序列，或ERCC1-574R(SEQ ID NO2)，或其互补序列，或寡核苷酸引物TS-763F(SEQ ID NO3)，其互补序列，或TS-825R(SEQ IDNO4)或其互补序列的全部或一部分序列至少约80％，优选至少约95％，或最优选至少约98％相同。
寡核苷酸引物与核酸样品在严格条件下的杂交在下面规定。核酸双链体或杂交体的稳定性是以解链温度(Tm)表示的，它是探针从靶DNA解离下来的温度。解链温度可用于限定所需的严格条件。如果所要鉴定的序列与探针基本上相同，而不是相同，那么它可首先用于确定最低温度，在最低温度时，只有使用特殊浓度的盐(例如，SSC或SSPE)才能进行同源杂交。然后，假定1％错配导致Tm降低1℃，那么杂交反应的最终洗涤温度因此降低(例如，如果找到与探针的同一性＞95％的序列，那么最终的洗涤温度降低5℃)。实际上，Tm在0.5℃-1.5℃/1％错配之间变化。
严格条件包括约68℃时，在5xSSC/5xDenhart’s溶液/1.0％SDS中杂交，室温时，在0.2xSSC/0.1％SDS中洗涤。中度的严格条件包括约42℃时，在3xSSC中洗涤。改变盐浓度和温度参数，可在引物和靶核酸之间获得最佳的同一性水平。有关这种条件的其它指导可在本领域中很容易地得到，例如，Sambrook，Fischer和Maniatis，MolecularCloning，a laboratory manual，(2nded.)，Cold Spring HarborLa boratory Press，NewYork，(1989)和F.M.Ausubel等编辑，CurrentProtocols in Molecular Biology，JohnWiley和Sons(1994)。
此处公开的寡核苷酸引物能够精确评估固定或固定且石蜡包埋的组织，及冷冻或新鲜组织中的TS和/或ERCC1基因表达。FPE样品的RNA比新鲜或冷冻组织的RNA更破碎。因此，本发明的方法适用于测定所有组织中的TS和/或ERCC1基因表达，而先前不存在利用固定组织测定TS和/或ERCC1基因表达的方法。
可以与基于5-FU和奥沙利铂的化疗联合的基因毒性剂形成持续的基因组损伤并且优选作为癌症的临床控制。基因毒素诱导的DNA破坏的细胞修复速度，以及通过细胞分裂周期进行的细胞生长影响了基因毒素治疗的结果。细胞基因组中未修复的损伤可以妨碍DNA复制，妨碍新合成的DNA的复制保真性或阻碍细胞存活所需基因的表达。因此，基因毒性剂的细胞毒性(导致细胞死亡的倾向)的一个决定因素是由其形成的基因组损伤对细胞修复的抗性。形成持续的基因组损伤，如保持在基因组中至少到细胞进行细胞周期的损伤的基因毒性剂，相对于形成瞬时的、容易修复的基因组损伤的试剂一般是更有效的细胞毒素。
基因毒素奥沙利铂，即顺-草酸(反-1-1，2-环己烷二胺)铂(II)描述于美国专利4,169,846。相关的专利包括美国专利5,290,961；美国专利5,298,642；美国专利5,338,874；美国专利5,420,319和PCT/IB/00614。奥沙利铂属于目前正在全面开发的铂(II)-反-1，2-二氨基环己烷复合物类。所述复合物，或“dach”复合物正在进行临场试验并且对黑素瘤和卵巢、子宫、胃和肠的肿瘤特别有效。其它用于补充基于5-FU和奥沙利铂的化疗的化合物也可以包括奥沙利铂的类似物如“dach”复合物和形成共价DNA加合物的那些。在优选的实施方案中，用于本发明的补充的铂化合物是奥沙利铂。
目前可以用铂配位化合物控制的肿瘤包括睾丸、子宫内膜、宫颈、胃、鳞状细胞、肾上腺皮质和小细胞肺癌，以及成髓细胞瘤和成神经细胞瘤。
上面描述了本发明，本发明的实际操作是通过下面给出的实验性实施例举例说明的。技术人员应认识到说明实施例中使用的材料和方法可以各种方式进行改进。这种改进也被认为落在本发明的范围之内。
实施例实施例1从FPE组织中分离RNARNA是通过下列一般过程从石蜡包埋组织中提取出来的。
A.切片的脱石蜡和水合(1)把约10μM的切片的一部分放在1.5mL塑料离心管中。
(2)加入600μL二甲苯，室温(约20-25℃)用力振摇混合物约10分钟。
(3)室温时，以台式离心机的最大速度(约10-20,000xg)将样品离心约7分钟。
(4)重复步骤2和3，直到绝大部分石蜡溶解。根据原始样品部分所含的石蜡量，通常需要重复2次或更多次。
(5)用低级醇，优选用100％乙醇(约600μL)用力振摇约3分钟，除去二甲苯溶液。
(6)按照步骤(3)将试管离心约7分钟。倾出并弃去上清液。颗粒状物变为白色。
(7)用更稀释的乙醇溶液首先用约95％乙醇，然后用约80％乙醇，最后用约70％乙醇连续重复步骤5和6。
(8)按照步骤(3)，室温将样品离心7分钟。弃去上清液，室温干燥颗粒状物约5分钟。
B.用苯酚-氯仿分离RNA(1)加入400μL含0.5％肌氨酸的异硫氰酸胍溶液和8μL二硫苏糖醇。
(2)然后用组织匀浆器(Ultra-Turrax，IKA-Works，Inc.，Wilmington，NC)匀化样品约2-3分钟，速度从低速(速度1)到高速(速度5)逐渐升高。
(3)然后将样品在大约95℃时加热约5-20分钟。优选在加热到95℃之前，用细针刺入含样品的试管的管帽。可选择地，管帽可用塑料夹子或实验用薄膜固定。
(4)然后用pH4.0的50μL 2M醋酸钠和600μL苯酚/氯仿/异戊醇(10∶1.93∶0.036)萃取样品，其中苯酚/氯仿/异戊醇(10∶1.93∶0.036)是用18mL苯酚和3.6mL 1∶4 9的异戊醇∶氯仿溶液新制备的。用力振摇溶液约10秒，然后在冰上冷却约15分钟。
(5)以最大速度将溶液离心约7分钟。将上层的(水)相转移到一个新的试管中。
(6)-20℃时，用约10μL糖原和400μL异丙醇沉淀RNA 30分钟。
(7)通过在台式离心机中以最大速度离心约7分钟，而使RNA成为颗粒状物；倾出并弃去上清液；用大约500μL约70-75％的乙醇洗涤颗粒状物。
(8)以最大速度将样品再次离心7分钟。弃去上清液，并将颗粒状物风干。然后将颗粒状物溶解在适宜的缓冲液中，用于进一步的实验(例如，50pL 5mM Tris氯化物，pH8.0)。
实施例2mRNA的逆转录和PCR逆转录如实施例1中举例说明和1999年12月20日提交的美国专利申请US 09/469,338中的描述(全文引入此处作为参考)，RNA是从显微解剖或非-显微解剖的福尔马林固定的石蜡包埋(FPE)组织中分离出来的。用乙醇沉淀并离心后，将RNA颗粒状物溶解在50μL pH8.0的5mM Tris/Cl中。M-MLV逆转录酶可延伸一种寡核苷酸引物，其在脱氧核苷酸存在的情况下与单链RNA或DNA模板杂交，产生互补链。所得RNA是用来源于Life Technologies的M-MLV逆转录酶和随机的六聚体逆转录的。逆转录是通过把25μLRNA溶液与25.5μL“逆转录混合物”混合进行的(见下面)。将反应物放在热循环仪中，26℃时8分钟(用于使随机的六聚体与RNA结合)，42℃时45分钟(用于M-MLV逆转录酶促反应)，95℃时5分钟(用于DNA酶的热灭活)。
“逆转录混合物”由以下成分组成10μl 5X缓冲液(250mMTris-HCl，pH8.3，375mM KCl，15mM MgCl2)，0.5μl随机的六聚体(500.D.溶解在550μl，pH7.5的10mM Tris-HCl中)，5μl 10mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)，5μl 0.1M DTT，1.25μl BSA(在pH7.5的10mM Tris-HCL中为3mg/ml)，1.25μl RNAGuard24，800U/ml(RNA酶抑制剂)(目录号27-0816，AmershamPharmacia)和2.5μl MMLV 200U/μl(Life Tech目录号28025-02)。
反应组分的最终浓度是50mM Tris-HCl，pH8.3，75mM KCl，3mMMgCl2，1.0mMdNTP，1.0mM DTT，0.00375mg/ml BSA，0.62U/μl RNAGuard和10U/μlMMLV。
mRNA表达的PCR定量。ERCC1 cDNA和内部对照或管家基因(例如β-肌动蛋白)cDNA的定量是使用Heid等，(Genome Res1996；6986-994)；Gibson等，(Genome Res1996；6995-1001)所述的基于荧光的实时检测法(ABI PRISM 7700或7900序列检测系统[TaqMan]，Applied Biosystems，FosterCity，CA.)进行的。简言之，该方法使用一种双重标记的产荧光TaqMan寡核苷酸探针，(ERCC1-530Tc(SEQ ID NO5)，Tm＝70℃；TS-781(SEQ ID NO6)，β-肌动蛋白-611(SEQ ID NO7)，其特异性地在正向和反向引物内退火。含反应混合物的加盖孔内的激光刺激引起3’猝灭剂染料(TAMRA)发射，直到探针在PCR延伸过程中被DNA聚合酶的5’-3’核酸酶活性裂解，引起5’报道染料(6FAM)的释放。因此，扩增子的产生引起荧光信号的发射，这是通过TaqMan’sCCD(电荷耦合器件)检测照相机检测的，PCR反应纯指数相内，阈循环所产生的信号量可反映目标序列的起始拷贝数。目标序列起始拷贝数与内部对照基因起始拷贝数的比较可提供相对基因表达水平。TaqMan分析了产率的水平，它是以两个绝对测量值间的比值(目标基因/内部对照基因)表示的。
PCR反应混合物由以下成分组成0.5μl含有如上制备的cDNA的逆转录反应物，600nM各寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO1，Tm＝59℃)和ERCC1-574R(SEQ ID NO2，Tm＝58℃)或寡核苷酸引物TS-763F(SEQ ID NO3)和TS-825R(SEQ ID NO4)，200nMTaqMan探针(SEQ ID NO3或SEQ ID NO6)，5U AmpliTaq Gold聚合酶，200μM各dATP，dCTP，dGTP，400μM dTTP，5.5mMMgCl2，和含有参考染料的1xTaqman缓冲液A，最终的体积小于或等于25μl(所有试剂，AppliedBiosystems，FosterCity，CA)。循环条件是，95℃10分钟，然后是95℃15秒和60℃1分钟循环45次。用于定量内部对照基因β-肌动蛋白的寡核苷酸是β-肌动蛋白-592F(SEQ ID NO8)和β-肌动蛋白-651R(SEQ ID NO9)。
实施例3测定ERCC1的未校正基因表达(UGE)进行两对平行反应。“试验”反应和“校准”反应。图7。ERCC1扩增反应和β-肌动蛋白内部对照扩增反应是试验反应。单独的ERCC1和β-肌动蛋白扩增反应是在校准RNA模板上进行的，被称作校准反应。TaqMan仪器产生4个不同的循环阈(Ct)值试验反应的CtERCC1和Ctβ-肌动蛋白，和校准反应的CtERCC1和Ctβ-肌动蛋白。两种反应的Ct差值是根据下列公式确定的ΔCt试验＝CtERCC1-Ctβ-肌动蛋白(“试验”反应)ΔCt校准＝CtERCC1-Ctβ-肌动蛋白(“校准”反应)下一步是按照下列公式计算2的负ΔCt次方。
2-ΔCt试验(“试验”反应)2-ΔCt校准(“校准”反应)为了从TaqMan仪器获得ERCC1的未校正基因表达，进行了下列计算ERCC1的未校基因表达(UGE)＝2-ΔCt试验/2-ΔCt校准用已知的相对ERCC1表达水平标准化UGE
标准化的计算需要将UGE乘以对ERCC1和特定校准RNA特异的校正因子(KERCC1)。还可测定任何一种内部对照基因和任何一种精确预定量的校准RNA的校正因子KERCC1。优选，使用内部对照基因β-肌动蛋白和精确预定量的校准RNA，人肝总RNA(Stratagene，目录号735017)。已知这些试剂的校正因子KERCC1等于1.54×10-3。
标准化是使用ΔCt方法的改进法进行的，所述ΔCt方法由Applied Biosystems，TaqMan制造商，在UserBulletin#2中和上文描述。为了进行该过程，使用上述TaqMan方法，分析了6个不同FPE试验组织的UGE的ERCC1表达。使用内部对照基因β-肌动蛋白和校准RNA，人肝总RNA(Stratagene，目录号735017)。
用各样品AG221，AG222，AG252，成人肺，PC3，AdCol的已知相对ERCC1表达水平除以其相应的源于TaqMan的UGE，得到不平均的校正因子K。
K不平均的＝已知的值/UGE接下来，求全部K值的平均值，从而确定对ERCC1，校准RNA即Stratagene人肝总RNA(Stratagene，目录号735017)和β-肌动蛋白特异的单一KERCC1校正因子。
因此，为了成规模地测定与pre-TaqManERCC1表达研究一致的，未知组织样品中的校正相对ERCC1表达，人们只需用源于TaqMan仪器的未校正基因表达数据(UGE)乘以KERCC1特异性校正因子，前提是使用相同的内部对照基因和校准RNA。
校正的相对ERCC1表达＝UGE×KERCC1KERCC1可使用任何一种精确预定量的校准RNA或内部对照基因测定。未来来源的精确预定量RNA可按照上述方法，相对于样品用已知的相对ERCC1表达校准或可相对于先前已经校准过的校准RNA，如上述人肝总RNA(Stratagene，目录号735017)校准。
例如，如果随后测定不同的内部对照基因和/或不同的校准RNA的KERCC1，则人们必须相对于组织样品校准内部对照基因和校准RNA，其中已经测定了相对于特定内部对照基因的ERCC1表达水平。这种测定可使用本领域熟知的标准pre-TaqMan，定量RT-PCR技术进行。用这些样品的已知表达水平除以它们相应的UGE水平，可确定样品的K值。然后根据已知样品数，求K值的平均值，从而测定对不同内部对照基因和/或校准RNA特异的新KERCC1。
实施例4测定TS的未校正基因表达(UGE)进行两对平行反应。“试验”反应和“校准”反应。图7。TS扩增反应和β-肌动蛋白内部对照扩增反应是试验反应。单独的TS和β-肌动蛋白扩增反应是在校准RNA模板上进行的，被称作校准反应。TaqMan仪器产生4个不同的循环阈(Ct)值试验反应的CtTS和Ctβ-肌动蛋白，及校准反应的CtTS和Ctβ-肌动蛋白。两种反应之间的Ct差值是根据下列公式确定的ΔCt试验＝CtTS-Ctβ-肌动蛋白(“试验”反应)ΔCt校准＝CtTS-Ctβ-肌动蛋白(“校准”反应)下一步是按照下列公式计算2的负ΔCt次方。
2-ΔCt试验(“试验”反应)2-ΔCt校准(“校准”反应)为了TaqMan仪器获得TS的未校正基因表达，进行了下列计算TS的未校基因表达(UGE)＝2-ΔCt试验/2-ΔCt校准用已知的相对TS表达水平标准化UGE标准化的计算需要将UGE乘以对TS和特定校准RNA特异的校正因子(KTS)。还可测定相对于任何一种内部对照基因和任何一种精确预定量的校准RNA的校正因子KTS。优选，使用内部对照基因β-肌动蛋白和精确预定量的校准RNA，Universal PE RNA(AppliedBiosystems，目录号4307281，批号3617812014)。这些试剂的校正因子KTS等于12.6×10-3。
标准化是使用ΔCt方法的改进法进行的，所述ΔCt方法是由Applied Biosystems，TaqMan制造商，在User Bulletin#2中和上文描述的。为了进行该过程，使用上述TaqMan方法，分析了6个不同FPE试验组织的UGE的TS表达。这些组织样品描述于Salonga等，Clinical Cancer Research，61322-1327，2000，在此全文引入作为参考。使用内部对照基因β-肌动蛋白和校准RNA，Universal PERNA(Applied Biosystems，目录号4307281，批号3617812014)。
用以前公开的各样品L7，L91，L121，L150，L220，L164的相对TS表达水平除以其相应的源于TaqMan的UGE，得到不平均的校正因子K。Salonga等，Clinical Cancer Research，61322-1327，2000，在此全文引入作为参考。
K不平均的＝已知的值/UGE接着，求全部K值的平均值，确定对TS，校准RNA，即UniversalPE RNA(Applied Biosystems，目录号4307281，批号3617812014)和β-肌动蛋白特异的单一KTS校正因子。
因此，为了成规模地测定与pre-TaqManTS表达研究相一致的未知组织样品中的校正相对TS表达，人们只需把源于TaqMan仪器的未校正基因表达数据(UGE)乘以KTS特异性校正因子，前提是使用相同的内部对照基因和校准RNA。
校正的相对TS表达＝UGE×KTSKTS可使用任何一种精确预定量的校准RNA或内部对照基因测定。未来来源的精确预定量RNA可按照上述方法，相对于样品，用已知的相对TS表达校准或相对于先前校准过的校准RNA，如上述UniversalPE RNA(Applied Biosystems，目录号4307281，批号3617812014)校准。
例如，如果随后测定相对于不同的内部对照基因和/或不同的校准RNA的KTS，人们必须相对于组织样品校准内部对照基因和校准RNA，其中已经测定或公开了相对于特殊内部对照基因的TS表达水平。这种测定可使用本领域熟知的标准pre-TaqMan，定量RT-PCR技术进行。用这些样品的已知表达水平除以它们相应的UGE水平，可确定样品的K值。然后根据已知样品数，求K值的平均值，从而测定对不同内部对照基因和/或校准RNA特异的新KTS。
实施例5患者选择和化疗所有患者在1998-2000年在南加利福尼亚大学医学中心注册参与3C-98-3方案并接受以下奥沙利铂/5-FU联合治疗方案130mg/m2奥沙利铂加连续5-FU输注。所有患者在治疗前用5-FU治疗失败，60％(30/50)患者用irinotecan(CPT-11)进行二线治疗失败。所有患者在入选方案时表现出IV期结直肠癌的活跃疾病。
临床评估和反应标准在化疗中，每周记录身体状况、体重、腹痛、完整的血计数和血清肌酐以及尿素氮水平的评估结果。使用计算机体层摄影(CT)测量肿瘤大小。在入组时必须有二维可测量的肿瘤团块。治疗的反应者分类为肿瘤缩小50％或更多，持续至少6周。无反应者包括具有稳定疾病或癌症进展的患者。存活期计算为从5-FU/奥沙利铂化疗开始至任何原因的死亡的天数。在最后一次随访评估时存活的患者在此时进行检查。
统计学分析TaqMan分析产生了两个绝对测量值之间的比值(目的基因内部参考基因)。分别用Mann-Whitney检验和Kruskal-Wallis检验评估TS和ERCC1表达(作为连续变量)与患者统计值之间的关系。Zar，Biostatistical Analysis.Prentice-Hall，Inc Englewood Cliffs，N.J.(1974)，p109-114和139-142。Miller和Sigmund(Miller等，Biometrics 381011-1016，1982)及Halpern(Biometrics381017-1023，1982)的最大卡方方法适于测定最有利于将患者二分成低和高TS和ERCC1表达亚组的截断域值。Pearson卡方检验用于评估二分的分子标记和对化疗的反应之间的关联。Zar，BiostatisticalAnalysis.Prentice-Hall，Inc Englewood Cliffs，N.J.(1974)，p59-68。危险比用于计算死亡的相对危险性。这些计算是基于Pike估计，使用观察到的和对数秩检验统计中计算的预计事件数(Pike，JR Stat Soc Series A 135201-203，1972)。为了测定P值，其中所述P值被解释为以最大卡方分析为基础的相关强度的测量值，用1000引导指令样刺激用于评估假设无关情况下的最大卡方统计量分布。(Halpern，Biometrics381017-1023，1982)。显著性水平被定为p＜0.05。
人群统计和可以用于反应和存活评估的患者在此研究中评估了由14名(28％)女性和36名(73％)男性组成的总共50名患者，平均年龄为59岁(最小34岁，最大83岁)。该组的种族背景包括39名高加索人，6名西班牙人，3名亚洲人和2名美国黑人。所有50名患者都可以评估TS表达和ERCC1表达与存活之间的关联。45名(90％)可以经评估而检验该分子参数与高于引用标准的反应之间的关联。
TS表达水平和ERCC1表达水平总mRNA是从显微解剖的FPE预处理肿瘤样品中分离的，用定量RT-PCR测量ERCC1β-肌动蛋白和/或TSβ-肌动蛋白的相对mRNA表达水平。从样品中分离mRNA的方法描述于实施例1中和1999年12月20日提交的美国专利申请US09/469,338中的描述，在此全文引入此处作为参考。采用基于逆转录/聚合酶链式反应(RT/PCR)的测定系统确定ERCC1和β-肌动蛋白的表达水平，如实施例2中所描述。分别按实施例3和4的描述确定校正的相对ERCC1和/或TS表达。
在分析的所有50个样品中，TS基因表达都是可检测的。相对于管家基因β-肌动蛋白的中值校正TS表达为3.4×10-3(最小0.18×10-3，最大11.5×10-3)。在分析的47个(94％)样品中可以检测校正的ERCC1基因表达。中值校正ERCC1基因表达为2.53×10-3(最小0.00，最大14.61×10-3)。当通过性别、年龄和种族起源进行分析时，没有发现校正的TS和ERCC1 mRNA表达之间有显著差异。
与TS表达相关的存活在该研究中分析的50名患者中，中值随访期为10.5个月(95％C.I.1.8，21.2)，其中中值存活为8.4个月(95％C.I.6.4，12.3)。使用7.5×10-3的TS域值时，43名(86％)患者具有低校正TS表达水平，7名(14％)患者具有高校正TS表达水平。用对数秩检验评估校正的TS基因表达和存活之间的关联。代表性存活曲线表示于图1，该图表示，在低校正TS表达组中，中值存活为10.2个月(95％ C.I.7.4，15.1)，在高校正TS表达组中，中值存活为1.5个月(95％ C.I.1.1，2.1)(P＜0.001；对数秩检验)。校正的TS表达≤7.5×10-3的患者6个月时的存活概率为0.77，高表达组为0.00。在单变量分析中，校正的TS表达＞7.5×10-3的患者与校正的TS表达≤7.5×10-3的患者相比，死亡的相对危险性增加了8.4(95％ C.I.2.63，27.13)倍(P＜0.001，图4)。
与ERCC1表达相关的存活使用4.9×10-3为域值，40名(80％)患者具有低校正ERCC1表达水平，10名(20％)患者具有高校正ERCC1水平。图2表示用估计的存活概率对校正的ERCC1表达水平所作的Kaplan Meier图，并且表示出，在低表达组中，中值存活为10.2个月(95％C.I.7.8，15.1)，在高表达组中为1.9个月(9 5％ C.I.1.1，4.9)(P＜0.001；对数秩检验)。校正的ERCC1表达≤4.9×10-3的患者6个月时的存活概率为0.76，校正的ERCC1表达＞4.9×10-3的患者为0.16。在单变量分析中，校正的ERCC1表达＞4.9×10-3的患者与校正的ERCC1表达≤4.9×10-3的患者相比，死亡的相对危险性增加了4.8(95％C.I.2.09，15.88)倍(P＜0.001，图4)。
与联合的ERCC1和TS表达相关的存活在36名(72％)患者中检测到了低校正TS和ERCC1表达水平，14名(28％)具有高校正TS和ERCC1表达水平。两种基因都具有低表达水平的患者具有显著更佳的存活。低校正TS和ERCC1表达者的中值存活为11.1个月(95％ C.I.8.4，17.5)，高校正TS和/或ERCC1表达者的中值存活为1.9个月(95％ C.I.1.1，4.9)(P＜0.001；对数秩检验，图3)。两种基因都具有低校正表达水平的患者6个月时的存活概率为0.85，对至少一种基因，TS或ERCC1具有高校正表达水平的患者为0.10。至少一种基因(TS或ERCC1)的校正表达水平增加的患者与肿瘤中两种基因的表达水平都低的患者相比的相对死亡危险性为7.12(95％C.I.2.60，19.52)(P＜0.001；图4)。通过分层分析表明，TS和ERCC1 mRNA表达是彼此独立的。
反应与TS和ERCC1基因表达水平的关联45名可测量患者的中值校正TS表达为3.4×10-3(最小0.18×10-3；最大11.50×10-3)，与整个50名患者的队列相同。当通过将肿瘤分为低和高TS表达者分析反应时，3/4(75％)部分反应者，26/27(96％)的稳定疾病患者，和9/14(64％)的进展性疾病患者具有低校正TS表达(P＝0.02；Fisher精确检验，图9)。
45名可测量患者的中值校正ERCC1表达为2.7×10-3(最小0.00；最大14.61×10-3)，与整个50名患者的队列无显著差异。然而ERCC1表达水平与对化疗的反应没有统计学上显著的相关性(P＝0.29；Fisher精确检验)。
序列表<110>K.D.达南伯格等<120>基于ERCC1和TS表达确定化疗方案的方法<130>11220-119<140>待定<141>2001-03-09<160>11<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>1gggaatttgg cgacgtaatt c 21<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>2gcggaggctg aggaacga 18<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>3ggcctcggtg tgccttt 17<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>4
gatgtgcgca atcatgtacg t21<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸探针<400>5cacaggtgct ctggcccagc acata 25<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>6aacatcgcca gctacgccct gc 22<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸探针<400>7accaccacgg ccgagcgg 18<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸探针<400>8tgagcgcggc tacagctt 18<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>9tccttaatgt cacgcacgat tt 22<210>10
<211>1097<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>10aagtgctgcg agccctgggc cacgctggcc gtgctggcag tgggccgcct cgatccctct 60gcagtctttc ccttgaggct ccaagaccag caggtgaggc ctcgcggcgc tgaaaccgtg 120aggcccggac cacaggctcc agatggaccc tgggaaggac aaagaggggg tgccccagcc 180ctcagggccg ccagcaagga agaaatttgt gatacccctc gacgaggatg aggtccctcc 240tggagtggcc aagcccttat tccgatctac acagagcctt cccactgtgg acacctcggc 300ccaggcggcc cctcagacct acgccgaata tgccatctca cagcctctgg aaggggctgg 360ggccacgtgc cccacagggt cagagcccct ggcaggagag acgcccaacc aggccctgaa 420acccggggca aaatccaaca gcatcattgt gagccctcgg cagaggggca atcccgtact 480gaagttcgtg cgcaatgtgc cctgggaatt tggcgacgta attcccgact atgtgctggg 540ccagagcacc tgtgccctgt tcctcagcct ccgctaccac aacctgcacc cagactacat 600ccatgggcgg ctgcagagcc tggggaagaa cttcgccttg cgggtcctgc ttgtccaggt 660ggatgtgaaa gatccccagc aggccctcaa ggagctggct aagatgtgta tcctggccga 720ctgcacattg atcctcgcct ggagccccga ggaagctggg cggtacctgg agacctacaa 780ggcctatgag cagaaaccag cggacctcct gatggagaag ctagagcagg acttcgtctc 840ccgggtgact gaatgtctga ccaccgtgaa gtcagtcaac aaaacggaca gtcagaccct 900cctgaccaca tttggatctc tggaacagct catcgccgca tcaagagaag atctggcctt 960atgcccaggc ctgggccctc agaaagcccg gaggctgttt gatgtcctgc acgagccctt 1020cttgaaagta ccctgatgac cccagctgcc aaggaaaccc ccagtgtaat aataaatcgt 1080cctcccaggc caggctc1097<210>11<211>1536<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>11gggggggggg ggaccacttg gcctgcctcc gtcccgccgc gccacttggc ctgcctccgt 60cccgccgcgc cacttcgcct gcctccgtcc cccgcccgcc gcgccatgcc tgtggccggc 120tcggagctgc cgcgccggcc cttgcccccc gccgcacagg agcgggacgc cgagccgcgt 180ccgccgcacg gggagctgca gtacctgggg cagatccaac acatcctccg ctgcggcgtc 240aggaaggacg accgcacggg caccggcacc ctgtcggtat tcggcatgca ggcgcgctac 300agcctgagag atgaattccc tctgctgaca accaaacgtg tgttctggaa gggtgttttg 360gaggagttgc tgtggtttat caagggatcc acaaatgcta aagagctgtc ttccaaggga 420gtgaaaatct gggatgccaa tggatcccga gactttttgg acagcctggg attctccacc 480agagaagaag gggacttggg cccagtttat ggcttccagt ggaggcattt tggggcagaa 540tacagagata tggaatcaga ttattcagga cagggagttg accaactgca aagagtgatt 600gacaccatca aaaccaaccc tgacgacaga agaatcatca tgtgcgcttg gaatccaaga 660gatcttcctc tgatggcgct gcctccatgc catgccctct gccagttcta tgtggtgaac 720agtgagctgt cctgccagct gtaccagaga tcgggagaca tgggcctcgg tgtgcctttc 780aacatcgcca gctacgccct gctcacgtac atgattgcgc acatcacggg cctgaagcca 840ggtgacttta tacacacttt gggagatgca catatttacc tgaatcacat cgagccactg 900aaaattcagc ttcagcgaga acccagacct ttcccaaagc tcaggattct tcgaaaagtt 960gagaaaattg atgacttcaa agctgaagac tttcagattg aagggtacaa tccgcatcca 1020actattaaaa tggaaatggc tgtttagggt gctttcaaag gagcttgaag gatattgtca 1080gtctttaggg gttgggctgg atgccgaggt aaaagttctt tttgctctaa aagaaaaagg 1140aactaggtca aaaatctgtc cgtgacctat cagttattaa tttttaagga tgttgccact 1200ggcaaatgta actgtgccag ttctttccat aataaaaggc tttgagttaa ctcactgagg 1260gtatctgaca atgctgaggt tatgaacaaa gtgaggagaa tgaaatgtat gtgctcttag 1320caaaaacatg tatgtgcatt tcaatcccac gtacttataa agaaggttgg tgaatttcac 1380aagctatttt tggaatattt ttagaatatt ttaagaattt cacaagctat tccctcaaat 1440ctgagggagc tgagtaacac catcgatcat gatgtagagt gtggttatga actttatagt 1500tgttttatat gttgctataa taaagaagtg ttctgc 153权利要求
1.一种测定固定且石蜡包埋的组织样品中ERCC1表达水平的方法，包括(a)将组织样品脱石蜡，获得脱石蜡的样品；(b)在存在有效量离液剂的条件下，通过首先将含有有效浓度离液化合物的溶液中的组织样品加热至大约50℃-100℃，加热约5-120分钟，并且回收离液溶液中的所述mRNA，分离脱石蜡样品的mRNA；(c)使用在严格条件下与ERCC1基因的一个区杂交的寡核苷酸引物对扩增mRNA，获得扩增样品；(d)测定相对于内部对照基因mRNA量的ERCC1 mRNA量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸引物对由IDNO1和SEQ ID NO2或与其具有至少80％同一性的寡核苷酸引物对组成。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述内部对照基因是β-肌动蛋白。
4.根据权利要求1所述的方法，其中加热是在大约75℃-100℃下进行约5-120分钟。
全文摘要
本发明涉及基于ERCC1和TS表达确定化疗方案的方法。本发明涉及用于医学，特别是癌症化疗中的预测方法。本发明目的是提供一种通过检测患者肿瘤细胞中TS和/或ERCC1mRNA的量，并把它与这些基因的预定阈表达水平进行比较，从而评价固定或固定且石蜡包埋的组织中TS和/或ERCC1的表达水平，并预测患者肿瘤对基于5－FU和奥沙利铂的治疗的可能抗性的方法。更特别是，本发明提供寡核苷酸引物对ERCC1和TS，及使用它们分别检测ERCC1和TS mRNA水平的方法。
文档编号C12Q1/68GK101086024SQ20071012714
公开日2007年12月12日 申请日期2001年11月9日 优先权日2000年12月1日 公开号200710127143.9
发明者K·D·达南伯格 申请人:应答遗传公司