本发明涉及免疫学领域，具体涉及免疫治疗领域，尤其涉及一种靶向egfrvⅲ的car-t细胞的制备方法及其应用。
背景技术
egfr(epidermalgrowthfactorreceptor)是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，是原癌基因c-erb-1(her-1)编码表达的产物，分子量170kda，egfr位于细胞膜表面，靠与配体结合来激活，是上皮生长因子(egf)细胞增殖和信号传导的受体，egfr与其相应配体结合并活化，作为信号转导复合物，进而激活下游信号转导通路引起一系列细胞反应：促进信号传导和细胞生长分化、加速细胞周期进行及促进血管形成，促进肿瘤的生长和转移。
许多恶性肿瘤均呈现egfr过表达，egfr与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关，其通路的失调会导致多种人类上皮恶性肿瘤的发生，造成egfr通路失调的原因包括egfr的过表达，以及自身突变产生的持续激活。egfrvⅲ(表皮生长因子受体ⅲ型突变体)是表皮生长因子受体(egfr)最常见的突变体形式，这种突变型缺失了正常egfr第2到第7个外显子之间801个碱基对，而1和8外显子直接连接，且在连接处形成了一个新的甘氨酸，较egfr野生型来说，egfrvⅲ缺失了胞外段的6-273号氨基酸残基，即egfr的配体结合区，其本身不和配体结合，即可产生持续的磷酸化，使受体产生持续的刺激信号，导致了egfr通路的过度激活，egfrviii能提高肿瘤细胞致瘤性，促进肿瘤细胞增殖，抑制凋亡，以及改变细胞形态、提高细胞活力，降低细胞粘附性，使肿瘤细胞更具侵袭性。egfrviii是一种新型的肿瘤特异性靶点，除了广泛存在于胶质瘤外，在乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和前列腺癌等均有发现。
car-t则是一种通过把患者自己的防御细胞(t细胞)取出来，人工(依靠基因技术)加上一种能够识别癌症细胞的部件(癌细胞识别抗原受体)，并大量复制，再给回患者，从而激发患者自身防御细胞的杀伤功能杀死癌症细胞。car分子主要包括胞外抗原结合区(singlechainantibodyfragment，scfv)，用以识别肿瘤表面特定蛋白、跨膜区和胞内信号区。
如中国专利cn201610994507.2公开了一种自体car-t细胞制备方法及其应用，该发明将构建的cd28-cd137-cd19-cd3全长基因，用crispr/cas9技术导入到患者t细胞制作成car-t细胞，然后经过体外扩增后，回输到患者体内进行抗肿瘤治疗，与传统肿瘤治疗方法相比，该方法为细胞靶向性治疗，副作用小，而且经过基因修饰的t细胞可在其表面稳定的表达抗原结合域，识别靶抗原的同时，无mhc限制性，提高了肿瘤的治疗效果。
再如中国专利cn201710217134.2公开了一种靶向治疗血液恶性肿瘤的car-t细胞的研究方法，包括以下步骤：构建cd19、cd20、cd33嵌合体抗原受体修饰的t细胞即car-t；建立gmp条件下的car-t构建和car-t细胞大规模制备工艺体系；建立car-t系统的安全性评价体系；筛选符合治疗适应症的患者；临床试验研究，该发明将比较基于转座子和转座酶的非病毒car-t技术在临床上的效果，为临床上推广更安全、成本低。
虽然car-t在治疗白血病、淋巴瘤方面卓有成效，但在对实体瘤的临床治疗效果普遍不尽人意，在众多的临床实验中，car-t暴露出很多包括增殖及持久能力有限、肿瘤滤过能力差、在肿瘤微环境中被抑制等问题，其中对于细胞如何在抑制性的肿瘤微环境保持其在体外的增殖与持续能力，继续发挥其杀伤与分泌功能尤为重要，而考虑如何利用car-t以及其他治疗手段比如抗体、疫苗等相结合，改善局部微环境，破坏肿瘤固有结构成为研究的热点之一。
本发明采用来源于鳞翅目昆虫的piggybac转座子，在哺乳动物宿主中活性较高，而且携带片段较大。另外，采用质粒系统，制备工艺相对简单，通过转座酶将外源基因整合入基因组，操作简单而且整合效率相对较高，重要的是，相对于逆转录病毒系统更安全，而egfrviii只在肿瘤细胞中出现，在正常组织细胞不表达，这使egfrviii成为一个很好的肿瘤治疗的靶标，因此选择egfrvⅲ蛋白作为靶抗原的car-t免疫治疗可能比其他car-t细胞治疗有较少的副作用。
技术实现要素：
一方面，本发明提供了一种靶向egfrvⅲ的car-t细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备pbmc细胞、含egfrvⅲ基因scfv序列的质粒，将含egfrvⅲ基因scfv序列的质粒以及与egfrvⅲ配合使用的转座酶质粒共转染pbmc细胞后，得到转染后的pbmc细胞，该转染后的pbmc细胞的基因组上整合了egfrvⅲ基因scfv序列；
(2)采用cd3抗体作为t细胞活化剂并培养扩增转染后pbmc细胞，获得靶向egfrvⅲ的car-t细胞，该car-t细胞的基因组上整合了egfrvⅲ基因scfv序列。
上述方法中，准备含egfrvⅲ基因scfv序列的质粒包括：准备egfrvⅲ嵌合抗原受体(在本发明中命名为egfrvⅲcar)，也就是egfrvⅲ基因scfv序列。
含egfrvⅲ基因scfv序列的质粒在本发明中被命名为pb-egfrvⅲ-car-bbz-puro质粒或egfrvⅲcar质粒，该质粒含有egfrvⅲ基因scfv序列，该egfrvⅲ基因scfv序列可以为对野生型序列进行密码子优化后的序列，密码子优化后地序列为seqidno.1所示的核苷酸序列。
进一步地，所述的转座酶质粒具体为转座酶质粒transposase。
进一步地，所述的egfrvⅲcar利用piggybac转座子系统在piggybac-transposon载体依次串联人ef1α启动子、信号肽、胞膜外抗原结合区、铰链区、胞内信号传导区和t2a短肽连接的抗性基因puromycin制备而成的。
进一步地，所述胞膜外抗原结合区为经过密码子优化的，可结合egfrvⅲ蛋白的egfrvⅲ单链抗体，依次串联c-myc表位标记、cd8hinge嵌合受体铰链、cd8transmembrane嵌合受体跨膜区。
进一步地，所述胞内信号传导区优选为cd28-4-1bb-cd3ζ，cd28和4-1bb为嵌合受体共刺激分子，可介导外源基因在宿主细胞内高效整合，并高效稳定表达。
进一步地，所述的pb-egfrvⅲ-car-bbz-puro质粒的序列为seqidno.2所示的核苷酸序列。
进一步地，所述的将含egfrvⅲ基因scfv序列的质粒以及与egfrvⅲ配合使用的转座酶质粒共转染pbmc细胞具体为：将准备的egfrvⅲcar质粒及其转座酶质粒与电转试剂混合，加入准备的pbmc细胞中进行电转染。
进一步地，所述的采用cd3抗体作为t细胞活化剂并培养扩增转染后pbmc细胞具体为：采用cd3抗体刺激t细胞，辅以嘌呤霉素筛选，并培养扩增转染后的t细胞以获得靶向egfrvⅲ的car-t细胞。
进一步地，所述的准备pbmc细胞包括：(1)用抗凝管采集外周血，边采集边摇晃使外周血与抗凝剂充分混合，并用磷酸盐缓冲液pbs1：1稀释；(2)外周血稀释液与淋巴细胞分离液等体积混合，慢升慢降离心，吸取离心后的白膜层细胞；(3)将得到的白膜层细胞与pbs或者无血清细胞培养基(例如rpmi1640)混合后离心，继续用pbs或1640清洗三遍，沉淀后获得pbmc细胞。
进一步地，所述的转染使用电转染系统，包括
pbmc细胞准备系统；
amaxa电转染试剂盒；
电转染系统，接收来自amaxa电转试剂盒的电转染试剂并将其与egfrvⅲcar质粒及其转座酶质粒混合后形成混合物；并接收来自pbmc细胞准备系统的pbmc细胞且在其中加入所述混合物进行电穿孔转染；
进一步地，所述步骤5中cd3抗体筛选；以及嘌呤霉素筛培系统，用于筛选并培养扩增转染后的t细胞以靶向egfrvⅲ的car-t细胞。
本发明的又一目的是提供一种根据上述方法获得的分离的t细胞、细胞系或其次代培养物。
进一步地，还可以对所述的靶向egfrvⅲ的car-t细胞进行改造，使之具备相应功能：
所述的改造包括步骤：制备靶向egfrvⅲ的且敲除pd-1基因的car-t细胞；
或：制备靶向egfrvⅲ的且分泌il-12的car-t细胞；
或：制备靶向egfrvⅲ的且分泌anti-pd1的car-t细胞。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明选用piggybac转座子系统提高了转染效率和转基因的表达效率和时间，简化car-t的制备程序，增强了系统的负载量。
(2)本发明采用质粒系统，制备工艺相对简单，通过转座酶将外源基因转入整合入基因组，操作简单而且整合效率相对较高。
(3)相对于逆转录病毒系统更安全，而egfrvⅲ只在肿瘤细胞中出现，在正常组织细胞不表达，这使egfrviii成为一个很好的肿瘤治疗的靶标，因此选择egfrvⅲ蛋白作为靶抗原的car-t免疫治疗可能比其他car-t细胞治疗有较少的副作用。
附图说明
图1为实施例2中pb-egfrvⅲcar-bbz-puro的环形质粒图谱。
图2为实施例2中pb-egfrvⅲcar-bbz-puro的线性载体图谱；
图3为实施例5中可分泌il12的pb-egfrvⅲcar-bbz-puro-ires-il2的载体图谱；
图4为实施例6中可分泌anti-pd1抗体的pb-egfrvⅲcar–bbz–puro–ires-anti-pd1的载体图谱；
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明做进一步的说明，具体说明发明的实施例不应解释为限制本分明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。
实施例1密码子优化
(1)准备egfrvⅲ嵌合抗原受体(car)，即139car，对scfv片段送交公司进行密码子优化，使之更易于在人体细胞内表达，密码子优化后地序列为seqidno.1所示的核苷酸序列。
(2)合成目的片段，后替换139car中的scfv片段，制作如附图1所示的pb-egfrvⅲ-car-bbz-puro的环形质粒图谱和附图2所示的pb-egfrvⅲ-car-bbz-puro的线性载体图谱。
实施例2pbmc细胞制备
取人外周血15ml，抗凝(eata或肝素)处理，室温15分钟，室温350*g离心5分钟，吸出血浆待用；
血细胞中加入1倍体积pbsbuffer稀释混匀，取15ml离心管，加入5ml淋巴细胞分离液ficoll，于上层缓慢加入5ml稀释血细胞，此步骤必须缓慢，防止ficoll与血细胞混合。
慢升慢降，室温450*g离心25分钟，血细胞从上至下依次分成血小板层，白细胞层(白膜)，聚蔗糖(ficoll)层及红细胞层，吸取血小板层(2ml)，将白细胞层(白膜层，约3ml)转移至新的15ml离心管中。
加入10mlpbsbuffer，300*g离心10分钟，弃上清，沉淀重悬于10mlpbsbuffer中，170*g离心10分钟后弃上清，将沉淀重悬于10mlpbsbuffer中，细胞计数后300*g离心10分钟后再弃上清，调整细胞密度至每毫升2×107个细胞。
实施例3靶向egfrvⅲ的car-t细胞的制备
(1)、将pbmc用含10％fbs的rpmi1640培养基稍加培养1个小时后，300*g离心8分钟，完全去上清；配置电转体系：将质粒pb-egfrvⅲcar-bbz-puro(序列为seqidno.2所示的核苷酸序列)5μg、转座酶质粒transposase(可采用
http://www.biofeng.com/zaiti/buru/super-piggybac-transposase.html公开的transposase)5μg、82μl电转缓冲液和18μlsupplement1混匀；
(2)、将步骤(1)配好的质粒电转缓冲液混合物重悬细胞，并转移至电转杯中，使用仪器lonza2b，u-014程序进行电转，电转后的细胞迅速转移至提前预热的培养基中，37℃培养箱培养两个小时，以5μg/ml的dnase1消化，清除电转中死细胞释放的dna；30分钟后，对细胞计数并换液，用含300iu/mlil-2、10％fbs的aim-v培养基(完全培养基)培养在24孔板中，其中每孔2ml，细胞培养密度为1.5×106个/ml；
(3)电转24小时后加入cd3抗体至终浓度为50ng/ml，继续培养，每隔一天补加300iu/mlil-2，培养15天即得到靶向egfrvⅲ的car-t细胞；该细胞经质检符合临床要求后即可输给egfrviii阳性肿瘤患者。
实施例4利用单碱基敲除系统制备靶向egfrvⅲ的且敲除pd-1基因的car-t细胞
基于be3介导的单碱基编辑的精确性和特异性，设计基因敲除策略：通过ct突变引入终止密码子，例如将caa、cag、cga突变成终止密码子taa、tag、tga，终止编码基因的翻译，从而实现基因敲除。be3为携带apobec1酶的cas9融合蛋白。质粒为xcas9(3.7)-be3，以下简称cas9质粒(可采用http://www.addgene.org/108380/公开的cas9质粒)。
选定待敲除基因pd1的编码区(cds区)的20bp–ngg目标序列(pam序列)，使其包含完整的目标密码子caa、cag或cga；
其中目标单碱基c位于目标序列的(左端)第4位，目标密码子与ngg间隔14bp，并且目标密码子的上游紧邻碱基(h)不能为g；所述sgrna序列为与目标序列互补对应的20bp序列；
选择sgrna为ctacaactgggctggcggccagg(caa为目标密码子，agg为pam序列)。
合成5’-accg-ctacaactgggctggcggccagg和
5’-aaac-cctggccgccagcccagttgtag，并退火，使之结合成双链黏性末端产物，导入经bsaⅰ酶切的pgl3-u6-sgrna质粒(本领域技术人员可通过网络检索得到其序列，如http://www.youbio.cn/product/vt8203)，制备质粒pgl3-hpd1sg：
(1)、将pbmc用含10％fbs的rpmi1640培养基培养1小时后，300*g离心8分钟，完全去上清；将pgl3-hpd1sg、cas9质粒、pb-egfrvⅲcar-bbz-puro质粒和转座酶transposase四个质粒各5μg，82μl电转缓冲液和18μlsupplement1混匀得质粒电转缓冲液混合物；
(2)、将步骤(1)配好的质粒电转缓冲液混合物重悬pbmc细胞，并转移至电转杯中，使用仪器lonza2b，u-014程序进行电转，电转后的细胞迅速转移至提前预热的培养基中，37℃培养箱培养两个小时，以5μg/ml的dnase1消化清除电转中死细胞释放的dna；
(3)、30分钟后，将细胞计数并换液，用含300iu/mlil-2、10％fbs的aim-v培养基(完全培养基)培养在24孔板中，其中每孔2ml，细胞培养密度为1.5×106个/ml；
(4)、电转24小时后加入cd3抗体至终浓度50ng/ml，继续培养，每隔一天补加300iu/mlil-2，培养15天后即可得到利用单碱基敲除系统制备靶向egfrvⅲ的且敲除pd-1基因的car-t细胞；
(5)、提取步骤(4)制得的car-t细胞基因组dna，并用提前设计好的检测on-target引物进行pcr扩增目的片段，纯化回收；使用t7en1酶切检测突变体，3％的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切，并将pcr产物连接进t载体中，转化进dh5α细菌，随机挑取21个单菌落进行测序，评估目标片段被切割后切割效率；该细胞经质检符合临床要求后即可输给egfrviii阳性肿瘤患者。
实施例5制备靶向egfrvⅲ的且分泌il-12的car-t细胞
采用piggybac转座子系统，构建如说明书附图3所示的pb-egfrvⅲcar-bbz-puro-ires-il12质粒。该质粒为在pb-egfrviiicar-bbz-puro质粒中插入ires-il12序列构建而成，并将其与转座酶质粒混合，宿主细胞为pbmc细胞；
ires为内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite)，其中il12序列如seqidno.3所示的核苷酸序列。
将pb-egfrvⅲcar-bbz-puro-ires-il12质粒与转座酶transposase质粒混合，宿主细胞为pbmc细胞；
(1)、选择pb-egfrvⅲcar-bbz-puro-ires-il12和转座酶transposase质粒各5μg，并按照lonzaamaxa电转试剂盒说明书要求，加入82μl电转缓冲液和18μlsupplement1混匀，其中原始质粒pb-egfrvⅲcar-bbz-puro和转座酶质粒作为对照。
(2)、以配好的质粒电转缓冲液混合物重悬细胞，并转移至电转杯中，使用仪器lonza2b，u-014程序进行电转，电转后的细胞迅速转移至提前预热的培养基中，37摄氏度培养箱培养两个小时，以5μg/ml的dnase1消化清除电转中死细胞释放的dna；
(3)、30分钟后，将细胞计数并换液，用含300iu/mlil-2、10％fbs的aim-v培养基(完全培养基)培养在24孔板中，其中每孔2ml，细胞培养密度为1.5×106个/ml；
(4)、电转24小时后加入cd3抗体至终浓度50ng/ml，继续培养，每隔一天补加il-2，培养15天后即可得到靶向egfrvⅲ的且分泌il-12的car-t细胞；该细胞经质检符合临床要求后即可输给egfrviii阳性肿瘤患者。
实施例6制备靶向egfrvⅲ的且分泌anti-pd1的car-t细胞。
构建如说明书附图4所示的pb-egfrvⅲcar-bbz-puro-ires-anti-pd1质粒，用以靶向egfrvⅲ的同时，组合分泌anti-pd1抗体；
其中，pb-egfrvⅲcar-bbz-puro-ires-anti-pd1质粒为在pb-egfrviiicar-bbz-puro质粒中插入ires-anti-pd1序列构建而成，并将其与转座酶质粒混合，宿主细胞为pbmc细胞；
所述的ires为内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite)，其中anti-pd1序列为seqidno.4所示的核苷酸序列。
(1)、选择pb-egfrvⅲcar-bbz-puro-ires-anti-pd1和转座酶transposase质粒各5μg，并按照lonzaamaxa电转试剂盒说明书要求，加入82μl电转缓冲液和18μlsupplement1混匀，其中原始质粒pb-egfrvⅲcar-bbz-puro和转座酶质粒作为对照。
(2)、以配好的质粒电转缓冲液混合物重悬细胞，并转移至电转杯中，使用仪器lonza2b，u-014程序进行电转，电转后的细胞迅速转移至提前预热的培养基中，37摄氏度培养箱培养两个小时，以5μg/ml的dnase1消化、清除电转中死细胞释放的dna；
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序列表
<110>苏州茂行生物科技有限公司
<120>一种靶向egfrviii的car-t细胞的制备方法及应用
<130>200180710
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>726
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>1
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