本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种重组tn5转座酶的表达纯化方法。
背景技术
转座子是基因组中能发生移动和自主复制的dna片段，随着人们在分子水平上对转座子结果和功能认识的不断深化，许多转座子已被改造为遗传分析的工具应用于基因功能分析、基因转化和基因治疗。而转座酶是实现转座子功能一个重要因素，由于天然的转座酶活性低且表达量少，导致转座子的转座能力不高。
tn5转座酶是转座酶系列中一种应用于二代测序高通量建库的重要工具。野生型的tn5转座酶的表达量低，且活性低，对二代测序的开发和利用造成障碍。近几年来，科学家们运用生物信息学和蛋白质工程相结合的方法来构建活性高的转座酶，通过蛋白质融合技术构建转座酶的嵌合体，显著提高了转座酶的活性。
在现有的tn5转座酶表达纯化的方法中，常出现纯化后的tn5酶有降解和杂蛋白的现象，同时获取的tn5转座酶酶量低，蛋白构象错误，酶活低等不良结果。使得通过氨基酸优化后转座酶在实际生产和运用上与理论存在显著差距。
技术实现要素：
本发明提供一种重组tn5转座酶的纯化方法。纯化出的tn5转座酶纯度高，并且无蛋白条带降解的情况发生。
为实现上述目的，本发明提供一种tn5转座酶的表达纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备含有tn5转座酶的重组载体；该重组载体还带有streptagii和sumotag标签；
诱导表达；
纯化：利用streptagii和sumotag标签对融合蛋白进行纯化，获得高纯度的tn5酶蛋白。
进一步，所述streptagii的序列为seqidno:5；sumotag标签的序列为seqidno:6；所述tn5转座酶的序列为seqidno:7。
进一步，所述诱导表达的诱导培养基为重量体积百分比的1％蛋白胨；重量体积百分比的0.5％酵母提取物；体积百分比的0.5％甘油；重量体积百分比的0.5％乳糖；重量体积百分比的0.05％葡萄糖；重量体积百分比的0.05％mgso4·7h2o；6.25mmol/lkh2po4；31mmol/lk2hpo4·3h2o；25mmol/l(nh4)2so4。
进一步，所述诱导表达的条件为30℃，250rpm摇菌过夜。
进一步，所述纯化包括裂解菌体，融合蛋白的提取，融合蛋白的切割和融合蛋白的纯化步骤。
进一步，所述裂解菌体步骤为，将诱导表达所得的菌液第一次离心收集菌体，用预冷的lysisbuffer充分重悬后，在冰水浴中超声破碎，再第二次离心，取上清过滤，滤液加入dnasei孵育即可；
优选的，第一次离心的条件为4000-45000rpm，4℃离心12-18min；
任选的，第二次离心的条件为800-1200rpm，4℃离心25-35min；
任选的，破碎的功率为30％，频率为5son/5soff，时间25-35min。
任选的，诱导表达所得的菌液：lysisbuffer的体积比为100:(30-40)，优选100:35。
任选的，所述滤液：dnasei的体积比为9000-11000，优选10000:1。
进一步，所述融合蛋白的提取步骤为，加入beaverbeadstmmagrosestrep-tactin颠倒混匀后，离心弃上清；再加入washbuffer洗涤后，离心，弃上清；可重复洗涤步骤1-2次；
再加入elutionbuffer洗脱，离心取上清；重复洗脱2-6次，收集所有洗脱液；用lysisbuffer透析。
进一步，所述融合蛋白的切割为，加入sumo蛋白酶进行酶切得到酶切产物。
进一步，所述融合蛋白的纯化为，加入beaverbeadstmmagrosestrep-tactin和nisepharose6ff后混匀离心取上清，再用tn5转座酶贮存液透析即可。
本发明通过申请人巧妙的设计，制备出含有tn5转座酶的重组载体，从而方便快捷的进行tn5转座酶纯化，纯化出的tn5转座酶纯度高，并且无蛋白条带降解的情况发生，依靠sumotag标签的特性，使tn5转座酶蛋白正确装配折叠。使tn5基因表达出高酶活产物，在纯化过程中促溶，提高tn5转座酶产量，同时依靠sumo蛋白酶对标签蛋白的酶切。获得与天然tn5转座酶同等纯度的产品。
本发明利用自诱导培养基减少了传统的iptg诱导过程，将扩菌过程和诱导过程相结合，表达过程更便利。通过streptagii标签的高分辨率，及sumotag标签的促溶促表达，并能作为分子伴侣的特点，在正确折叠tn5酶同时，能通过sumo蛋白水解酶将标签蛋白从融合蛋白上切割下来，经过亲和层析得到和天然蛋白一样的重组蛋白。提高tn5酶的纯化效果，保证功能活性。
本发明：
①在tn5转座酶表达基因前构建两个标签于pet22b载体上。
②由于是构建在pet22b载体上，所以可使用自诱导培养基进行菌落培养。简化培养操作、使菌体生长迅速、提高tn5表达量、降低培养成本。
③通过构建的streptagii标签特性，使tn5转座酶表达过程中，降低蛋白构象错误率。同时，依靠beaverbeadstmmagrosestrep-tactin对streptagii标签蛋白的高分辨率，提取出纯度较高的融合蛋白。
④通过sumo蛋白酶，对带有streptagii、sumotag标签蛋白和tn5酶的融合蛋白进行酶切、纯化，纯化出的tn5转座酶不存在标签蛋白，其构象和酶活不受标签蛋白影响，得到与天然tn5转座酶同等纯度的产品。使tn5酶在使用过程中，不同于一般法中tn5酶带有6×his标签蛋白，对蛋白构象及酶活造成影响，从而影响tn5酶的功能活性。
⑤纯化方式：一般法为通过6×his标签蛋白提取融合蛋白后，将融合蛋白洗脱下来进行定量稀释。而本发明的纯化法通过streptagii标签蛋白提取融合蛋白后，将融合蛋白洗脱下来，用sumo酶进行酶切，之后用按比例混合的beaverbeadstmmagrosestrep-tactin和nisepharose6ff，将两个标签蛋白和sumo酶从产物中剔除出来，得到高纯度tn5酶。
附图说明
图1是本发明pet22b-strep-sumo-tn5表达载体图谱。
图2是本发明和一般法对tn5转座酶表达纯化后的page-sds电泳结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例的seqidno:1-7均由厦门纽克泰生物技术有限公司合成。其中streptagii标签基因的序列如seqidno:5所示；sumotag标签基因的序列如seqidno:6所示；tn5转座酶基因的序列如seqidno:7所示。
kodpolymerase由日本东洋纺公司生产，货号为kod-101，dna聚合酶。
实施例1：pet22b-strep-sumo-tn5表达载体的构建
利用pcr技术对tn5转座酶基因进行扩增，以seqid：no：1和seqid：no：2为引物，在50μl反应体系(以人工合成的seqidno:7即tn5转座酶基因作为反应模板)中，以kodpolymerase(由日本东洋纺公司生产，货号kod-101为dna聚合酶)。扩增条件为94℃30s；94℃15s；58℃15s；74℃50s；74℃3min；共32个循环。得到pcr产物1。
回收上述步骤的pcr产物1，以1.5％(w/v)琼脂糖胶电泳，切下目的条带进行胶回收。
人工合成得到带有streptagii标签的目的片段(如seqid：no：5所示)。
利用pcr技术对sumotag标签基因进行扩增，以seqid：no：3、seqid：no：4为引物，在50μl反应体系中(以人工合成的seqidno:6即sumotag标签基因作为反应模板)，以kodpolymerase为dna聚合酶。扩增条件为94℃30s；94℃15s；58℃15s；74℃15s；74℃1min；共30个循环。得到pcr产物2。
回收上述步骤的pcr产物2，以1.5％(w/v)琼脂糖胶电泳，切下目的条带进行胶回收。
双酶切pet22b载体(购自淼灵质粒公司)，使用ndei和xhoi限制性内切酶各加10u对2μg的pet22b载体进行双酶切过夜后，跑1.5％(w/v)琼脂糖胶，切下目的条带进行胶回收，得到酶切产物3，并将回收产物转化dh5α感受态，涂板过夜，观察酶切情况。
使用gibson组装克隆试剂盒(由newenglandbiolabs公司生产，货号e5510s)，反应体系如下：25μlgibson组装预混液，600ngtn5转座酶基因pcr产物(即pcr产物1)、600ngstreptagii(即seqid：no：5所示序列)、600ngsumotag标签的目的片段(即pcr产物2)、300ng双酶切pet22b载体(即酶切产物3)，加水补足至50μl。50℃恒温孵育25min。插回冰上备用。
取100μldh5α感受态加入到上述gibson连接产物中，冰浴30min，42℃热激45s，插回冰上2min，加入150μl无抗lb培养基。37℃，220rpm，预摇45min后，在lb氨苄平板培养基上涂布倒置过夜。
挑取单克隆菌落，用10mllb氨苄培养基，37℃，220rpm摇菌10小时后。取1μl进行菌液pcr电泳检测正确的送去测序，测序正确的命名为pet22b-strep-sumo-tn5表达载体(图谱结构图见图1)。
其余菌液利用无内毒素质粒小提中量试剂盒(购自天根生化科技有限公司，货号dp118)提取pet22b-strep-sumo-tn5表达载体。
实施例2：pet22b-strep-sumo-tn5载体的表达纯化
pet22b-strep-sumo-tn5表达载体的菌株制备：取实施例1所得pet22b-strep-sumo-tn5表达载体100ng。加入到100μlde3感受态，冰浴30min，42℃热激45s，插回冰上2min，加入150μl无抗lb培养基。37℃，220rpm，预摇45min后，涂lb氨苄平板倒置过夜。
诱导表达：挑取上述单克隆菌落加入到100ml自诱导培养基(1％tryptone(w/v)；0.5％yeastextract(w/v)；0.5％glycerol(v/v)；0.5％lactose(w/v)；0.05％glucose(w/v)；0.05％mgso4·7h2o(w/v)；6.25mmol/lkh2po4；31mmol/lk2hpo4·3h2o；25mmol/l(nh4)2so4),30℃，250rpm摇菌过夜。
纯化：
①裂解菌体：取上述过夜的100ml菌液分装于两管50ml离心管中，4200rpm，4℃离心15min收集菌体。以下步骤都在冰上操作，将收集到的菌体用预冷的35mllysisbuffer(25mmtris-hcl(ph8.0)；50mmkcl；0.1mmdtt；20mm咪唑；10％甘油(v/v))充分重悬后，在冰水浴中超声破碎，功率为30％，频率为5son/5soff，时间30min。
然后再1000rpm，30min，4℃离心。取上清用0.22μm滤器过滤于50ml管中。加入万分之一体积的dnasei用混匀器4℃孵育3h。
②纯化：加入1mlbeaverbeadstmmagrosestrep-tactin(购买自苏州海狸生物医学工程有限公司，货号70808-5)用4℃混匀器颠倒混匀1h。500g，10min，4℃，soft离心，去上清。加入50mlwashbuffer(25mmtris-hcl(ph8.0)；50mmkcl；0.1mmdtt；20mm咪唑；10％甘油(v/v))洗涤5min后，500g，10min，4℃，soft离心，弃上清。再重复上述洗涤步骤一遍。
将上述洗涤所得的beaverbeadstmmagrosestrep-tactin分装于两管，每管500μl。每管加入1mlelutionbuffer(25mmtris-hcl(ph8.0)；50mmkcl；0.1mmdtt；300mm咪唑；10％甘油(v/v))洗脱，上下颠倒混匀30次，500g，2min，4℃，soft离心取上清。重复洗脱5次，收集所有洗脱液。用lysisbuffer透析过夜，换液一次。
回收透析袋中的产物，加入sumo蛋白酶(带有多聚his标签，购自索莱宝公司，货号p2070)进行酶切(1ml酶切体系：1000μg透析袋中产物蛋白；20μl10×sumoproteasebuffer；10u的sumo蛋白酶；ddh2o定容至1ml)，4℃酶切过夜得到酶切产物。
向上述酶切产物中加入1mlbeaverbeadstmmagrosestrep-tactin和200μlnisepharose6ff(购自索莱宝公司，货号p2010)后，用4℃混匀器颠倒混匀1h。再500g，10min，4℃，soft离心取上清。收集上清，用tn5转座酶贮存液(50mmtris-hcl(ph7.5)；0.1mnacl；0.1mmedta；1mmdithiothreitol；0.1％tritonx-100(v/v)；50％甘油(v/v))透析过夜。bca法测定上清蛋白浓度(bca蛋白质定量试剂盒购自天根生化技术有限公司，货号pa115)后，按需稀释，-80℃长期保存。
对比例：一般法表达纯化tn5转座酶
用slic方法构建tn5转座酶表达载体pet28b：：tnpa,将其转化到e.colibl21(de3)中，菌落pcr以及测序结果(厦门纽克泰生物技术有限公司)验证重组质粒pet28b：：tnpa构建成功。
含有质粒pet28b：：tnpa的bl(de3)单菌落经过夜培养后，转接培养液到100ml液体lb培养基中，37℃下菌体长大od600为0.6-0.8之间，0.4mmiptg、25℃诱导表达3小时。4℃下离心收集菌体、超声破碎细胞、离心获得含tn5转座酶的上清液。用含20mm咪唑的1mnacl-tegx(20mmtris-hcl，1mmedta，10％glycerol(v/v)，0.1％tritonx-100(v/v)，ph7.5)洗掉与镍柱非特异性结合的杂蛋白，用含有250mm咪唑的tegx(20mmtris-hcl，1mmedta，10％glycerol(v/v)，0.1％tritonx-100，ph7.5)将tn5转座酶洗脱下来，然后利用脱盐柱除去tn5转座酶中的咪唑等盐离子，将tn5转座酶溶解在含有0.1mmedta，0.1nacl,1mmdithiothreitol、0.1％tritonx-100的50mmtris-hcl(ph7.5)中，随后加入50％甘油，储存在-80℃。用bca法对tn5转座酶定量。
将实例2和对比例的tn5转座酶产物用bca法定量至10mg/ml后，各取5μl进行page-sds电泳，结果见图2。其中泳道1为蛋白标记，泳道2为实施例2的tn5转座酶产物，泳道3为对比例的tn5转座酶产物。由图2可以看出：本发明纯化出的tn5转座酶无明显降解及杂蛋白现象产生，纯度更高；一般法纯化出的tn5转座酶所含杂蛋白及降解情况明显。
最后说明的是，本领域的普通技术员应当理解，可以对该发明进行方案及条件修改和等同替换，而不脱离本发明的技术方案和技术路线，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
sequencelisting
<110>厦门生命互联科技有限公司
<120>一种重组tn5转座酶的表达纯化方法
<130>smhl-18009-cni
<160>7
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>49
<212>dna
<213>人工合成
<400>1
ggtggttccggtacaggaggtggatccatgattaccagtgcactgcatc49
<210>2
<211>50
<212>dna
<213>人工合成
<400>2
tcagtggtggtggtggtggtgctcgagctagcagattttaatgccctgcg50
<210>3
<211>45
<212>dna
<213>人工合成
<400>3
ctggtgccgcgcggcagcgctagcatgtcggactcagaagtcaat45
<210>4
<211>48
<212>dna
<213>人工合成
<400>4
aatcatggatccacctcctgtaccggaaccaccaatctgttctctgtg48
<210>5
<211>69
<212>dna
<213>人工合成
<400>5
atgggcagcagctggagccacccgcagttcgaaaaaggcagcggcctggtgccgcgcggc60
agcgctagc69
<210>6
<211>294
<212>dna
<213>人工合成
<400>6
atgtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtcaagcct60
gagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaagatcaaa120
aagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatg180
gactccttaagattcttgtacgacggtattagaattcaagctgatcagacccctgaagat240
ttggacatggaggataacgatattattgaggctcacagagaacagattggtggt294
<210>7
<211>1431
<212>dna
<213>人工合成
<400>7
atgattaccagtgcactgcatcgtgcggcggattgggcgaaaagcgtgttttctagtgct60
gcgctgggtgatccgcgtcgtaccgcgcgtctggtgaatgttgcggcgcaactggccaaa120
tatagcggcaaaagcattaccattagcagcgaaggcagcaaagccatgcaggaaggcgcg180
tatcgttttattcgtaatccgaacgtgagcgcggaagcgattcgtaaagcgggtgccatg240
cagaccgtgaaactggcccaggaatttccggaactgctggcaattgaagataccacctct300
ctgagctatcgtcatcaggtggcggaagaactgggcaaactgggtagcattcaggataaa360
agccgtggttggtgggtgcatagcgtgctgctgctggaagcgaccacctttcgtaccgtg420
ggcctgctgcatcaagaatggtggatgcgtccggatgatccggcggatgcggatgaaaaa480
gaaagcggcaaatggctggccgctgctgcaacttcgcgtctgagaatgggcagcatgatg540
agcaacgtgattgcggtgtgcgatcgtgaagcggatattcatgcgtatctgcaagataaa600
ctggcccataacgaacgttttgtggtgcgtagcaaacatccgcgtaaagatgtggaaagc660
ggcctgtatctgtatgatcacctgaaaaaccagccggaactgggcggctatcagattagc720
attccgcagaaaggcgtggtggataaacgtggcaaacgtaaaaaccgtccggcgcgtaaa780
gcgagcctgagcctgcgtagcggccgtattaccctgaaacagggcaacattaccctgaac840
gcggtgctggccgaagaaattaatccgccgaaaggcgaaaccccgctgaaatggctgctg900
ctgaccagcgagccggtggaaagtctggcccaagcgctgcgtgtgattgatatttatacc960
catcgttggcgcattgaagaatttcacaaagcgtggaaaacgggtgcgggtgcggaacgt1020
cagcgtatggaagaaccggataacctggaacgtatggtgagcattctgagctttgtggcg1080
gtgcgtctgctgcaactgcgtgaatcttttactccgccgcaagcactgcgtgcgcagggc1140
ctgctgaaagaagcggaacacgttgaaagccagagcgcggaaaccgtgctgaccccggat1200
gaatgccaactgctgggctatctggataaaggcaaacgcaaacgcaaagaaaaagcgggc1260
agcctgcaatgggcgtatatggcgattgcgcgtctgggcggctttatggatagcaaacgt1320
accggcattgcgagctggggtgcgctgtgggaaggttgggaagcgctgcaaagcaaactg1380
gatggctttctggccgcgaaagacctgatggcgcagggcattaaaatctgc1431