本发明属于分子生物学领域及基因工程领域，具体涉及一种抑制基因水平转移的方法。
背景技术：
近年来，由于人们对抗生素的滥用，催生出许多抗药性微生物，尤其是当能够对数种抗生素耐受的“超级细菌”的出现，不仅增大了医疗成本，而且使人们的健康受到了严重的威胁。微生物获得耐药性能力，主要是通过转化、接合和转导的方式从外界环境中吸收抗药性dna片段，进一步整合到自身基因组中或以质粒的形式终生携带。本发明提供了一种能降低外源dna转化效率的方法，期望能够为抑制抗药性细菌的出现提供一种新途径。技术实现要素：针对上述已有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供抑制基因水平转移的方法。采用该方法进行质粒的转化，具有能有效降低质粒转化效率，可有效解决抗药性细菌迅速蔓延的问题。为解决上述问题，本发明是这样实现的：一种抑制基因水平转移的方法，其包括：质粒转化步骤；上述质粒转化步骤包括：将目标外源质粒与loip基因敲除的感受态宿主细胞混合。loip基因位于大肠杆菌基因组的第3081913位-3082671位，其id为945173，由759个碱基构成，且该基因仅存在大肠杆菌中。其编码蛋白loip的id为np_417411.2，其一级结构由252个氨基酸组成；二级结构由64.68％α-螺旋、7.94％延伸链、5.16％β-转角和22.22％无规则卷曲组成。loip具有一个保守结构域，是一种金属肽酶，其优先切割phephe残基之间的目标。当细菌受到低渗透压的介质时，它被上调。本发明的研究首次发现，相较于野生型宿主细胞，将宿主细胞的loip基因敲除，可以提高其外源质粒的转化效率。基于该成果，在转化质粒的过程中，将目标外源质粒与loip基因敲除的感受态宿主细胞混合，进行转化，可以降低目标外源质粒的转化效率，抑制外源基因水平转移，对抵制抗药性微生物的迅速扩散有十分重要的意义。进一步地，在本发明的一些实施方案中，在质粒转化步骤之前，上述方法包括：loip基因敲除步骤；上述loip基因敲除步骤包括：将打靶片段与感受态的野生型宿主细胞混合；上述打靶片段的两端含有与loip基因同源的同源臂序列。需要说明的是，上述的基因敲除方法采用的同源重组的方式敲除loip基因，但在其他的一些实施例中，也可采用其他的基因敲除方式敲除loip基因，无论通过何种方式敲除loip基因例如完全敲除、部分敲除、甚至是通过rnai干扰载体抑制loip基因表达使其失活等方式，只要是在质粒的转化过程中使宿主细胞的loip基因不发挥其功能的方式均属于本发明的保护范围。进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述打靶片段还含有筛选标记基因。为了使被敲除loip基因的宿主细胞易于后续实验中被筛选出，在打靶片段中引入筛选标记基因是有利的。通过筛选标记基因可以方便操作者筛选出阳性重组子。筛选标记基因的类型可以根据具体需求选择，例如包括但不限于抗生素抗性基因、荧光筛选标记基因等。进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述筛选标记基因为抗生素抗性基因。进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述抗生素抗性基因选自卡那霉素抗性基因(nptii)、四环素抗性基因(tetr)、氯霉素抗性基因(cat)、氨苄青霉素抗性基因(ampr)和潮霉素抗性基因(hpt)。进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述打靶片段的碱基序列如seqidno.1所示。以seqidno.1所示转入野生型宿主细胞，可以有效地将loip基因敲除，具有较高的成功率，且引入了卡那霉素抗性基因，阳性重组子可在含卡那霉素的平板上生存，进而被筛选出。为同源臂序列；____为frt位点；为kan片段序列。进一步地，在本发明的一些实施方案中，在loip基因敲除步骤之前，上述方法还包括：打靶片段扩增步骤；上述打靶片段扩增步骤包括：以含有卡那霉素抗性基因的质粒为模板，以seqidno.2所示的上游引物和seqidno.3所示的下游引物进行pcr扩增。进一步地，在本发明的一些实施方案中，在loip基因敲除步骤之后，上述方法还包括：阳性重组子筛选步骤和筛选标记基因去除步骤；上述阳性重组子筛选步骤包括：用检测筛选标记基因的引物鉴定出阳性重组子；上述鉴定出的阳性重组子还含有筛选标记基因，需要通过后续步骤删除。上述筛选标记基因去除步骤包括：将可编码重组蛋白flp的质粒导入上述阳性重组子以删除筛选标记基因。该步骤可将上述的阳性重组子中的筛选标记基因删除，得到不含筛选标记基因且loip基因被敲除的可用作宿主细胞的突变体。避免筛选标记基因对突变体作为宿主细胞时带来的干扰等影响。重组蛋白flp能够特异性的识别frt位点，并将两个frt位点之间的序列切除。进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述感受态宿主细胞为采用cacl2法制备的感受态大肠杆菌。进一步地，在本发明的一些实施方案中，loip基因的碱基序列如seqidno.6所示。seqidno.6为大肠杆菌中的loip基因序列，当然，在其他的一些实施例中，采用不同的菌株，loip基因序列存在一定的差异性，但只要是敲除的是与seqidno.6同源的loip基因，也应当属于本发明的保护范围。本发明的有益效果包括：本发明提供的抑制基因水平转移的方法，其包括：将目标外源质粒与loip基因敲除的感受态宿主细胞混合，通过将宿主细胞的loip基因敲除，降低转化率，抑制基因水平转移，该方法具有明显降低转化效率的特点，例如：相对于野生型e.colidh5α，loip基因敲除的e.colidh5α::δloip对质粒puc19的转化效率降低了3.33倍，对质粒pet-32a的转化效率降低了8.38倍，对质粒p1304的转化效率降低了2.75倍，本发明提供的抑制基因水平转移方法对抵制抗药性病菌的出现具有十分重要的意义。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本发明实施例1中的pcr扩增的外源卡那抗性打靶片段的电泳图；图2为本发明实施例1中的卡那抗性打靶片段替换loip基因的阳性重组子菌落pcr鉴定电泳图；其中，m为marker，l为e.colidh5α对照组，l1-l5为e.colidh5α::kan::△loip阳性重组子；图3为本发明实施例2中的已重组的卡那片段丢失后的突变体菌落pcr鉴定电泳图；其中，m为marker，l1为e.colidh5α对照组，l2为e.colidh5α::△loip，l3为e.colidh5α::kan::△loip；图4为本发明实施例3中的质粒puc19转化突变菌株e.colidh5α::△loip的平板计数图；其中，a为e.colidh5α质粒转化puc19平板；b为e.colidh5α::△loip转化质粒puc19平板；图5为本发明实施例3中的质粒pet-32a转化e.colidh5α::△loip的平板计数图；其中，c为e.colidh5α转化质粒pet-32a平板；d为e.colidh5α::△loip转化质粒pet-32a平板；图6为本发明实施例3中的质粒p1304转化e.colidh5α::△loip的平板计数图；其中，e为e.colidh5α转化质粒p1304平板；f为e.colidh5α::△loip转化质粒p1304平板；图7为突变株转化对不同大小的质粒效率统计结果图；其中，不同大小的质粒分别为puc19、pet-32a和p1304。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例11、pcr扩增外源含卡那抗性基因的线性打靶片段，用于敲除loip基因：(1)以含卡那抗性基因的质粒pkd4为模板，用引物k-loip-f和k-loip-r，通过pcr扩增卡那抗性基因线性打靶片段“同源臂+frt+kan序列+frt+同源臂”，扩增完成后用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。扩增体系如表1所示。表1外源卡那抗性基因线性打靶片段pcr体系试剂名称体积5×primestarbuffer(mg2++plus)10μldntpmixture(2.5mmeach)4μlk-loip-f1μlk-loip-r1μltemplate1μlprimerstarhsdnapolymerase(2.5units/μl)0.5μlsterilizeddistilledwaterupto50μl(2)pcr扩增条件：预变性：95℃、5min；变性：98℃、10s；退火：56℃、30s；延伸：72℃、2min10s；30个循环；72℃、5min。(3)外源卡那抗性基因打靶片段扩增引物k-loip-f：atttttagaataatcctgaccttgtgcggaagagaaaacgtgtaggctggagctgcttc(seqidno.2)；k-loip-r：tatctgacctacgttcgacaccaccaggctttacttaatatgggaattagccatggtcc(seqidno.3)；扩增得到的打靶片段碱基序列如下(seqidno.1)：atttttagaataatcctgaccttgtgcggaagagaaaacgtgtaggctggagctgcttcgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaacttcaagatcccctcacgctgccgcaagcactcagggcgcaagggctgctaaaggaagcggaacacgtagaaagccagtccgcagaaacggtgctgaccccggatgaatgtcagctactgggctatctggacaagggaaaacgcaagcgcaaagagaaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgatagctagactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccagcttcaaaagcgctctgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaactaaggaggatattcatatggaccatggctaattcccatattaagtaaagcctggtggtgtcgsscgtaggtcagata(4)扩增结果增完成后用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1所示，理论长度为1828bp；图1结果显示在1800bp左右位置有条带；符合理论值。(5)测序对打靶片段pcr产物进行测序鉴定，结果与理论序列一致。2、e.colidh5α/pkd46电转化感受态细胞的制备利用cacl2转化法将质粒pkd46转入e.colidh5α中，筛选得到含有质粒pkd46的阳性转化子e.colidh5α/pkd46。挑取e.colidh5α/pkd46单菌落接种于2mllb液体培养基中，于30℃震荡过夜培养；按1:100转接菌液于含100mm氨苄青霉素的50mllb液体培养基中培养，待生长至菌体浓度为od600≈0.2时，加入100mml-阿拉伯糖，待继续生长至具体浓度为od600≈0.5后转移菌液至预冷的离心管中冰浴15min，于4℃、5000r/min离心10min，弃去上清。用预冷的10％甘油洗涤一次，4℃，5000r/min离心10min，弃去上清；以100倍的浓缩比例，加入500μl灭菌的10％甘油，重悬菌体，制成感受态细胞，每管分装100μl，存放于-80℃冰箱待用。3、外源卡那抗性基因打靶片段替换e.colidh5α野生型基因组中基因loip将200ngpcr扩增的打靶片段加入100μl制备好的e.colidh5α/pkd46电转化感受态细胞，轻轻混匀，转入预冷的0.1cm电击杯中电击，电击(电击电压1.8kv，电击时间4.5ms。)后迅速加入1mlsoc液体培养基，150r/min，37℃复苏2h。移取200μl复苏后的菌液涂布于含有kan(50μg/ml)抗性的lb固体平板上，将平板倒置，37℃培养箱中培养16～24h。4、阳性重组子的筛选及鉴定用已灭菌的牙签随机挑取在卡那霉素平板上长出的单菌落5个，点植到一新的卡那霉素平板上37℃培养12～16h。用鉴定引物对随机挑取的5个单菌落进行pcr扩增。引物设计根据ncbi/genebank提供的e.colimg1655参考基因组序列，用primer5.0引物设计软件设计鉴定引物i-loip-f和i-loip-r；pcr体系如表2所示：i-loip-f：ctctggatcatgctcgcat(seqidno.4)；i-loip-r：gcgccttatccgacctacgt(seqidno.5)。表2鉴定pcr体系体积10×pcrbuffer5μldntpmixture3μli-loip-f2μli-loip-r2μltemplate菌落dnapolymerase1μlsterilizeddistilledwaterupto50μlpcr反应条件：预变性：95℃、5min；变性：95℃、1min；退火：56℃、30s；延伸：72℃、45s；30个循环；72℃、5min。产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图2所示，w1-w5均为阳性菌株，鉴定为阳性的菌株命名为e.colidh5α::kan::△loip，用斜面保藏法或甘油保藏法保藏，备用。实施例2(1)重组菌株e.colidh5α::kan::△loip卡那抗性片段的丢失(也可理解为：去除或敲除)将可编码重组蛋白flp的温敏质粒pcp20用电转化的方法导入鉴定正确的e.colidh5α::kan::△loip重组菌株中，30℃、150r/min复苏培养1h，取200μl涂布在含有35μg/ml氯霉素的lb平板培养基上，30℃培养8h后，提高到42℃过夜培养，热诱导flp重组酶表达，质粒也会丢失。(2)突变菌株e.colidh5α::△loip的筛选及鉴定用无菌牙签随机5个挑取在氯霉素平板上长出的单菌落，每个单菌落均分别接种在氯霉素平板，氨苄青霉素平板及无抗生素平板上，37℃培养12～16h，只能在无抗生素平板上生长的菌落初步鉴定为质粒已丢失的e.colidh5α::△loip阳性突变株；如能在氨苄青霉素和氯霉素任一平板生长的菌株则继续置于42℃培养，直至只能在无抗生素平板生长。对只能在无抗生素平板上生长的菌落用鉴定引物i-loip-f和i-loip-r进行pcr鉴定。鉴定所用引物：i-loip-f：ctctggatcatgctcgcat(seqidno.4)；i-loip-r：gcgccttatccgacctacgt(seqidno.5)；表3鉴定pcr体系体积10×pcrbuffer5μldntpmixture3μli-loip-f2μli-loip-r2μltemplate菌落dnapolymerase1μlsterilizeddistilledwaterupto50μlpcr反应条件：预变性：95℃、5min；变性：95℃、1min；退火：56℃、30s；延伸：72℃、45s；30个循环；72℃、5min。产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图3所示，l1为野生型菌株鉴定引物pcr条带；l3为基因loip成功缺失后的阳性突变株e.colidh5α::△loip鉴定条带；l2为基因loip被打靶片段同源替换后的菌株e.colidh5α::kan::△loip鉴定条带。对于鉴定为阳性突变的菌株命名为e.colidh5α::△loip，用甘油保藏法和斜面保藏法进行保藏。结果表明loip基因被成功删除。实施例3突变体菌株e.colidh5α::△loip转化效率的测定用100mmcacl2分别制备野生型e.colidh5α和突变体菌株e.colidh5α::△loip感受态细胞，将质粒puc19、pet-32a、p1304稀释至5ng/μl。取2μl分别加入100μl的两种感受态中，轻轻混匀，冰浴30min。于42℃下热击90s，冰浴2min后加入900μllb培养液于37℃，180r/min复宿50min。取100μl分别于lb平板上涂布，37℃过夜培养并计数。转化效率＝(稀释度×转化子数×转化原液体积)/涂布菌液体积/dna质量数(μg)结果如图4-图7所示，结果表明野生型e.colidh5α、突变型e.colidh5α::δloip的感受态细胞对质粒puc19的转化效率分别为6.29×106cfu/μg和1.89×106cfu/μg；对质粒pet-32a的转化效率分别为4.58×106cfu/μg和5.5×105cfu/μg；对质粒p1304的转化效率分别为5.15×105cfu/μg和1.87×105cfu/μg；相对于野生型e.colidh5α，突变型e.colidh5α::δloip对质粒puc19的转化效率降低了3.33倍。对质粒pet-32a的转化效率降低了8.38倍。对质粒p1304的转化效率降低了2.75倍。综合以上结果，表明基因loip的缺失能够使100mmcacl2诱导下e.colidh5α形成的感受态细胞对质粒的转化效率显著降低，抑制基因水平转移，进而防止或降低微生物从从外界环境中吸收抗药性dna片段的能力，本发明提供的方法为减少或避免抗药性细菌出现提供了一种新途径和思路。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>兰州理工大学<120>一种抑制基因水平转移的方法<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>1574<212>dna<213>人工序列<400>1atttttagaataatcctgaccttgtgcggaagagaaaacgtgtaggctggagctgcttcg60aagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaacttcaagatcccctcac120gctgccgcaagcactcagggcgcaagggctgctaaaggaagcggaacacgtagaaagcca180gtccgcagaaacggtgctgaccccggatgaatgtcagctactgggctatctggacaaggg240aaaacgcaagcgcaaagagaaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgatagctag300actgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggta360aggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggc420gcaggggatcaagatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaag480atggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactggg540cacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcc600cggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcag660cgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtca720ctgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcat780ctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcata840cgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcac900gtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggc960tcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcg1020tcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctg1080gattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggcta1140cccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacg1200gtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttct1260gagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgaga1320tttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgc1380cggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccagctt1440caaaagcgctctgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaactaa1500ggaggatattcatatggaccatggctaattcccatattaagtaaagcctggtggtgtcgs1560scgtaggtcagata1574<210>2<211>59<212>dna<213>人工序列<400>2atttttagaataatcctgaccttgtgcggaagagaaaacgtgtaggctggagctgcttc59<210>3<211>59<212>dna<213>人工序列<400>3tatctgacctacgttcgacaccaccaggctttacttaatatgggaattagccatggtcc59<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<400>4ctctggatcatgctcgcat19<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5gcgccttatccgacctacgt20<210>6<211>759<212>dna<213>人工序列<400>6atgaaaattcgcgccttattggtagcaatgagcgtggcaacggtactgactggttgccag60aatatggactccaacggactgctctcatcaggagcggaagcttttcaggcttacagtttg120agtgatgcgcaggtgaaaaccctgagcgatcaggcatgtcaggagatggacagcaaggcg180acgattgcgccagccaatagcgaatacgctaaacgtctgacaactattgccaatgcgcta240ggcaacaatatcaacggtcagccggtaaattacaaagtgtatatggcgaaggatgtgaac300gcctttgcaatggctaacggctgtatccgcgtctatagcgggctgatggatatgatgacg360gataacgaagtcgaagcggtgatcggtcacgaaatggggcacgtggcgttaggccatgtg420aaaaaaggaatgcaggtggcacttggtacaaatgccgtgcgagtagctgcggcctctgcg480ggcgggattgtcggaagtttatctcaatcacaacttggtaatctgggcgagaaattagtc540aattcgcaattctcccagcgccaggaagcagaagccgatgattattcttacgatcttctg600cgccaacgcggcatcagcccggcaggtcttgccaccagctttgaaaaactggcaaaactg660gaagaaggtcgccaaagctcaatgtttgacgaccatcctgcatccgccgaacgcgcccag720catattcgcgatcgcatgagcgcggatgggattaagtaa759当前第1页12