本发明涉及一种细胞定向分化的方法，尤其涉及一种调控神经干细胞定向分化的方法，利用重组sirna下调吡哆醛激酶表达，促使神经干细胞定向分化。
背景技术
中枢神经系统疾病一直困扰人们日常生活的重要疾病。随着人们的寿命不断升高，中老年人群中患有神经退行性疾病，如阿兹海默症、帕金森病的病人日益增多，已经成为很严重的社会问题。中风和脊髓损伤等各种中枢神经系统损伤也对人们的健康造成重要的危害。目前对这些中枢神经系统疾病的药物和手术治疗都无法取得令人满意的效果。神经干细胞的移植修复技术为这类疾病治疗提供了切实可行的手段。
神经干细胞具有自我更新和定向分化的能力，能在植入部位产生分化并产生具有局部特异性的神经细胞，也来越多的证据表明进行有效的细胞移植是修复中枢神经系统损伤的重要治疗方法。神经干细胞不仅可以分化为神经元，也可以分化为星形胶质细胞修复神经元缺失而且可以修复损伤的星形胶质细胞，修复受损的髓鞘等。星形神经胶质细胞具有营养支持神经元的生长，能够选择性去除神经元细胞的突触，积极修复神经回路。神经元在星形胶质细胞帮助下，不断微调和重塑大脑的神经回路，可以帮助我们学习、回忆和运动等。
大脑或脊髓的损伤部位的微环境和正常情况差异很大，如果神经元或神经干细胞直接移植到受损部位，细胞往往后期发育分化面临的未知因素很多，最终分化和生长情况不理想。星形胶质细胞具有修复稳定中枢神经系统内环境的作用，能够帮助神经元或神经干细胞更好在受损的移植区域分化生长。星形胶质细胞还可以将外源性基因导入神经组织，使其在体内有效表达，修复微环境系统。因此，将星形胶质细胞提前或与干细胞、神经元同时移植，将有利于中枢神经系统损伤的修复及其它疾病的治疗。目前对于神经干细胞分化为星形胶质细胞的方法还很少。
研究表明星形胶质细胞可以从血液中吸收酪氨酸和左旋多巴，纹状体的星形胶质细胞贮存有足够的左旋多巴胺可以为神经元使用，这与帕金森病多巴胺神经元关系密切。表达在星形胶质细胞膜上中性肽链内切酶(neprilysin)被发现可以降解beta-淀粉样蛋白。目前已经证实星形胶质细胞凋亡可直接导致运动神经元损伤，引起肌肉萎缩症(amyotrophiclateralsclerosis)。脊髓损伤后造成的谷氨酸微环境变化，会造成灰质更多神经元丢失，移植星形胶质细胞可以改善神经元的微环境，因为其膜表面谷氨酸转运蛋白1是维系中枢神经系统谷氨酸内环境稳态的重要手段。在脊髓损伤造成的大鼠肌肉萎缩症动物模型的脊髓内，接种转基因高表达谷氨酸转运蛋白1的人诱导多能干细胞(ips)来源的前体星形胶质细胞，可以显著改善大鼠的肌肉萎缩症(experimentalneurology，2015，271，479～492)。从小脑延髓池注射人胚胎干细胞来源的星形胶质细胞也可以显著改善大脑高氧化压力hsod1g93a转基因小鼠和肌肉萎缩症大鼠的运动能力，存活期显著延长，运动神经元凋亡率显著下降(stemcellresearch&therapy，2018，9，152～168)。因此针对星形胶质细胞的治疗方案在中枢神经系统疾病具有很好的应用前景。
rna干扰(rnainterference，rnai)是指由双链rna诱发的、同源mrna高效特异性降解的现象。rnai具有特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mrna。通过相对很少量的dsrna分子就能特异性剔除或关闭特定基因的表达。具有茎环结构的shrna分子比在细胞中同时表达的sirna分子的正义链与反义链对靶基因的抑制效率要高，shrnas可以利用稳定转染的质粒载体或整合到染色体的反转录病毒载体、慢病毒载体进行表达，能够长效的抑制基因表达。在哺乳动物rnai试验研究中，如需要持久抑制基因表达，最恰当的方法是利用质粒或反转录病毒载体表达shrnas。
技术实现要素：
本发明的一个目的在于提供一种调控神经干细胞发育分化的方法，使得神经干细胞分化为星形胶质细胞。
本发明的另一个目的在于提供一种基因干扰质粒，用于调控神经干细胞分化为星形胶质细胞。
本发明的再一个目的在于提供一种基因干扰质粒，下调吡哆醛激酶基因转录的mrna表达。
本发明的又一个目的在于提供一种基因干扰质粒，上调表达星形胶质细胞的特异蛋白gfap。
本发明的又一个目的在于提供一种基因干扰质粒，下调神经元的特异蛋白neun。
本发明的另一个目的在于提供一种星形胶质细胞在制备改善神经元凋亡率的药物中的应用。
本发明的再一个目的在于提供一种星形胶质细胞在制备改善神经元的微环境药物中的应用。
本发明提供一种基因干扰质粒，转录如seqidno3所示的shrna。
本发明提供的基因干扰质粒包括seqidno1和seqidno2。seqidno1和seqidno2系一对特异互补寡核苷酸。
本发明提供的基因干扰质粒，能上调表达星形胶质细胞的特异蛋白gfap。
本发明提供的基因干扰质粒，能下调神经元的特异蛋白neun。
本发明提供另一种基因干扰质粒，以质粒psilencer2.1-u6neo为载体，包括seqidno1和seqidno2。seqidnol和seqidno2位于bamhi酶切位点和hindiii酶切位点之间。
本发明提供另一种基因干扰质粒，以质粒psilencer2.1-u6neo为载体，将seqidno1的5’端与载体的bamhi酶切位点相连，seqidno2的5’端与载体的hindiii酶切位点相连。
本发明提供的基因干扰质粒，能转录获得发卡结构的shrna，如seqidno3所示，具体为：gauuugagguugaugccgu-loop-uucaagaga。
本发明提供的基因干扰质粒，能转录获得发卡结构的shrna，如seqidno3所示，能下调吡哆醛激酶基因转录的mrna表达37％±8％。
本发明提供的一种构建基因干扰质粒的方法，将seqidno1和seqidno2组成的dna插入载体的bamhi酶切位点和hindiii酶切位点相连之间，受调控元件u6snrna启动子控制下进行表达shrna产物。
经过试验，具有明显消减吡哆醛激酶mrna的rnai核苷酸片段是：正义sirna为gauuugagguugaugccgu，反义sirna为acggcaucaaccucaaauc-uu。
本发明技术方案可以实现诱导神经干细胞定向分化为星形胶质细胞，同时抑制神经干细胞向神经元分化。从而可以实现体外诱导和制备星形胶质细胞。
本发明制得的星形胶质细胞用于制备降低神经元凋亡率的药物。
本发明制得的星形胶质细胞用于制备改善神经元的微环境药物。
附图说明
图1为基因干扰质粒的结构示意图；
图2为稳定表达特定重组基因干扰质粒的小鼠神经干细胞c17.2体外培养生长状态图；
图3为表达特定重组基因干扰质粒下调小鼠神经干细胞吡哆醛激酶mrna表达对比图。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
实施例1基因干扰质粒的构建
参照设计sirna设计的原则，选择小鼠吡哆醛激酶基因的第194bp～216bp的核苷酸作为rnai靶点，合成两条长度为64bp的单链dna，分别叫做正义链和反义链，在单链dna分子的5’端磷酸化以促进连接反应。正义链5’端引入bamhi限制性内切酶位点，反义链端引入hindiii酶切位点，这样退火后的dna短链可以定向插入寡核苷酸结构到psilencer2.1-u6neo质粒(ambion)中，见图1。同时合成无意序列作为阴性对照。
将合成的单链寡dna单链分子分别溶于无核酸酶的超纯水中，用tris-edta缓冲液稀释到浓度为1μg/ml。两条单链dna的退火反应体系：正义链2μl，反义链2μl，退火缓冲液(10mmtris-hcl(ph7.5)，1mmedta，0.1mmnacl)46μl，混匀后90℃3min，37℃60min。退火后的寡聚dna链和已经用bamhi和hindiii双酶切开的线性psilencer2.1-u6neo质粒进行连接，寡聚dna链1μl，退火缓冲液1μl，无核酸酶超纯水6μl，10×t4dna连接酶缓冲液1μl，1μlt4dna连接酶(takara，5u/μl)，线性psilencer2.1-u6neo质粒1μl，混匀后16℃过夜。同样方法构建阴性无意义序列质粒作为对照组。
质粒转化采用常规氯化钙转化法，取5μl上述连接产物与100μl感受态dh5a大肠杆菌混匀，冰水浴30分钟，42℃水浴热击90s，冰水浴2分钟，加入500μlsoc培养基，摇床37℃，200rpm培养2小时。吸取100μl菌液涂布在含氨苄青霉素的lb细菌培养皿上，倒置培养37℃，16小时。挑选克隆菌落，外送测序确保构建的质粒载体正确。
实施例2稳定转染重组sirna干扰质粒的小鼠神经干细胞c17.2的分化
取对数生长期的小鼠神经干细c17.2，经胰蛋白酶酶消化后，按3×105细胞/皿，接种在φ35mm细胞培养皿中，添加dmem培养基，10％胎牛血清(gibico)，5％马血清(gibico)，1mm谷氨酰胺，1％青霉素，1％链霉素，37℃，5％co2培养约2-3天。采用lipofectamine2000(invitrogen)转染重组sirna干扰质粒。取250μldmem加入约4μg重组干扰质粒混匀。另取250μldmem加入约10μllipofectamine2000，轻轻混匀静置5min。混合上述共500μldmem，混匀静置20min，加入细胞培养皿中，37℃，5％co2培养2天后按正常细胞培养。
转染后的神经干细胞，用1mg/mlg418筛选稳定表达的神经干细胞，两周后采用常规免疫荧光技术检测特异蛋白。采用的方法是：细胞培养皿中的细胞经4％多聚甲醛固定后，0.1％tritionx-100漂洗三次，5％马血清封闭30分钟后，细胞与单抗孵育(1：500)1小时，漂洗三次后，细胞与fitc偶联的二抗孵育1小时，最后漂洗三次后，细胞核染色用dapi(sigma)，滴加荧光抗淬灭剂，激光共聚焦显微镜观察(zeiss)。我们分别采用单克隆抗体和fitc标记二抗(abcam)检测了神经元特异性核蛋白(neuronspecificnuclearprotein，neun)和神经胶质细胞特异性胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，gfap)。实验结果表明，重组sirna干扰质粒可以稳定转染小鼠神经干细胞c17.2，神经干细胞两周后绝大部分停止发育分化为神经元，大部分分化为星型胶质细胞，见图2。
同时用实时定量rt-pcr检测neun和gfap的表达情况。细胞经胰蛋白酶消化，漂洗后，使用rneasyminikit(qiagen)抽提总rna，并反转录为cdna(takarakit)。实时定量rt-pcr测定gfap和neun的表达情况，内参采用gapdh。
neun上游引物：ccaggcactgaggccagcacacagc；
neun下游引物：ctccgtggggtcggaagggtgg。
gfap上游引物：cggagacgcatcacctctg；
gfap下游引物：tggaggagtcattcgagacaa。
gapdh上游引物：ggtgaaggtcggtgtgaacg；
gapdh下游引物：ctcgctcctggaagatggtg。
转染重组sirna干扰质粒后，小鼠神经干细胞c17.2显著上调表达星形胶质细胞的特异蛋白gfap(p＜0.05)，极显著下调神经元的特异蛋白neun(p＜0.01)。
实施例3实时定量rt-pcr检测稳定转染重组sirna干扰质粒的小鼠神经干细胞c17.2胞内吡哆醛激酶mrna拷贝数变化
为了检测稳定转化重组sirna干扰质粒对神经干细胞的吡哆醛激酶的mrna转录水平的影响，采用实时定量rt-pcr检测吡哆醛激酶mrna拷贝数。方法是收集g418筛选后的小鼠神经干细胞c17.2，由rneasyminikit(qiagen)抽提细胞总rna，反转录为cdna(takarakit)。实时荧光定量pcr检测吡哆醛激酶mrna拷贝数，内参为β-actin。采用的吡哆醛激酶上游引物：gacatcgaggacccagagat，以及吡哆醛激酶下游引物：atggctctaaggcagacgtt。β-actin上游引物：cactcttccagccttccttc，以及β-actin下游引物ggatgtccacgtcacacttc。反应条件按天根公司试剂盒说明，使用伯乐实时荧光定量pcr仪。结果表明，稳定转染重组sirna干扰质粒的小鼠神经干细胞c17.2，胞内吡哆醛激酶mrna显著下调(p＜0.05)，见图3。
序列表
<110>章毅
中国干细胞集团上海生物科技有限公司
中国干细胞集团海南博鳌附属干细胞医院有限公司
上海市干细胞技术有限公司
重庆市干细胞技术有限公司
陕西省干细胞技术有限公司
苏州市干细胞技术有限公司
三亚市干细胞技术有限公司
<120>神经干细胞定向分化的质粒及其构建方法和用途
<141>2018-07-25
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