预测结肠癌预后的生物标记物长链非编码RNALINC02372及试剂盒的制作方法

本发明属于生物医药
技术领域：
，具体涉及预测结肠癌预后的生物标记物长链非编码rnalinc02372及试剂盒。
背景技术：
在全球范围内，结肠癌是最常见的肿瘤相关死亡原因之一。结肠癌患者死亡的主要原因是肝转移，其5年生存率只有30%左右。肝转移是结肠癌最常见的远处转移途径。将近50％的结肠癌患者最后均将发生肝转移。在晚期结肠癌患者中，结肠癌的死亡主要归咎于肝转移的发生。虽然系统性化疗使结肠癌肝转移患者在生存上获益，但是肝切除依然是结肠癌肝转移的最有效的和潜在的根治性措施。然而，仍然有很多结肠癌肝转移患者在接受肝转移灶的切除后最终因肿瘤复发而死亡，提示肝转移灶切除手术对很多结肠癌肝转移患者来说是远远不够的。随着新的化疗方案加入到传统化疗方案中，使得部分结肠癌肝转移患者的生存得到和显著的提高。然而，很大部分结肠癌患者的总生存依旧没有得到令人满意的结果。目前，临床上还没有理想的分子指标来评估预后及发生转移的风险。因此，寻找新的预后生物标志物是目前急需解决的问题。长链非编码rna是长度超过200个核苷酸，无蛋白编码能力的rna分子，可定位于细胞浆或细胞核。长链非编码rna多由rna聚合酶ii转录，但没有开放阅读框，具有和编码蛋白基因相似的表观遗传学特征，如在转录起始位点有h3k4me3，转录区有h3k36me3的结合。根据gencodev19报道，人类基因组中含有多达13870个长链非编码rna基因，产生超过23898条长链非编码rna。长链非编码rna参与调节多个过程，其表达和功能异常可导致多种疾病，包括肿瘤。长链非编码rna在肿瘤中可发挥癌基因或抑癌基因的功能，参与调控肿瘤的增殖，转移，自噬，凋亡等多个方面。已有文献报道，多种长链非编码rna的异常和结肠癌的进展密切相关。虽然有些肿瘤相关的长链非编码rna在不同的肿瘤中有类似的表达和功能，但部分长链非编码rna存在肿瘤的特异性，需要描绘结肠癌特异的长链非编码rna表达谱，并筛选新的结肠癌特异表达的长链非编码rna，以期发现结肠癌诊断和治疗的新的标记物。linc02372是一种新发现的非编码rna，其转录本长度大于200个核苷酸。目前，linc02372在正常细胞发育或肿瘤发生发展的过程中发挥的重要作用还在进一步研究中。linc02372是否可以作为一种新的肿瘤标志物用于预测结肠癌患者预后尚未有报道。因此，我们首次阐明了以linc02372为新的结肠癌标志物来预测患者预后的可行性。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种预测结肠癌预后的生物标记物长链非编码rnalinc02372及试剂盒，预测结肠癌患者的预后生存期。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：预测结肠癌预后用的生物标记物为长链非编码rnalinc02372，该长链非编码rnalinc02372的核酸序列如seqno:1所示。长链非编码rnalinc02372生物标记物在制备预测结肠癌预后的制剂中的应用。所述预测结肠癌预后的制剂为实时荧光定量pcr检测试剂盒。用于预测结肠癌预后的实时荧光定量pcr检测试剂盒，包含用于检测目的基因linc02372表达的特异性引物，引物序列为seqno:2和seqno:3。用于预测结肠癌预后的实时荧光定量pcr检测试剂盒包含内参基因tuba1a表达的特异性引物，引物序列为seqno:4和seqno:5。所述的用于预测结肠癌预后的实时荧光定量pcr检测试剂盒还包括实时荧光定量sybr染料、无rna酶的水。用于预测结肠癌预后的实时荧光定量pcr检测试剂盒中实时荧光定量sybr染料、目的基因linc02372特异性引物、内参基因tuba1a特异性引物、无rna酶的水的体积比为10:1:1:6。本发明的有益效果在于：本发明通过荧光定量pcr与生存曲线分析发现结肠癌组织来源的linc02372与患者的生存率相关，含量越高，生存率越高。此法为预测结肠癌患者的预后生存期分析提供了强有力的技术支持，有助于提高结肠癌患者的术后生活质量，制订术后治疗方案，提高生存率，具有深远的临床意义。附图说明图1为实时荧光定量pcr分析linc02372在正常组织与结肠癌中的表达差异。图2为生存曲线分析结肠癌组织来源的linc02372表达高低对结肠癌患者的预后影响。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。实施例1预测结肠癌预后用的生物标记物为长链非编码rnalinc02372，该长链非编码rnalinc02372的核酸序列如seqno:1所示。预测结肠癌预后的制剂为实时荧光定量pcr检测试剂盒，实时荧光定量pcr检测试剂盒包含用于检测目的基因linc02372表达的特异性引物，引物序列如seqno:2和seqno:3所示，实时荧光定量pcr检测试剂盒还包含内参基因tuba1a表达的特异性引物，引物序列如seqno:4和seqno:5所示。制备检测linc02372表达量的试剂用于制备结肠癌患者预后的试剂盒(用于50次反应)，所需的试剂包括：sybrgreenqpcrmix500μl、3μm目的基因linc02372特异性引物50μl、3μm内参基因tuba1a特异性引物50μl、无rna酶的水300μl。从结肠癌的肿瘤或正常对照组织中抽提总rna所用试剂，包括：trizoll20ml、抑制rna降解溶剂40ml、氯仿80ml、异丙醇80ml、depc水10ml。以总rna为模板将linc02372逆转录为cdna所用试剂，包括：10×随机引物和oligodt引物的混合物100μl、5×逆转录反应缓冲液150μl、10mm含mg2+的三磷酸碱基脱氧核苷酸dntp100μl、200u/μlm-mlv逆转录酶50μl。实施例2组织样本linc02372的检测1、收集待测结肠癌肿瘤组织或正常对照组织，生理盐水清洗干净后，放入盛有抑制rna降解溶剂的冻存管中，放至-80℃冰箱备用。2、组织中rna的抽提（1）先在研钵中加入液氮，再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取100mg组织粉末加入已盛有1ml的trizol液的ep管中。组织粉末总体积不能超过所用trizol体积的10%，充分混合均匀。（2）室温放置5分钟，然后加入200μl的氯仿，盖紧ep管并剧烈摇荡0.5分钟。12000转/分钟离心10分钟。（3）取上层水相于一新的ep管中，加入500μl异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10分钟，12000转/分钟离心10分钟。（4）小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000转/分钟离心5分钟。重复操作一次。（5）弃去上清液，室温或真空干燥5～10分钟。用50μldepc处理过的水将rna溶解。（6）rna浓度测定：用核酸浓度测定仪进行测定，吸1μlrna样品加至样品孔，根据读数直接确定rna的浓度。核酸浓度测定仪的测定的od260/od280比值，比值在1.8-2.0之间认为rna纯度很好。最后，rna贮存于-80℃冰箱备用。3、linc02372rna的逆转录使用上海碧云天生物技术有限公司的逆转录试剂盒（d7170s）。具体步骤如下：（1）去除基因组dna：将模板totalrna，5×gdnaeraserbuffer在冰上解冻，5×rtbuffer、10×rtprimermix、depc-treatedwater在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液混匀并短暂离心以使所有液体沉降至管底。rna的变性，把rna样品在65℃条件下热变性5分钟后，立即置于冰水中冷却。按下表成分于冰上配制反应混合液，然后再分装到每个反应管中，最后加入rna样品。反应体系及条件如表1所示。表1（2）在pcr仪上或水浴中，37℃孵育2分钟。迅速置于冰上放置备用。（3）逆转录体系配制：在冰上进行反应液配制，轻柔混匀后立即进行逆转录反应。按照下表的逆转录反应体系配制混合液。反应体系及条件如表2所示。表2（4）42℃孵育60分钟以进行逆转录反应，随后80℃孵育10分钟失活逆转录酶后放于冰上。对于二级结构复杂或高gc含量的模板，可以提高逆转录温度至50℃，以增强逆转录效率。（5）得到的cdna可立即或-80℃冻存后用于后续实时荧光定量pcr，cdna宜避免过多的反复冻融。4、利用linc02372的特异性引物进行实时定量pcr特异性引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成，包括用于检测linc02372表达的特异性引物，引物序列为seqno:2和seqno:3，以及内参基因tuba1a表达的特异性引物，引物序列为seqno:4和seqno:5。实时定量pcr其它试剂利用上海碧云天生物技术有限公司的beyofast™sybrgreenqpcrmix(2×)，具体步骤如下：（1）融解并混匀pcr反应所需的各种溶液，beyofast™sybrgreenqpcrmix完全融解并混匀后置于冰盒内。（2）冰浴上设置pcr反应体系(以96孔板为例),反应体系及条件如表3所示。表3试剂使用量beyofast™sybrgreenqpcrmix(2x,lowrox)10μl特异性引物(浓度3μm)2μl模板dna2μl无rna酶的水6μl总体积20μl(3)通常dna模板的量以1-10ngcdna为参考用量，引物的终浓度为0.2-0.5μm时可获得良好的检测效果，也可根据情况调整引物的终浓度。如有必要，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。逆转录pcr反应得到的cdna直接作为模板时，其添加量不要超过pcr反应总体积的10%。96孔板的推荐反应体系为20μl，也可以根据实际实验需求，按比例扩大或缩小反应体系。(4)用移液器轻轻吹打混匀或轻微vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。(5)将设置好的pcr反应管或pcr反应板置于荧光定量pcr仪上，开始pcr反应。(6)pcr反应程序：在实时荧光定量pcr反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃2分钟。采用如下的pcr程序，本程序是以abi7900ht荧光定量pcr仪为例：a.预变性：95℃2min；b.变性：95℃15sec；c.退火/延伸：60℃15-30sec；d.重复步骤b和步骤c，总共40个循环；e.熔解曲线分析(可选)：95℃15sec,60℃15sec,95℃15sec；f.使用荧光定量pcr仪提供的软件分析结果。三步法只需在退火/延伸后加一步72℃30sec，随后重复步骤b、c及增加的这一步骤共40个循环即可。5、linc02372表达量的数据分析本实验数据纳入60例结肠癌患者及其正常对照组织。实时定量pcr的结果分析采用相对定量方法即2^-△△ct法。具体如下：首先，将一次实验的所有基因ct值整理好，之后用每一组肿瘤样本中的目的基因linc02372的ct值减去自身内参基因tuba1a的ct值，得到的数就是△ct；换成公式就是：△ct=ct（目的基因linc02372）-ct（内参基因tuba1a）；然后，将每一组肿瘤样本每一个目的基因linc02372的△ct都算好。用本次实验中肿瘤组织样本的△ct减去正常对照组织组样本的△ct，并同时对所有结果取相反数，该步运算得到的结果就是-△△ct。最后，对-△△ct进行2的幂运算，即2^-△△ct就得出表达量的倍数改变。重复三次，利用非参数t-检验进行统计分析。结果如图1所示，结肠癌的肿瘤组织中linc02372的表达量比正常对照组织高，差异具有统计学差异(p＜0.05)。通过对上述实验所纳入的60例结肠癌患者随访统计资料，包括患者首次发病的时间，治疗情况，复发状况及死亡时间等，随访时间为至少12个月。在所选取的结肠癌患者中，选取荧光实时定量pcr分析的表达值为参考标准，所得结果与其对应的正常组织相比较，结果如图2所示。肿瘤组织中linc02372表达高于正常对照组织的患者定义为linc02372高表达组，其余为低表达组。通过kaplan-meier生存分析，linc02372高表达患者的生存期比linc02372低表达组的患者明显降低，预后更差，差异具有有统计学意义(p＜0.05)。因此，linc02372可作为结肠癌患者预后的特异性分子标志物。以上所述为本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明整体构思的前提下，还可以做出若干变化和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。sequencelisting<110>郑州大学第一附属医院<120>预测结肠癌预后的生物标记物长链非编码rnalinc02372及试剂盒<130>1<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>2553<212>dna<213>人<400>1attctcttgcattccacccggggaacaagacagcaccgggtttcacactggcaaggcagg60aggctgtgtgctgccagaacgaccagcagggggcgcaaaggccacgccaggcacctgctg120gcctcagagaaaacagaaagggaaccaggaagcccactcctgctgtcctttctctgcaag180gaaatgtgccagggcactgcagcccagacagtcggcagtagaggacccatgaagtatctt240tgtgcaaagaaagcagcaaagagaattaagagaattgcatcatataaagagtgaattaaa300ccatctaaaggagcaaaaattcatcatcacatggacaagaaattaagacgtaacatccat360ctcactatttgcaaagtggcttattcctacagacaatgcagatatgtaaaaagcagctgg420aaacctaggagcagaagcccagcataaagatctctgaaagcctggatgcgtggattcctc480tcttacttcccaaaacggtggggtggaaatgtgaatatcagcatgatgcacagatctctg540cagatgtccagcgaactgaatttctagacgctataatctatgttctttcccaacccccac600ttcagtttacatatcgcaggccatagatcctgtttgttgaaaagcgatcagctagaaaac660aagagtggttataacctgtgctgcccagtgatcaggaaaagagagcggatgaaacttcca720tgactttctgttagtctgattaatatccatgccaaatgtaagattagttaaaaggcctta780ttgcttcccaccaaaatgttccttcactagctatatactacactgaaatgtaaagttatg840ggtatgtttaacagtttaatttgtcagtgggcatccaactcttctatttgtgtttttact900ttgagcttaattggagcagacaaatagaggtgacctctaactgttttcttcctgaagcca960ttttcagggcagaagtgctttacccacttcattgagaaaccacctttgcatgcagtaccc1020tgagctgtcttcagcacaccaagcatccacaacatgggaaataccgtgctttaaatgttg1080ctttaatcacagtgctcatgagtaagggcatgtcctgtctcttatccatgaaaacactcc1140cacaaaatgaagtcacacccagtatctgttaacggagatactgagtgggtgaagaagact1200cattccctaatgcaattcaggtcacacagggtaaaaaagaaaaaaaaatccttttctgtt1260gaggatacagatggagagaaaatggaaaatgcctttcaggaagcacaagcctagttttct1320aattgtgtttcagtgaacacgcaggtgaacttacctgtgtggcttggtattgtggtgggt1380tttcagcttcttctccaccaaatcctttgaaaagcagcagtggcagaaacaaataaccca1440attaaaaacaataatagcaacaataaaaaaagaaaagatgcagctggaaacctaggagca1500gaagcccagcataaagatctctgaaagcctggatgcgtggattcctctcttacttcccaa1560aacggtggggtggaaatgtgaatatcagcatgatgcacagatctctgcagatgtccagcg1620aactgaatttctagacgctataatctatgttctttcccaacccccacttcagtttacata1680tcgcaggccatagatcctgtttgttgaaaagcgatcagctagaaaacaagagtggttata1740acctgtgctgcccagtgatcaggaaaagagagcggatgaaacttccatgactttctgtta1800gtctgattaatatccatgccaaatgtaagattagttaaaaggccttattgcttcccacca1860aaatgttccttcactagctatatactacactgaaatgtaaagttatgggtatgtttaaca1920gtttaatttgtcagtgggcatccaactcttctatttgtgtttttactttgagcttaattg1980gagcagacaaatagaggtgacctctaactgttttcttcctgaagccattttcagggcaga2040agtgctttacccacttcattgagaaaccacctttgcatgcagtaccctgagctgtcttca2100gcacaccaagcatccacaacatgggaaataccgtgctttaaatgttgctttaatcacagt2160gctcatgagtaagggcatgtcctgtctcttatccatgaaaacactcccacaaaatgaagt2220cacacccagtatctgttaacggagatactgagtgggtgaagaagactcattccctaatgc2280aattcaggtcacacagggtaaaaaagaaaaaaaaatccttttctgttgaggatacagatg2340gagagaaaatggaaaatgcctttcaggaagcacaagcctagttttctaattgtgtttcag2400tgaacacgcaggtgaacttacctgtgtggcttggtattgtggtgggttttcagcttcttc2460tccaccaaatcctttgaaaagcagcagtggcagaaacaaataacccaattaaaaacaata2520atagcaacaataaaaaaagaaaagatgaagaaa2553<210>2<211>20<212>dna<213>人工合成<400>2ttctcttgcattccacccgg20<210>3<211>24<212>dna<213>人工合成<400>3ccagctgctttttacatatctgca24<210>4<211>20<212>dna<213>人工合成<400>4cctccatcactgcttccctg20<210>5<211>20<212>dna<213>人工合成<400>5cccagagaagccatgacagg20当前第1页12