本发明属于多肽药物合成的技术领域，具体是一种利拉鲁肽的合成方法。
背景技术
利拉鲁肽，多肽序列为haegtftsdvssylegqaak(gamae-pal)efiawlvrgrg，分子量为3751.20da。利拉鲁肽是通过基因重组技术，利用酵母生产的人胰高糖素样肽-1(glp-1)类似物，具有降低血糖、减轻体重、促进胰岛细胞再生以及心血管系统保护等多种效应，临床应用前景广阔。
现有的利拉鲁肽生产方法及缺陷如下：
1、基因工程法，由于利拉鲁肽是一个具有支链修饰的非天然活性多肽，所以生产技术难度极大，设备要求高，大规模生产风险大，成本高，不利于工业化生产。
2、固液合成法，需经过片段固相合成、全保护切割、全保护片段纯化、片段缩合等几个不同的阶段，生产周期长。同时由于片段是全保护多肽，非常疏水，所以大大的增加了纯化的难度。这就给大规模生产带来了周期长，成本高的问题。
3、cn102286092a的发明报道的fmoc-lys(alloc)-oh方法，由于所采用的是先液相合成支链化合物(palmitoyl-glu-otbu)，同样也需要进行反复纯化的问题。选择fmoc-lys(alloc)-oh作为侧链修饰用保护氨基酸的方法所带来的弊端，在脱alloc保护时对生产设备和生产环境带来了更高的要求以及更长的生产周期，主要表现在以下几个方面：1)由于脱alloc保护基要用到的四三苯基膦钯对空气、光、热等非常敏感，反应要求在无空气、避光的条件下才能有效的进行；2)要求对保护肽树脂在高真空的条件下40℃加热干燥4小时；3)试剂四三苯基膦钯价格昂贵，所需反应时间长(长达2小时)，并且需要在氩气的保护下进行；4)由于反应是在封闭的状态下进行，取样困难，不利于中控，对大规模工业化生产带来了很大的风险。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利拉鲁肽的合成方法，该合成方法反应条件温和、反应效率高、成本低、具有生产利拉鲁肽粗肽产品的广泛应用前景,以用于大规模生产利拉鲁肽。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
1、一种利拉鲁肽的合成方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
(1)以2-cl-trt树脂为固相载体，经活化剂和缩合剂的缩合反应，并采用特异性微波技术反应，以fmoc-保护氨基酸为缩合原料，依次缩合利拉鲁肽氨基酸序列中相对应的氨基酸，其中赖氨酸采用fmoc-lys(dde)-oh，得到fmoc-利拉鲁肽ⅰ-2-cl-trt树脂，如下式所示：
fmoc-h(trt)ae(otbu)gt(tbu)ft(tbu)s(tbu)d(otbu)vs(tbu)s(tbu)y(tbu)le(otbu)gq(trt)aak(dde)e(otbu)fiaw(boc)lvr(pbf)gr(pbf)g-2-cl-trt树脂；
(2)脱除赖氨酸的侧链保护基dde，通过固相合成法，在赖氨酸侧链偶联fmoc-glu(otbu)-oh，并在谷氨酸侧链上连接棕榈酸，得到利拉鲁肽ⅱ-2-cl-trt树脂，如下式所示：
boc-h(trt)ae(otbu)gt(tbu)ft(tbu)s(tbu)d(otbu)vs(tbu)s(tbu)y(tbu)le(otbu)gq(trt)aak(gamae-pal)e(otbu)fiaw(boc)lvr(pbf)gr(pbf)g-2-cl-trt树脂；
(3)裂解，脱除保护基和树脂得到利拉鲁肽粗肽；利拉鲁肽粗肽产品如下式所示：
haegtftsdvssylegqaak(gamae-pal)efiawlvrgrg；
(4)纯化，冻干，转盐，冻干，得到利拉鲁肽醋酸盐。
进一步，步骤(1)中所述的2-cl-trt树脂的取代度为0.66mmol/g。
进一步，步骤(1)中缩合反应过程中以dic/hobt为活化剂和缩合剂，缩合反应时间为20-30min。
进一步，步骤(1)中在氨基酸的缩合反应步骤，缩合反应15min后，将fmoc-利拉鲁肽-2-cl-trt树脂使用特异性的微波合成反应15-20s，微波输出功率150w-200w。
进一步，步骤(1)中缩合的fmoc-保护氨基酸为：fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-lys(dde)-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-his(trt)-oh，缩合反应中氨基酸投料量为2倍所投树脂摩尔数，缩合反应温度为25-30℃。
进一步，步骤(2)所述脱除赖氨酸的侧链保护基dde的脱除反应，脱除试剂为水合肼：dmf＝1:15体积比的混合溶液，反应液体积为反应器容积的1/3-1/2。
进一步，步骤(4)所述转盐具体为：将50-60mg冻干的利拉鲁肽粗肽溶解在6-7ml体积分数为0.2-0.4％的醋酸水溶液中，然后加入到250-300mg强阴离子树脂中，磁力搅拌器上室温下反应1-1.5小时，过滤，收集滤液，树脂用1-2ml体积分数为0.2-0.4％醋酸水溶液洗涤3次，收集洗脱液，与滤液合并。
本发明的有益效果：
本发明采用fmoc固相合成法，以2-cl-tr树脂为固相载体，以dic/hobt为缩合剂，采用特异性微波合成技术，提高了缩合效率。hobt价格便宜，反应效果优良，本发明大大缩短了反应时间，提高了产品的收率，具有可观的经济适用价值和广泛的应用前景。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
fmoc-利拉鲁肽ⅰ-2-cl-trt树脂的合成
1、2-cl-trt树脂的溶胀
称量取代度为0.66mmol/g的2-cl-trt树脂1g，从开口端加入至多肽合成反应器中，取dcm试剂加入至反应器中，使树脂完全浸没在dcm溶剂中，与溶剂充分接触，溶胀0.5h。
2、fmoc-利拉鲁肽ⅰ-2-cl-trt树脂的合成
fmoc-利拉鲁肽ⅰ-2-cl-trt树脂为：
fmoc-h(trt)ae(otbu)gt(tbu)ft(tbu)s(tbu)d(otbu)vs(tbu)s(tbu)y(tbu)le(otbu)gq(trt)aak(dde)e(otbu)fiaw(boc)lvr(pbf)gr(pbf)g-2-cl-trt树脂
本实施例使用的保护氨基酸从树脂起算第1-31个氨基酸相对应的保护氨基酸及分子量如下表所示：
本发明中一些常用的缩写具有以下含义：
fmoc：芴甲氧羰基
dmf：n,n-二甲基甲酰胺
dcm：二氯甲烷
pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰
pip：六氢吡啶
tfa：三氟醋酸
tbu：叔丁基
dic：n,n-二异丙基碳化二亚胺
diea：n,n-二异丙基乙胺
hobt：1-羟基苯并三唑
(1)fmoc-gly-2-cl-trt树脂的合成
称取118.92mgfmoc-gly-oh和122mghobt放于10ml离心管中，加3mldcm将其溶解，再用滴管向溶液中加diea活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应1h。
(2)fmoc-gly-2-cl-trt树脂的封头反应
配制甲醇：diea＝1:1(体积比)的混合液2ml，将其加入到抽干的反应器中，置于30r/min的摇床上摇20min。
(3)树脂的洗涤方法
用真空泵将反应器中的脱保护溶液抽干，然后加入1/3-1/2反应器体积的dmf溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，抽干反应器中溶液再加入dmf洗涤，重复操作3次。
(4)脱除fmoc保护基
加入1/3反应器体积的20％哌啶/dmf脱保护溶液到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇晃反应20min。
(5)保护氨基酸的活化方法
以fmoc-arg(pbf)-gly-2-cl-tr树脂的缩合为例，称取583.9mgfmoc-arg(pbf)-oh和122mghobt放于10ml离心管中，加入3mldmf将其溶解，再用滴管向溶液中加dic活化20s，混合均匀得到活化的保护氨基酸溶液。
(6)fmoc-利拉鲁肽ⅰ-2-cl-trt树脂的合成
将上述活化的保护氨基酸溶液加到抽干的反应器中，再将反应器置于25℃的恒温震荡器中反应30min，然后将反应器置于微波化学反应器中微波反应20s后洗涤。采用上述同样方法，依次缩合第2-31个fmoc-保护氨基酸，即得到fmoc-利拉鲁肽ⅰ-2-cl-trt树脂。
实施例2
利拉鲁肽ⅱ-2-cl-trt树脂的合成
(1)连接boc保护基
多肽连接至最后一个氨基酸缩合成功后，脱除fmoc，洗涤4次，将boc酸酐(mw＝218.25，ρ＝1.02g/cm3)按照第一个氨基酸投料量的三倍物质的量计算体积，diea:dcm＝1:4溶液3ml，溶液混合均匀，加入到反应器中反应20min。
(2)脱除dde保护基
boc接上后用dmf洗4遍后脱dde，按照水合肼：dmf＝1:15配置溶液，每次用三倍树脂体积的混合溶液脱dde，震荡反应5min后用dmf洗涤3次，第3次水合肼溶液脱dde后，dmf洗涤5次。
(3)侧链氨基酸的连接
待脱dde完成后，按固相氨基酸的缩合方法，连接侧链氨基酸fmoc-glu(otbu)-oh，并在谷氨酸侧链上连接棕榈酸，缩合成功后用dmf洗5次，抽干，得到利拉鲁肽ⅱ-2-cl-tr树脂。
实施例3
利拉鲁肽粗肽产品的切割沉降
(1)配置切割试剂
100ml配方为:87.5mltfa+5ml茴香硫醚+5ml水+2.5mledt+5g苯酚，置于棕色试剂瓶中。现配备用，配制量一般为1g树脂加10ml切割试剂。
(2)利拉鲁肽-2-cl-trt树脂的切割
向抽干的反应器中加入切割试剂，置于脱色摇床上摇晃反应1h，速度20r/min。切割结束后，加入约35ml冰乙醚至50ml离心管中，将反应器中溶液经砂芯过滤到冰乙醚中，盖上离心管盖子，上下震荡离心管，混合均匀。将离心管放入离心机中，3000r/min，3min，离心弃上清，重复操作3次得到利拉鲁肽粗肽产品。
实施例4
利拉鲁肽粗肽产品的收率
切割沉降后的粗品呈乳胶状态，其中含有较多的tfa盐和切割试剂，本发明采用c18色谱柱进行除盐，以便计算粗品得率。
将样品溶解并过滤，采用流动相：a0.1％三氟乙酸/水，b0.1％三氟乙酸/乙腈，在214nm下按照如下程序进样分析：
time/minb.cone/％
0.0020
3060
称量冻干后的利拉鲁肽粗肽产品，质量为1075.3mg，经分析计算，粗品纯度为58.3％，粗品收率为87.5％，比现有技术仅60-70％的收率有大幅度提高。
实施例5
分离纯化、冻干、转盐
将利拉鲁肽粗太经过c18进行分离纯化。分析后，确认合格的产品合并冻干。
开启冷冻干燥机，首先，制冷至-50℃，开启真空泵，真空度下降到20左右，开始悬挂冻干瓶。
合管的样品液冻干后，进行qc图谱分析。
转盐：称取250mg的强阴离子交换树脂(阴离子交换树脂,交换当量≥3mg当量/克干树脂,水分：40％-50％，出厂型式：氯型，厂家：天津市巴斯夫化工有限公司)于一沙芯漏斗内，用去离子水浸泡并洗涤3次。再用10％的醋酸水溶液洗涤3次，1％的醋酸水溶液洗涤3次。
将50mg冻干后的多肽溶解在6ml0.3％的醋酸水溶液中，随后加入到强阴离子树脂中，将其置于磁力搅拌器上室温反应1小时，过滤，收集滤液，用1ml0.3％的醋酸水溶液洗涤3次，合并溶液，冻干。
4.6转盐后纯品冻干
分析后，确认合格的产品合并冻干。
开启冷冻干燥机，首先，制冷至-50℃，开启真空泵，真空度下降到20左右，开始悬挂冻干瓶。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。