本发明属于物种鉴定
技术领域：
，具体涉及一种凹尾拟鲿dna条形码序列及其应用。
背景技术：
凹尾拟鲿(pseudobagrusemarginatus)，隶属鲿科(bagridae)，拟鲿属(pseudobagrus)，主要分布于长江中上游的干流及其支流，如金沙江、雅砻江、乌江、青衣江、大渡河、涪江、岷江、嘉陵江等。凹尾拟鲿生活在江河或溪流的底层，一般以小鱼、水生昆虫以及甲壳类等为食。目前，拟鲿属的分类存在较大的问题，属的界定和属下分类较为混乱，因此，有必要对拟鲿属鱼类物种进行有效的鉴定。dna条形码是指生物体内能够代表该物种的、有足够变异的、标准的、易扩增并且相对较短的dna片段，可以快速、准确的进行物种鉴定。线粒体dna的coi基因具有长度适中、进化速率适中和富含系统进行发育信息等特点。在研究中，能够较好地对物种的coi基因片段进行有效扩增。因此，在动物物种分类和鉴定中，coi基因作为条形码应用有很大的潜力。物种鉴定一直是分类学乃至几乎所有生物领域上的研究至关重要的基础步骤。因此，准确的对物种鉴定和分类就显得尤其重要。目前，各国研究者已经开展了从湖泊到海洋不同地理区域的鱼类dna条形码研究计划，研究表明dna条形码在物种鉴定方面具有高效可行性。大量的研究结果显示以coi基因为标记的dna条形码能够准确的对各类动物进行物种鉴定，可以选用coi基因作为各种动物条形码数据库的标准条形码。在实际操作中，往往会遇到标本量较少以及样本保存不完整等问题，这样给传统的物种分类和鉴定研究带来了很大的困难。在现有的技术中心，均没有凹尾拟鲿dna条形码序列以及凹尾拟鲿coi基因作为凹尾拟鲿dna条形码标准检测序列的记载和报道。采用dna条形码结合传统的分类学方法，对物种高效准确的鉴定和分类起着重要的作用。技术实现要素：本发明的目的是提供一种可以作为凹尾拟鲿dna的标准检测序列，能够有效的对凹尾拟鲿物种进行鉴定。本发明所采用的技术方案是：一种凹尾拟鲿dna条形码序列，所述序列为seqidno:1。优选地，所述凹尾拟鲿dna条形码序列为凹尾拟鲿coi(cytochromecoxidasesubuniti，细胞色素c氧化酶亚基i)基因。一种凹尾拟鲿dna条形码标准检测序列的应用，该dna条形码序列可以作为凹尾拟鲿dna的标准检测序列，有效的对凹尾拟鲿物种进行鉴定。本发明具有以下优点：本发明所得到的凹尾拟鲿dna条形码序列可以作为凹尾拟鲿dna的标准检测序列，对凹尾拟鲿物种高效和准确的进行鉴定和分类。在实际工作中，有时要进行鱼卵和鱼苗的物种鉴定，鱼卵很难通过传统的形态学方法进行鉴定，另外处于生长发育期的鱼苗形态特征也还不是很显著，无法通过传统的形态学进行鉴定的时候，这时借助于物种的dna标准条形码，就很容易对该物种的鱼卵和鱼苗进行鉴定。有时在物种鉴定的时候，会遇到样本不完整或残缺不全，也给传统的物种分类和鉴定带来困难，这时借助于物种的dna标准条形码，可以很快的进行准确的鉴定。有时同一属內甚至亚科内的不同物种形态相似，有时会出现同一物种，会错误的把它界定为不同的物种，或者不同的物种，错误的把它界定为同一物种，分类关系混乱，利用该物种的标准条形码可以方便快捷的对其物种进行准确的鉴定。具体实施方式下面利用实施例对本发明做进一步说明:取金沙江水系冯家坪江段的5个凹尾拟鲿样本进行验证。1.dna的提取剪取5mg左右的鱼类肌肉组织，尽可能剪碎，置于1.5ml的离心管中，室温下放置，待乙醇完全挥发干净后采用generay公司的细胞/组织基因组试剂盒进行基因组dna的抽提。2.pcr扩增pcr引物采用coi基因在鲇形目鱼类的通用引物，上、下游引物序列分别为：catf1：tctcaaccaaccataaagacattgg，catr1：tatacttctgggtgcccaaagaatca。pcr反应体系总体积为50μl，采用pcr试剂盒进行pcr扩增，具体成分见表1，pcr反应程序见表2。表1pcr反应体系反应成分体积(μl)灭菌双蒸水22p11p21基因组dna模板12ⅹpcrmix25表2pcr反应程序3.琼脂糖凝胶电泳检测以恒压5v/cm的标准进行对pcr产物进行电泳，当溴酚蓝移到距琼脂糖凝胶前沿约5cm时，停止电泳。取出凝胶，置于eb染色液中浸泡15min，然后用紫外透射仪进行观察。4.序列测定经琼脂糖电泳检测目的条带清晰的pcr产物，用离心柱式pcr产物纯化试剂盒进行目的片段的回收纯化后，送至武汉天一辉远生物科技有限公司进行双向测序。5个金沙江水系冯家坪江段凹尾拟鲿样本验证的结果：测得的3个凹尾拟鲿样本的coi基因片段与凹尾拟鲿dna条形码标准检测序列相似性为100％。cctctacttagtatttggtgcttgagccggaatagttggcacagctcttagcctgttaattcgagccgagctagcccaacccggagcccttctaggggatgaccagatttataacgtcattgttactgctcatgccttcgtcataatcttctttatagtaataccaatcataatcggaggctttggtaactgacttgtaccactaatgattggagcaccagacatagcattcccacgaataaataatataagcttctgactacttccaccctctttcctattgttattatcttcttccggggttgaagctggagcaggtacaggatgaactgtttaccctcctcttgctggaaatctcgcacatgccggggcttctgtcgatttaaccatcttttccctacacctcgcaggtgtatcctctattctaggagctattaattttattacaaccattattaatatgaaaccccctgctatctcccaataccaaactcccctatttgtatgagccgttctaattacagccgtgcttctactattgtccctacccgttctggctgctggcattacaatgctcctaacagaccgtaatcttaatacaacattcttcgaccccgccggaggaggggaccctatcctttatcaacactta测得的2个凹尾拟鲿样本的coi基因片段与凹尾拟鲿dna条形码标准检测序列相似性为99.8％。cctctacttagtatttggtgcttgagccggaatagttggcacagctcttagcctgttaattcgagccgagctagcccaacccggagcccttctaggggatgaccagatttataacgtcattgttactgctcatgccttcgtcataatcttctttatagtaataccaatcataatcggaggctttggtaactgacttgtaccactaatgattggagcaccagacatagcattcccacgaataaataatataagcttctgactacttccaccctctttcctattgttattatcttcttccggggttgaagctggagcaggtacaggatgaactgtttaccctcctcttgctggaactctcgcacatgccggggcttctgtcgatttaaccatcttttccctacacctcgcaggtgtatcctctattctaggagctattaattttattacaaccattattaatatgaaaccccctgctatctcccaataccaaactcccctatttgtatgagccgttctaattacagccgtgcttctactattgtccctacccgttctggctgctggcattacaatgctcctaacagaccgtaatcttaatacaacattcttcgaccccgccggaggaggggaccctatcctttatcaacactta根据测序结果，以上5个样本与凹尾拟鲿dna条形码标准检测序列的核苷酸序列的同源性在98％以上，即可判断这些物种为凹尾拟鲿。本发明所得到的凹尾拟鲿dna条形码序列可以作为凹尾拟鲿dna的标准检测序列，对凹尾拟鲿物种高效和准确的进行鉴定和分类。在实际工作中，有时要进行鱼卵和鱼苗的物种鉴定，鱼卵很难通过传统的形态学方法进行鉴定，另外处于生长发育期的鱼苗形态特征也还不是很显著，无法通过传统的形态学进行鉴定的时候，这时借助于物种的dna标准条形码，就很容易对该物种的鱼卵和鱼苗进行鉴定。有时在物种鉴定的时候，会遇到样本不完整或残缺不全，也给传统的物种分类和鉴定带来困难，这时借助于物种的dna标准条形码，可以很快的进行准确的鉴定。有时同一属內甚至亚科内的不同物种形态相似，有时会出现同一物种，会错误的把它界定为不同的物种，或者不同的物种，错误的把它界定为同一物种，分类关系混乱，利用该物种的标准条形码可以方便快捷的对其物种进行准确的鉴定。最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。序列表<110>江汉大学<120>一种凹尾拟鲿dna条形码序列及其应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>652<212>dna<213>凹尾拟鲿dna条形码序列(pseudobagrusemarginatus)<400>1cctctacttagtatttggtgcttgagccggaatagttggcacagctcttagcctgttaat60tcgagccgagctagcccaacccggagcccttctaggggatgaccagatttataacgtcat120tgttactgctcatgccttcgtcataatcttctttatagtaataccaatcataatcggagg180ctttggtaactgacttgtaccactaatgattggagcaccagacatagcattcccacgaat240aaataatataagcttctgactacttccaccctctttcctattgttattatcttcttccgg300ggttgaagctggagcaggtacaggatgaactgtttaccctcctcttgctggaaatctcgc360acatgccggggcttctgtcgatttaaccatcttttccctacacctcgcaggtgtatcctc420tattctaggagctattaattttattacaaccattattaatatgaaaccccctgctatctc480ccaataccaaactcccctatttgtatgagccgttctaattacagccgtgcttctactatt540gtccctacccgttctggctgctggcattacaatgctcctaacagaccgtaatcttaatac600aacattcttcgaccccgccggaggaggggaccctatcctttatcaacactta652<210>2<211>652<212>dna<213>凹尾拟鲿dna序列(pseudobagrusemarginatus)<400>2cctctacttagtatttggtgcttgagccggaatagttggcacagctcttagcctgttaat60tcgagccgagctagcccaacccggagcccttctaggggatgaccagatttataacgtcat120tgttactgctcatgccttcgtcataatcttctttatagtaataccaatcataatcggagg180ctttggtaactgacttgtaccactaatgattggagcaccagacatagcattcccacgaat240aaataatataagcttctgactacttccaccctctttcctattgttattatcttcttccgg300ggttgaagctggagcaggtacaggatgaactgtttaccctcctcttgctggaaatctcgc360acatgccggggcttctgtcgatttaaccatcttttccctacacctcgcaggtgtatcctc420tattctaggagctattaattttattacaaccattattaatatgaaaccccctgctatctc480ccaataccaaactcccctatttgtatgagccgttctaattacagccgtgcttctactatt540gtccctacccgttctggctgctggcattacaatgctcctaacagaccgtaatcttaatac600aacattcttcgaccccgccggaggaggggaccctatcctttatcaacactta652<210>3<211>652<212>dna<213>凹尾拟鲿dna序列(pseudobagrusemarginatus)<400>3cctctacttagtatttggtgcttgagccggaatagttggcacagctcttagcctgttaat60tcgagccgagctagcccaacccggagcccttctaggggatgaccagatttataacgtcat120tgttactgctcatgccttcgtcataatcttctttatagtaataccaatcataatcggagg180ctttggtaactgacttgtaccactaatgattggagcaccagacatagcattcccacgaat240aaataatataagcttctgactacttccaccctctttcctattgttattatcttcttccgg300ggttgaagctggagcaggtacaggatgaactgtttaccctcctcttgctggaactctcgc360acatgccggggcttctgtcgatttaaccatcttttccctacacctcgcaggtgtatcctc420tattctaggagctattaattttattacaaccattattaatatgaaaccccctgctatctc480ccaataccaaactcccctatttgtatgagccgttctaattacagccgtgcttctactatt540gtccctacccgttctggctgctggcattacaatgctcctaacagaccgtaatcttaatac600aacattcttcgaccccgccggaggaggggaccctatcctttatcaacactta652当前第1页12