基因表达载体Wxb-10T的构建、转基因水稻的制备及引物的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，具体的说，本发明涉及一种利用基因工程手段修改wx基因特定碱基位点，使其编码蛋白（酶）的功能适当下降，利用其调节水稻直链淀粉含量，应用于水稻优良软米品质育种中。

背景技术

水稻（oryzasatival.）是我国重要的粮食作物。稻米品质的评价指标一般包括:碾磨品质、外观品质、营养品质以及蒸煮与食味品质，其中最为关键的便是蒸煮与食味品质（rao等，plantcellreports,2014,33(4):551-564；张昌泉等，中国农业科学，2016,49(22):4267-4283.）。蒸煮与食味品质常规评价指标有直链淀粉含量(amylosecontent,ac),胶稠度(gelconsistency,gc),和糊化温度(gelatinizationtemperature,gt)等（tian等，pnas,2009,106(51):21760.）。淀粉是稻米中最主要的组成部分，一般占胚乳干重的90%左右，因此，稻米的蒸煮与食味品质与胚乳中淀粉的组成、结构密切相关。淀粉在胚乳中是以颗粒形式存在，形状多数呈不规则的多角形，棱角显著，并以复合淀粉类形式存在，呈球形或椭圆形。根据结构差异可将淀粉分为两类，即直链淀粉(amylose)和支链淀粉(amylopectin)。在水稻品质育种中，直链淀粉含量是一个极其重要的指标，它是稻米蒸煮食味品质好坏的决定性因素。具有高直链淀粉含量的稻米蒸煮后表现出干而硬的特性，而较低直链淀粉含量的稻米表现为软而有弹性，适口性较好。

水稻胚乳中的直链淀粉由水稻蜡质基因(waxy,wx)编码的颗粒结合淀粉合成酶(granuleboundstarchsynthaseⅰ,gbssⅰ)催化合成（wang等，theplantjournal,1995,7(4):613-622）。该基因的不同等位变异导致编码的gbssⅰ的含量和活性等存在差异，从而造成了不同品种间稻米的直链淀粉含量的差异(pandey等，biotechnologyadvances,2012,30(6):1697；滕斌等，核农学报，2014,28,10:1760-1764)，因此wx基因对稻米蒸煮食味品质的调控起关键作用。水稻wx基因位于第6号染色体的短臂上，包括13个内含子和14个外显子，编码由609个氨基酸组成的蛋白（wang等，nucleicacidsresearch,1990,18(19):5898）。wx基因存在多个重要的等位变异位点，目前wx^mp和wx^op等位基因是常规软米水稻品种中所广泛使用到的优异基因资源，但这些基因在使用时主要通过杂交和分子标记辅助选择方式进行育种应用，这一过程比较耗时且基因资源相对单一。因此，本领域有待于发展新的技术和方法来创建新的软米材料，进而改良稻米品质。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种培育具中低直链淀粉含量的转基因水稻的方法，该方法获得的稻米具有较好的食味品质表现。本发明构建了水稻wx^b基因的单碱基突变表达载体，将其导入水稻品种日本晴的糯性近等基因系中，通过pcr扩增等技术手段进行检测，结果表明目的基因已经导入至水稻材料中并得到表达。

本发明一种培育优良食味品质转基因软米的方法，是通过在糯稻中表达单碱基突变的表达载体wx^b-10t得以实现。具体是构建wx^b基因的单碱基突变表达载体wx^b-10t，利用农杆菌介导的方法将表达载体导入水稻，获得wx^b-10t表达的转基因水稻。

基因表达载体wx^b-10t专用引物：

seqidno.35’taagctttagatccgctgccgccccgaat3’；

seqidno.45’cgcctgcaaagaacacaagaacacaacatt3’；

seqidno.55’aacaattcaattcagtgcagagatcttccaca3’；

seqidno.65’ccatgacgtcagagcccttctgttcc3’；

seqidno.75’ggaacagaagggctctgacgtcatgg3’；

seqidno.85’tggtacctgaacttgacgtagacagacgtacgata3’。

本发明基因表达载体wx^b-10t的构建方法，包括如下步骤：

（1）以携带wx^b等位基因的水稻dna为模板，以序列seqidno.3和4的引物对，扩增得到序列如seqidno.1的片段；以携带wx^b等位基因的水稻dna为模板，以搭桥序列seqidno.5和6以及序列seqidno.7和8序列的引物对，扩增得到序列如seqidno.2的片段；

（2）构建携带序列seqidno.1和seqidno.2连接在一起的基因表达载体wx^b-10t。

上述序列seqidno.1是水稻wx^b基因的一段序列，包括其自身启动子；seqidno.2是水稻wx^b基因的一段序列，包含wx^b第十外显子115碱基c突变为t的dna序列。

本发明还公开了一种转基因水稻的制备方法，具体通过下述方法获得：

（1）以携带wx^b等位基因的水稻dna为模板，以序列seqidno.3和4的引物对，扩增得到序列如seqidno.1的片段；以携带wx^b等位基因的水稻dna为模板，以搭桥序列seqidno.5和6以及序列seqidno.7和8序列的引物对，扩增得到序列如seqidno.2的片段；

（2）构建携带序列seqidno.1和seqidno.2连接在一起的基因表达载体wx^b-10t；

（3）将步骤（2）的基因表达载体导入糯稻水稻品种中，获得转基因水稻。

扩增产物seqidno.1和seqidno.2是以携带wx^b等位基因的水稻dna为模板进行pcr扩增得到的dna片段；扩增产物seqidno.2是通过搭桥引物扩增得到的在wx^b等位基因基础上第十外显子115碱基c突变为t的dna序列；扩增产物seqidno.1和seqidno.2分别经t/a克隆连接入pmd18-t载体，用hindiii和ncoi双酶切回收片段i；用ncoi和kpni双酶切回收片段ii；将2个目的片段通过双酶切位点hindiii和kpni插入载体pcambia1301得到wx^b-10t基因表达载体。

本发明中所述的wx^b-10t基因表达载体通过根瘤农杆菌介导等转基因方法，将其导入糯稻水稻品种中，获得转基因水稻；相对于携带正常wx^b等位基因的未转化水稻品种，这种转基因水稻稻米具有适当降低的表观直链淀粉含量，具有显著改善的软胶稠，食味品质明显改良。

本发明提供了一种培育具有适度表观直链淀粉含量的转基因软米方法，对转入wx^b-10t表达载体的转基因稻米进行各项品质指标的检测，显示其品质特性发生了一系列变化。该品系与携带野生型wx^b等位基因的日本晴相比，稻米表观直链淀粉含量适度下降，胶稠度显著增加，稻米淀粉粘度值适度下降，食味显著改善。

本发明通过在糯稻中导入对颗粒结合淀粉合成酶gbssi编码基因wx特定核苷酸定点修饰过的水稻表达载体得以实现。以常规粳稻中wx^b等位基因为模板，构建了该等位基因第十外显子处单个核苷酸替换的水稻表达载体wx^b-10t。该载体携带单碱基突变的全长wx^b等位基因序列，利用农杆菌介导的方法，获得了糯稻中转wx^b-10t基因的转基因水稻。通过pcr实验表明，目的基因已经整合到水稻基因组中。选育得到纯合系的转基因水稻，该类转基因水稻稻米直链淀粉含量普遍在12%左右，胶稠度和淀粉黏滞性指标与当下流行的优良食味软米接近，说明该类稻米属于食味品质优良的软米类型。

附图说明

图1是含wx^b-10t表达载体结构的农杆菌双元载体t-dna区的结构。其中rb和lb表示t-dna区的左右边界序列；hindiii和kpni为载体构建过程中目的片段的插如位置；启动子为目的基因自身的启动子区；atg为目的基因的翻译起始密码子；tga为目的基因的终止密码子；camv35s启动子和35spolya分别为花椰菜花叶病毒(camv)的35s的启动子和终止子区；hygromycin(r)为潮霉素抗性基因。

图2是利用pcr技术鉴定转基因水稻。其中wt为亲本对照，其它5个泳道为携带有wx^b-10t构建的转基因系。

图3是含有wx^b-10t载体的纯合转基因水稻及其未转化对照（nip(wx)）和常规携带wx^b等位基因稻米(nip(wx^b))的直链淀粉含量。nip为粳稻日本晴的缩写，1#—4#为转wx^b-10t构建的4个转基因系。其中‘☆☆’表示差异极显著。

图4是含有wx^b-10t载体的纯合转基因水稻及其未转化对照（nip(wx)）和常规携带wx^b等位基因稻米(nip(wx^b))的胶稠度。nip为粳稻日本晴的缩写，1#—4#为转wx^b-10t构建的4个转基因系。其中‘☆☆’表示差异极显著。

图5是含有wx^b-10t载体的纯合转基因水稻及其未转化对照（nip(wx)）和常规携带wx^b等位基因稻米(nip(wx^b))米粉的粘滞性谱。nip为粳稻日本晴的缩写，1#—4#为转wx^b-10t构建的4个转基因系。其中‘☆☆’表示差异极显著。

具体实施方式

通过以下三个实例进一步对本发明进行了说明与定义而并非限制。通过实例，科研人员可以对本发明有更清楚的了解，可以在此基础上对本发明做出一定的变更和修改，以获得不同的研究效果。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。实验过程中涉及到的试剂均为常规试剂，使用均参照产品使用说明书使用。

实施例1dna序列的获得及基因表达载体的构建

根据水稻全基因组信息，获得wx^b等位基因的编码序列后，分两段设计特异性引物对wx^b基因组进行扩增（第一段引物对5’taagctttagatccgctgccgccccgaat3’，seqidno.3；和5’cgcctgcaaagaacacaagaacacaacatt3’,seqidno.4;第二段定点突变引物15’aacaattcaattcagtgcagagatcttccaca3’,seqidno.5;ccatgacgtcagagcccttctgttcc3’,seqidno.6;和定点突变引物25’ggaacagaagggctctgacgtcatgg3’,seqidno.7;5’tggtacctgaacttgacgtagacagacgtacgata3’,seqidno.8）用于wx^b第10外显子功能性碱基的定点替换构建。扩增出的序列如seqidno.1和seqidno.2。

取粳稻日本晴的幼嫩水稻叶片ctab法提取水稻基因组dna，用1μldna作模板，对于第一段序列，直接用对应的引物对（序列seqidno.3和seqidno.4）进行常规pcr扩增。对于第二段序列，首先用定点突变引物对1（序列seqidno.5和seqidno.6）以及定点突变引物对2（序列seqidno.7和seqidno.8）分别进行常规pcr扩增得到pcr产物，其次以两种pcr产物的混合物做模板，以定点突变引物1的上游引物1（seqidno.5）和定点突变引物2的下游引物2（seqidno.8）为引物进行常规pcr扩增，得到片段2。

两个片段分别经t/a克隆连接入pmd18-t载体（购自takara公司，商品序号：6011），筛选阳性克隆送上金斯瑞生物科技有限公司测序。筛选出测序完全正确的阳性克隆。对于第一个片段（seqidno.1）用双酶切（hindiii和ncoⅰ）后在1%琼脂糖凝胶电泳上分离，采用胶回收试剂盒回收目的片段(命名为i)。对于第二个片段（seqidno.2）用双酶切（ncoⅰ和kpni）后在1%琼脂糖凝胶电泳上分离，采用胶回收试剂盒回收目的片段(命名为ii)同时，采用双酶切（hindiii和kpni）消化载体pcambia1301，电泳分离后回收载体片段。将酶切回收的目的基因片段i,ii和pcambia1301载体片段连接，转化入dh5α感受态细胞中；采用酶切和/或pcr技术筛选鉴定连接正确的阳性克隆称为wx^b-10t（图1）。

实施例2含wx^b-10t表达载体转基因水稻的培育与鉴定

水稻组织培养和农杆菌介导的转化程序均按发明人所在实验室已建立的方法进行（刘巧泉等，根癌农杆菌介导的水稻高效转化系统的建立，植物生理学，1998,24(3):259～271）。以日本晴成熟胚为外植体，在n6d2培养基上诱导出愈伤组织作为转化受体，通过农杆菌介导将构建的rna干扰结构导入水稻愈伤组织中；在共培养基n6d2c上共培养3天后，将愈伤组织转入n6d2s1选择培养基筛选14天左右，然后再在n6d2s2选择培养基上进行筛选，根据愈伤实际生长情况调整筛选的次数和天数。获得了较多的抗性愈伤组织，将这些抗性愈伤组织经过预分化后，移入分化培养基中分化再形成小苗，最终得到了大量转基因水稻。为检测目的基因是否整合入转基因水稻植株中，提取转基因水稻单株总dna。以与目的基因紧密连锁的潮霉素抗性基因序列为模板，设计一对引物hyg-f(5’gcttctgcgggcgatttgtgt3’,seqidno.9)和hyg-r(5’ggtcgcggaggctatggatgc3’,seqidno.10)进行pcr扩增分析，挑选阳性植株（图2），让其自交，经过2-3代选育获得纯合转基因系。

实施例3转基因水稻稻米的品质表现

按照农业部颁布的编号为ny147-88的文件方法测定稻米直链淀粉含量，在万分之一天平上准确称取50mg米粉装入50ml试管中，加入0.5ml无水乙醇使样品分散后，再加入4.5ml1.0mol/l的naoh溶液混匀，于沸水浴中20min后冷却至室温，蒸馏水定容。吸取5ml消化液，加入已盛有半瓶蒸馏水的100ml容量瓶中，再加入1.0ml1.0mol/l的乙酸溶液使样品酸化；加入1.5ml0.02％的碘液，用蒸馏水定容，摇匀后静置15min；以4.5ml1n的naoh加入0.5ml的95%乙醇代替样品，配制空白溶液。用空白溶液于分光光度计波长620nm处调节零点并测出有色样品液的吸光度值，最后以标准样品测得的光密度值及其相关的直链淀粉含量制作标准曲线，并根据此计算待测样品的直链淀粉含量。每个样品做3次重复。检测结果如图3所示，转基因系水稻的直链淀粉含量较常规粳稻日本晴（携带正常wx^b基因）稻米显著降低。

按照农业部颁布的编号为ny147-88的文件方法测定稻米直链淀粉含量，在万分之一天平上准确称取精米粉样品100mg，置于10ml试管内，加入0.2ml百里酚蓝指示剂，用振荡器振荡充分润湿样品后，准确加入2.0ml0.2mol/l的氢氧化钾溶液，再次用振荡器振荡；混匀后立即放入剧烈沸腾的水浴锅内，用玻璃球盖住试管口，使沸腾的米胶高度始终维持在试管长度的三分之二左右，糊化8min.。糊化完毕后，取出试管，拿下玻璃球，在室温下冷却5min后再放入冰水浴中冷却20min。在室温25±2℃条件下，将试管平放在平台上，1h后，量出试管底至冷胶前沿的长度，以毫米表示，即为该样品的胶稠度。检测结果如图4所示，转基因系水稻的胶稠度较常规粳稻日本晴（携带正常wx^b基因）极显著增加。

稻米淀粉粘滞性测定按acc（美国谷物化学协会）操作规程（1995）[93]进行（rva仪购自澳大利亚newportscientific仪器公司）。称取含水量为14%的样品3.00g，加入蒸馏水25.00ml。测定过程中罐内的温度变化如下：50℃保持1min，以12℃/min的速度上升到95℃（3.75min），95℃保持2.5min，以12℃/min的速度下降到50℃（3.75min），50℃保持1.4min。搅拌器在起始10s内转动速度为960r/min，以后保持在160r/min。粘滞性(viscosity)值用“cp”作单位表示。数据分析用tcw(thermalcycleforwindows)配套软件进行。分析结果表明，与常规粳稻日本晴（携带正常wx^b基因）相比，转基因稻米的峰值粘度和冷胶粘度显著下降（图5），其预示食味指标的崩解值升高，回复值下降，说明转基因稻米的食味品质较常规粳稻日本晴（携带正常wx^b基因）已经得到明显改善。

<110>扬州大学

<120>基因表达载体wxb-10t的构建、转基因水稻的制备及引物

<160>10

<210>1

<211>3541

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tagatccgctgccgccccgaatcgcccgtgccaccgtcgcaggagaagagatgtgagaga60

gagttgaagagatgggagatgaggggagaggacaggaagaagaggggtgggaatgatacg120

tggggcccacgtgggccccaccattttttattaatttctgggtgaaacttacaagtgggt180

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tcagatcgagaccaagtcaaattagccacgtaggcgccacgtcagccaaaaccgccgtca300

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<213>人工序列

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