本发明涉及多肽leu-his-val-asp-pro-glu-asn在制备抑制二肽基肽酶(dpp-ⅳ，dipeptidylpeptidaseⅳ)及降血糖药物及保健品中的应用。
背景技术：
糖尿病是一种由于体内胰岛素绝对或相对不足而导致的葡萄糖、蛋白质、脂代谢紊乱的综合症。目前,糖尿病已经成为全球性流行病。根据世界卫生组织统计,糖尿病的发病率每年都以一定的幅度在递增。2016年我国糖尿病流行率为9.6％，且随着生活水平的提高，这一数字仍在急剧上升。
二肽基肽酶ⅳ(dpp-ⅳ，dipeptidylpeptidaseⅳ)是一种丝氨酸蛋白酶，该酶的底物包括n端第二位是脯氨酸或丙氨酸残基的多肽。它能从肽链n端水解两个氨基酸残基，能快速有效降解胰高血糖素样肽1(glp-1,glucagon-likepeptide-1),glp-1是胰岛素生成和分泌最有效的刺激剂之一,因此抑制dpp-ⅳ能增强内源性glp-1的作用,从而提高血液中胰岛素的水平,进而降低并维持糖尿病人的血糖水平(bioorgmedchem.2007,15(7):2715-2735)。并且，glp-1调节胰岛素分泌具有严格的血糖浓度依赖性，只有在高血糖条件下glp-1才会提高胰岛素的分泌水平，故dpp-ⅳ抑制剂不存在因服药而引发低血糖的风险(bestpractresclinendocrinolmetab.2009,23(4):479-86)
技术实现要素：
本发明的目的是提供多肽leu-his-val-asp-pro-glu-asn在抑制dpp-ⅳ活性和降血糖中的应用和快速筛选方法；多肽leu-his-val-asp-pro-glu-asn具有dpp-ⅳ抑制活性及降血糖活性，作为高血糖、ii型糖尿病的保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。
为实现上述目的，本发明以所述多肽leu-his-val-asp-pro-glu-asn为抑制dpp-ⅳ活性和降血糖的有效成份。
其具有序列表seqidno：1中氨基酸序列；多肽leu-his-val-asp-pro-glu-asn为dpp-ⅳ抑制剂及降血糖药物及保健品的活性成份，其中可添加药物学上可接受的载体或辅料。
具有抑制dpp-ⅳ活性和降血糖活性的多肽leu-his-val-asp-pro-glu-asn来源于梅花鹿。由于鹿的蛋白库不够完善，总蛋白数量较少，而牛和鹿的基因同源性超过90％(suizg,yuanhm,liangz,etal.talanta,2013,107,189-194.)，因此本实验选择牛科(bovine)作为蛋白数据库。多肽leu-his-val-asp-pro-glu-asn来源于牛科(bovine)蛋白库的beta-aglobinchain蛋白，含7个氨基酸残基，氨基酸序列为leu-his-val-asp-pro-glu-asn，为单链线性结构，白色粉末状，易溶于水，分子量为822da；对dpp-ⅳ活性具有较好的抑制作用，ic50为402±3μm(n＝3，mean±sd)。
多肽leu-his-val-asp-pro-glu-asn具备dpp-ⅳ抑制剂所要求的特征：
dpp-ⅳ抑制肽由至少应含有一个pro残基。多肽leu-his-val-asp-pro-glu-asn含有pro残基，因此满足这一影响活性的条件。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明首次从鹿茸中获得并确定了活性化合物的结构，化合物具有较好的抑制dpp-ⅳ的活性，因此作为治疗高血糖、ii型糖尿病药物的先导化合物具有良好的潜力和应用前景。
具体实施方式
实施例1多肽leu-his-val-asp-pro-glu-asn的制备
采用lc-ms/ms与shotgun蛋白质组学技术相结合的方法。以梅花鹿茸为原料，经酶解蛋白，离心，纯化及lc-ms/ms分析，结合构效关系特征，筛选对dpp-ⅳ具有抑制作用的肽段。
其具体方法如下：
将新鲜梅花鹿茸冷冻干燥后粉碎，加入去离子水使鹿茸浓度为33.3g/l，搅拌均匀后加入鹿茸质量0.5％(w/w)的胰蛋白酶，在40℃下酶解3小时；酶解结束将酶解液过80目筛，残渣同法提取一次。将两次酶解液升温至90℃保温15分钟，分别经8层纱布和200目筛过滤，所得滤液以10000g的速度离心10分钟，收集上清液；上清液经nanodroponec在205nm下测定肽浓度，加水稀释至肽浓度20mg/ml待用；将溶胀后的sephadexg-25medium填料填装成直径2cm、柱高30cm的凝胶柱。将酶解液加载于凝胶柱上，以去离子水为洗脱液、流速3.5ml/min进行洗脱，以床体积的1/20为一个流份，洗脱2个床体积，收集全部40个流份并经nanodroponec在205nm下测定肽浓度。根据肽浓度合并第16至第25个流份，冷冻干燥，得到鹿茸提取物。
将鹿茸提取物用ltqorbitrapvelos进行质谱分析：将鹿茸提取物用0.1％(v/v)甲酸水溶液复溶成0.4mg/ml的溶液，进行lc-ms/ms分析。将毛细管的一端拉成内径约为5μm的尖端，通过气压将c18aq填料压入柱内，填充柱长度约15cm。将毛细管的尖端与质谱相连。所用的流动相a为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流动相b为0.1％甲酸的乙腈溶液，线性梯度洗脱过程为：0％b(0min)—2％b(2min)—25％b(87min)—35％b(97min)—90％b(99min)—90％b(109min)—2％b(110min)—2％b(120min)。流速60μl/min。
设置离子传输毛细管的温度200℃，电喷雾电压1.8kv，归一化碰撞能量35.0％。均使用数据依赖模式(data-dependentmode)对ms和ms/ms进行图谱采集。质谱扫描条件设定为：从每次m/z＝400～2000的全扫描中选择10个最高丰度离子峰进行ms/ms扫描，其中动态排除(dynamicexclusion)设置为：重复次数(repeatcount)为2，重复容忍时间(repeatduration)30s，动态排除时间(exclusionduration)90s。利用xcalibur软件(version2.2，thermo)进行系统控制和数据收集。
将采集的*.raw文件数据用thermoproteomediscovererdaemon(v1.4)转换成*.mgf格式，再用mascot(version2.3.0，matrixscience，london，uk)于牛科数据库(bovine，蛋白数目17890，下载自http://www.uniprot.org/),进行检索，检索参数如下：不设置酶切位点、最大漏切数和固定修饰；蛋氨酸残基、脯氨酸残基加15.9949da的可变修饰；母离子的质量容忍度(peptidetolerance)为20ppm，碎片离子的质量容忍度(fragmentionstolerance)为0.8da。导出肽段结果时设置score>25,调整显著性差异p使肽段假阳性率(fdr，falsediscoveryrate)控制在1％内。鉴定结果见附表一。结合构效关系进行筛选，获得序列为leu-his-val-asp-pro-glu-asn的多肽。
实施例2多肽leu-his-val-asp-pro-glu-asn的dpp-ⅳ抑制活性检测
原理
对于n端为x-pro、x-ala的肽段，dpp-ⅳ可将该二肽选择性切除，glp-1具有x-ala结构，因此dpp-ⅳ可导致超过95％的glp-1发生降解。本方法采用gly-pro-p-nitroanilide代替glp-1作为dpp-ⅳ的模拟底物，dpp-ⅳ切下gly-pro后，生成的对硝基苯胺在405nm有特征吸收峰，由此可计算dpp-ⅳ的抑制活性。
实验方法：
实验所用多肽leu-his-val-asp-pro-glu-asn由南京杰肽生物科技有限公司合成，纯度>95％。将多肽leu-his-val-asp-pro-glu-asn溶解于100mm的tris-hcl缓冲液(ph＝8.0)，向96孔板加入25μl的leu-his-val-asp-pro-glu-asn溶液和25μl1.59mm的gly-pro-p-nitroanilide溶液(用相同缓冲液配置，下同)，混匀，于37℃温育10分钟，再加入50μl0.01u/ml的dpp-ⅳ溶液，混匀后于37℃温育60分钟，加入100μl1m的醋酸-醋酸钠缓冲液(ph4.0)使反应终止，用酶标仪测定405nm吸光度。control组用等体积的tris-hcl缓冲液代替leu-his-val-asp-pro-glu-asn溶液，blank组用等体积的tris-hcl缓冲液代替leu-his-val-asp-pro-glu-asn溶液和dpp-ⅳ溶液。
分别配制浓度0.5、0.25、0.1、0.05mm的多肽leu-his-val-asp-pro-glu-asn溶液，按上述方法进行dpp-ⅳ抑制活性检测。dpp-ⅳ抑制率计算公式：
其中i％表示抑制率，a多肽表示leu-his-val-asp-pro-glu-asn吸光度值，acontrol表示阴性对照组吸光度值，ablank表示空白组吸光度值。结果如表一所示：
表一不同浓度的leu-his-val-asp-pro-glu-asn对dpp-iv的抑制率
由表一可知，多肽leu-his-val-asp-pro-glu-asn对dpp-iv的半数抑制浓度(ic50)为402±3μm(mean±sd，n＝3)
多肽leu-his-val-asp-pro-glu-asn具有dpp-ⅳ抑制活性及降血糖活性，作为高血糖、ii型糖尿病的保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。
附表：鹿茸提取物经lc-ms/ms鉴定的肽段
以tgtpglpgppgpmgppgdr为例：肽段的修饰种类为oxidation(m)；3pro(o)(p)，表明该肽段有1处甲硫氨酸氧化修饰和3处脯氨酸羟基修饰。肽段的修饰位置为0.0002002000001002000.0，表示该肽段的3处脯氨酸羟基修饰位于第4、7、16位残基，甲硫氨酸氧化修饰位于第13位残基。
附表一的序列所涉及的氨基酸均为氨基酸的简写，各氨基酸缩写、简写及名称见附表二。
附表二氨基酸名称、缩写与简写
序列表
<110>中国科学院大连化学物理研究所
<120>一种多肽及其应用和dpp-ⅳ抑制剂或降血糖药物
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>7
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
leuhisvalaspprogluasn
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