本发明涉及一种重组大肠杆菌及其参与的l-高丝氨酸的发酵生产方法。
背景技术：
l-高丝氨酸不仅作为微生物体内苏氨酸、甲硫氨酸和胱硫醚等生物合成的重要中间体，可以通过酶反应转化为其它重要化工中间体，例如l-高丝氨酸是手性除草剂l-草铵膦合成过程中重要的中间体。l-蛋氨酸是生物生长的必需氨基酸，生物体细胞膜上分布有与l-蛋氨酸运输相关蛋白，e.coli中存在metd和metp两类专一性蛋氨酸内运输系统，metd对蛋氨酸的亲和力高，metp亲和力相对较低。而l-蛋氨酸营养缺陷型菌株会给造成细胞饥饿的环境，迫使细胞提高对环境中碳源的摄取和利用，例如葡萄糖。因此敲除meti以实现l-蛋氨酸内运系统metd的部分失活，metd操纵子包含metn、meti和metq，分别编码abc转运蛋白元件的atpase、蛋氨酸渗透酶、蛋氨酸结合蛋白。微生物体内由metb基因编码的胱硫醚γ合成酶可以将o-琥珀酰-l-高丝氨酸分解生成半胱氨酸，而半胱氨酸是生物体内合成甲硫氨酸的前体，而meta基因编码的高丝氨酸o-琥珀酰基转移酶，通过高丝氨酸-γ-羟基的激活及将琥珀酰-coa的酰基转移至高丝氨酸上合成o-琥珀酰-l-高丝氨酸，为了使l-高丝氨酸能大量积累，需要对meta基因进行敲除。天冬氨酸是ecoli合成l-高丝氨酸的重要前体物质，同时也是苏氨酸、异亮氨酸、赖氨酸及支链氨基酸的合成前体。从天冬氨酸到高丝氨酸的生物合成需要经过四步反应，其中thra和metl编码的高丝氨酸脱氢酶和天冬氨酸激酶ii属于双功能酶，除了具有天冬氨酸激酶活性，同时还有高丝氨酸脱氢酶活性，催化天冬氨酸-半醛还原成高丝氨酸。thra、metl、lysc、asd等基因转录水平都受负调控转录因子metj的调节，因此，需要对metj基因进行敲除。l-苏氨酸的生物合成以l-高丝氨酸为前体物质，经过thrb和thrc基因编码的高丝氨酸激酶和苏氨酸合成酶催化得到，而l-高丝氨酸作为l-苏氨酸合成的前体物质，l-苏氨酸的合成会消耗大量的l-高丝氨酸，因此有必要阻断或降低l-苏氨酸的合成代谢通量。此外，由rhta基因编码的外运因子负责将l-高丝氨酸向胞外运输，而tdcc基因负责将l-高丝氨酸和l-苏氨酸等的摄取吸收。因此需要增强负责外运基因的表达，敲除负责产物内运的基因。技术实现要素：本发明的目的是通过代谢工程手段改造大肠杆菌以获得高产l-高丝氨酸的重组大肠杆菌菌株及在产l-高丝氨酸中的应用。本发明采用的技术方案是：本发明提供一种高产l-高丝氨酸的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是将大肠杆菌(优选ecoliw3110)中编码l-蛋氨酸运输蛋白的meti基因、编码负调控阻遏因子的metj基因、编码胱硫醚γ合成酶的metb基因、编码高丝氨酸激酶的thrb基因、编码高丝氨酸-o-琥珀酰基转移酶的meta基因和编码l-高丝氨酸内运蛋白的tdcc基因依次敲除后，再分别将编码高丝氨酸脱氢酶i的thra基因、编码高丝氨酸脱氢酶ii的metl基因和编码l-高丝氨酸外运蛋白的rhta基因的启动子均替换为ptrc启动子获得的。进一步，所述ptrc启动子核苷酸序列为seqidno.22所示。进一步，所述meti基因核苷酸序列为seqidno.1所示、metj基因核苷酸序列为seqidno.3所示、metb基因核苷酸序列为seqidno.5所示、thrb基因核苷酸序列为seqidno.7所示、meta基因核苷酸序列为seqidno.9所示、tdcc基因核苷酸序列为seqidno.11所示。本发明还提供一种所述高产l-高丝氨酸的重组大肠杆菌在发酵产l-高丝氨酸中的应用，所述应用是将所述的重组大肠杆菌接种至发酵培养基，在30℃、180-200rpm条件下发酵培养，将培养液分离纯化，获得l-高丝氨酸。进一步，所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖40g/l、磷酸二氢钾2g/l、硫酸铵17g/l、酵母粉4g/l、碳酸钙30g/l(用于调节ph)、l-苏氨酸0.2g/l、维生素b10.0001g/l、mgso42g/l、feso40.005g/l、mnso40.005g/l、znso40.005g/l，溶剂为去离子水，ph值6.8。进一步，所述重组大肠杆菌发酵培养前先进行斜面活化和种子培养，将种子液以体积浓度5％的接种量接种至发酵培养基，所述斜面活化方法为：将重组大肠杆菌接种在lb平板上，在37℃培养过夜，获得斜面菌体；所述种子培养方法为：挑取斜面菌体单菌落接种至lb液体培养基中，在37℃、200rpm的条件下培养过夜，获得种子液。所述发酵培养在发酵罐中进行，通过添加补料培养基控制发酵罐中葡萄糖浓度2-10g/l；发酵条件为do水平在30％，搅拌转速200-600rpm，通气速率控制在1-2vvm；发酵过程中控制培养温度在30℃并用体积浓度50％的氨水调节ph在6.8～7.0的范围。发酵罐中培养基组成为：葡萄糖40g/l、磷酸二氢钾2g/l、硫酸铵17g/l、酵母粉4g/l、l-苏氨酸0.2g/l、l-蛋氨酸0.2g/l、l-异亮氨酸0.2g/l、维生素b10.0001g/l、mgso42g/l、feso40.005g/l、mnso40.005g/l、znso40.005g/l，溶剂为去离子水，ph值6.8；所述补料培养基组成为：葡萄糖500g/l、磷酸二氢钾12.5g/l、l-苏氨酸0.2g/l、l-蛋氨酸0.2g/l、l-异亮氨酸0.2g/l，溶剂为水。本发明通过敲除ecoliw3110中表达负调控转录因子metj的基因，以解除其对l-高丝氨酸合成代谢路径中相关基因(thra、metl、lysc、asd等)的阻遏抑制作用；通过中断meti以实现l-蛋氨酸输入系统metd的部分失活，并且敲除metb基因阻断了o-琥珀酰-l-高丝氨酸代谢去路中metb基因的表达，以降低胞内l-蛋氨酸的含量从而形成该必需氨基酸的饥饿环境，使得细胞能够更快地摄取并利用葡萄糖等碳源；在代谢通路中用ptrc启动子替换了metl和thra原位启动子序列，以提高天冬氨酸激酶ii和高丝氨酸脱氢酶的表达；同时敲除l-高丝氨酸的代谢分解途径中meta基因和thrb基因，以减少l-高丝氨酸向支路氨基酸的代谢去路。此外，通过增强负责l-高丝氨酸外运的基因rhta基因的表达，将胞内合成的产物及时运送至胞外，敲除负责l-高丝氨酸吸收的tdcc基因，以实现胞外积累l-高丝氨酸的目的。由通过以上改造策略的组合，本发明成功获得了高产l-高丝氨酸的重组大肠杆菌菌株。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种利用代谢工程改造的高产l-高丝氨酸的重组大肠杆菌，经过改造后的重组大肠杆菌相比于野生型能够更好的利用葡萄糖等碳源物质进行l-高丝氨酸的生产，经过改造后性能最优的菌株在发酵生产l-高丝氨酸的水平相比于野生型的菌株从0g/l提高到11.2g/l。本发明重组大肠杆菌可以将l-高丝氨酸运送至胞外并在环境中逐渐积累，可以较好维持胞内l-蛋氨酸含量以适当维持胞内必需氨基酸饥饿环境的方法，并且以该前体生产工业上重要的化合物。具体实施方式下面结合具体实例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。本发明所使用的“饥饿环境”指的是维持胞内较低浓度的l-蛋氨酸。术语“增强”指的是增加由对应的多核苷酸编码的酶的活性。可以通过基因的过表达或替换基因组上该基因的表达调控序列(启动子替换等)。lb液体培养基组成：蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、氯化钠10g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。lb平板是在lb液体培养基中添加终浓度2g/l琼脂。实施例1基于野生型大肠杆菌菌株的代谢改造(1)meti基因的敲除为了阻断meti以实现l-蛋氨酸输入系统metd的部分失活，使其减少l-蛋氨酸的摄入以降低胞内l-蛋氨酸的浓度，因此对野生型菌株中的meti基因进行了敲除，参见jiangy,chenb,duanc,etal.multigeneeditingintheescherichiacoligenomeviathecrispr-cas9system[j].applied&environmentalmicrobiology,2015,81(7):2506.。通过crispr-cas9系统编辑野生型大肠杆菌(escherichiacoli)w3110(购自大肠杆菌遗传育种中心thecoligeneticstockcenter)基因组中编码l-蛋氨酸运输系统的meti基因(核苷酸序列为seqidno.1所示)，具体为：通过pcr使用引物1和引物2，以ptargetf载体为模板，构建能够表达靶定目的基因meti的sgrna的ptarget-δmeti突变载体。pcr反应条件如下：95℃5min；95℃15s，55℃15s，72℃2min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将pcr产物用dpni于37℃处理3h，灭活后转化至e.colibl21(de3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/l盐酸壮观霉素抗性的lb固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/l盐酸壮观霉素抗性的lb液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得ptarget-δmeti载体。通过pcr使用引物3和引物4，以大肠杆菌escherichiacoliw3110基因组为模板扩增得到meti基因上游同源片段，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法使用引物5和引物6扩增得到meti基因下游同源片段，pcr产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。将回收的两个dna片段使用引物3和引物6进行融合pcr，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，重复30个循环；72℃继续延伸10min，pcr产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段(核苷酸序列为seqidno.2所示)。将ptarget-δmeti载体和回收的dna片段一同电转化至含有pcas9载体的escherichiacoliw3110菌株。为了电穿孔，转化有pcas9载体的escherichiacoliw3110菌株在含有50mg/l的卡那霉素和10mml-阿拉伯糖的lb培养基中在30℃下培养，直到od600达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5kv下进行。将电转化后的菌液涂至含有50mg/l的卡那霉素和50mg/l的盐酸壮观霉素抗性的lb平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物7和引物8进行pcr，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在1000bp的dna条带确认meti基因的缺失。将通过此确认的菌株在含有50mg/l的卡那霉素和5mmiptg的lb培养基中在30℃下培养过夜以去除ptarget-δmeti载体。然后将已经去除ptarget-δmeti载体的菌株在lb培养基中在37℃下培养过夜以去除pcas载体。如此构建的菌株记为大肠杆菌w3110δmeti。表1所用引物序列引物1taatactagtctacatcggctataacgcgagttttagagctagaaatagc引物2gctctaaaactcgcgttatagccgatgtagactagtattatacctaggac引物3gacacgttctattctcgaac引物4gtgttgaacgaacccagtacctctactttt引物5gtactgggttcgttcaacacaacataaata引物6aagcccactttttgcagcag引物7tactgtttttggcaacgtgg引物8tggacgaatttcttcacgtt(2)metj基因的敲除为了去除负调控转录因子metj对thra、metl、lysc、asd等基因转录水平的阻遏抑制作用，对大肠杆菌w3110δmeti菌株中的metj基因进行了敲除。通过crispr-cas9系统编辑w3110δmeti菌株基因组中编码负调控转录因子的metj基因(核苷酸序列为seqidno.3所示)。通过pcr使用引物9和引物10，以ptargetf载体作为模板构建能够表达靶定目的基因metj的sgrna的ptarget-δmetj突变载体。pcr反应条件如下：95℃5min；95℃15s，55℃15s，72℃2min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将pcr产物用dpni于37℃处理3h，灭活后转化至e.colibl21(de3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/l盐酸壮观霉素抗性的lb固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/l盐酸壮观霉素抗性的lb液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得ptarget-δmetj载体。通过pcr使用引物11和引物12，以大肠杆菌escherichiacoliw3110基因组为模板扩增得到metj基因上游同源片段，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法使用引物13和引物14扩增得到meti基因下游同源片段，pcr产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。将回收的两个dna片段使用引物11和引物14进行融合pcr，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，重复30个循环；72℃继续延伸10min，pcr产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段(核苷酸序列为seqidno.4所示)。将ptarget-δmetj载体和回收的dna片段一同电转化至含有pcas9载体的w3110δmeti菌株。为了电穿孔，转化有pcas9载体的w3110δmeti菌株在含有50mg/l的卡那霉素和10mml-阿拉伯糖的lb培养基中在30℃下培养，直到od600达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5kv下进行。将电转化后的菌液涂至含有50mg/l的卡那霉素和50mg/l的盐酸壮观霉素抗性的lb平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物15和引物16进行pcr，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在1000bp的dna条带确认metj基因的缺失。将通过此确认的菌株在含有50mg/l的卡那霉素和5mmiptg的lb培养基中在30℃下培养过夜以去除ptarget-δmetj载体。然后将已经去除ptarget-δmetj载体的菌株在lb培养基中在37℃下培养过夜以去除pcas载体。如此构建的菌株记为w3110δmetiδmetj。表2引物序列引物9taatactagtatctgcgtaaagagcgcagcgttttagagctagaaatagc引物10gctctaaaacgctgcgctctttacgcagatactagtattatacctaggac引物11atgccggtattagtaagtac引物12cttttttgctgagatacttaatcctcttcg引物13taagtatctcagcaaaaaagagcggcgcgg引物14ttttgccgtttgcgccagtt引物15gtaccagtttgggtttttct引物16gaatattcttgccgtaacgt(3)metb基因的敲除为了阻断o-琥珀酰-l-高丝氨酸的降解代谢路径，通过敲除编码的胱硫醚γ合成酶的metb基因，破坏了o-琥珀酰-l-高丝氨酸分解代谢合成半胱氨酸的过程，进一步控制胞内l-蛋氨酸的适宜浓度，因此在w3110δmetiδmetj菌种中对metb基因实施敲除。通过crispr-cas9系统编辑w3110δmetiδmetj菌株基因组中编码胱硫醚γ合成酶的metb基因。通过pcr使用引物17和引物18，以及ptargetf载体作为模板构建能够表达靶定目的基因metb(核苷酸序列为seqidno.5所示)的sgrna的ptarget-δmetb突变载体。pcr反应条件如下：95℃5min；95℃15s，55℃15s，72℃2min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将pcr产物用dpni于37℃处理3h，灭活后转化至e.colibl21(de3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/l盐酸壮观霉素抗性的lb固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/l盐酸壮观霉素抗性的lb液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得ptarget-δmetb载体。通过pcr使用引物19和引物20，以w3110δmetiδmetj菌株的基因组为模板扩增得到metb基因上游同源片段，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法使用引物21和引物22扩增得到metb基因下游同源片段，pcr产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段(核苷酸序列为seqidno.6所示)。将回收的两个dna片段使用引物19和引物22进行融合pcr，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，重复30个循环；72℃继续延伸10min，pcr产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段。将ptarget-δmetb载体和回收的dna片段一同电转化至含有pcas9载体的w3110δmetiδmetj菌株。为了电穿孔，转化有pcas9载体的w3110δmetiδmetj菌株在含有50mg/l的卡那霉素和10mml-阿拉伯糖的lb培养基中在30℃下培养，直到od600达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5kv下进行。将电转化后的菌液涂至含有50mg/l的卡那霉素和50mg/l的盐酸壮观霉素抗性的lb平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物23和引物24进行pcr，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在1000bp的dna条带确认metb基因的缺失。将通过此确认的菌株在含有50mg/l的卡那霉素和5mmiptg的lb培养基中在30℃下培养过夜以去除ptarget-δmetb载体。然后将已经去除ptarget-δmetb载体的菌株在lb培养基中在37℃下培养过夜以去除pcas载体。如此构建的菌株记为w3110δmetiδmetjδmetb。表3引物序列引物17taatactagtttcgacagtctggcgaaacggttttagagctagaaatagc引物18gctctaaaaccgtttcgccagactgtcgaaactagtattatacctaggac引物19gctttactttgcgatgagcg引物20acactcatttgtgatgaagttccctgggct引物21acttcatcacaaatgagtgtgattgcgcag引物22cagctgttgcagcaacgggt引物23tgagcggggtgtatttcacc引物24atttgtgtcgcggaatagtc(4)thrb基因的敲除为了增加l-高丝氨酸的积累，需要阻断l-高丝氨酸的代谢去路，而胞内的l-高丝氨酸经过thrb基因和thrc基因编码的高丝氨酸激酶和苏氨酸合成酶代谢合成l-苏氨酸。因此，对w3110δmetiδmetjδmetb菌株中的thrb基因进行敲除。通过crispr-cas9系统对w3110δmetiδmetjδmetb菌株基因组中编码高丝氨酸激酶的thrb基因进行编辑。通过pcr使用引物25和引物26，以及ptargetf载体作为模板构建能够表达靶定目的基因thrb(核苷酸序列为seqidno.7所示)的sgrna的ptarget-δthrb突变载体。pcr反应条件如下：95℃5min；95℃15s，55℃15s，72℃2min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将pcr产物用dpni于37℃处理3h，灭活后转化至e.colibl21(de3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/l盐酸壮观霉素抗性的lb固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/l盐酸壮观霉素抗性的lb液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得ptarget-δthrb载体。通过pcr使用引物27和引物28，以w3110δmetiδmetjδmetb菌株的基因组为模板扩增得到thrb基因上游同源片段，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法使用引物29和引物30扩增得到thrb基因下游同源片段，pcr产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。将回收的两个dna片段使用引物27和引物30进行融合pcr，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，重复30个循环；72℃继续延伸10min，pcr产物用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段(核苷酸序列为seqidno.8所示)。将ptarget-δthrb载体和回收的dna片段一同电转化至含有pcas9载体的w3110δmetiδmetjδmetb菌株。为了电穿孔，转化有pcas9载体的w3110δmetiδmetjδmetb菌株在含有50mg/l的卡那霉素和10mml-阿拉伯糖的lb培养基中在30℃下培养，直到od600达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5kv下进行。将电转化后的菌液涂至含有50mg/l的卡那霉素和50mg/l的盐酸壮观霉素抗性的lb平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物31和引物32进行pcr，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在1000bp的dna条带确认thrb基因的缺失。将通过此确认的菌株在含有50mg/l的卡那霉素和5mmiptg的lb培养基中在30℃下培养过夜以去除ptarget-δthrb载体。然后将已经去除ptarget-δthrb载体的菌株在lb培养基中在37℃下培养过夜以去除pcas载体。如此构建的菌株记为w3110δmetiδmetjδmetbδthrb。表4引物序列引物25taatactagtataagctgccgtcagaaccagttttagagctagaaatagc引物26gctctaaaactggttctgacggcagcttatactagtattatacctaggac引物27tgctcaatgcaggtgatgaa引物28agagtttcatgtcagactcctaacttccat引物29ggagtctgacatgaaactctacaatctgaa引物30ttcatcatcaaacgcctgct引物31gttgtcacgccgaacaaaaa引物32accgagacaaccagctggtt(5)meta基因的敲除为了进一步增加l-高丝氨酸的生物合成，需要阻断l-高丝氨酸的另外一条代谢去路，即胞内的l-高丝氨酸经过meta基因编码的高丝氨酸o-琥珀酰基转移酶催化合成o-琥珀酰-l-高丝氨酸。因此，对w3110δmetiδmetjδmetbδthrb菌株中的meta基因进行敲除。通过crispr-cas9系统对w3110δmetiδmetjδmetbδthrb菌株基因组中编码高丝氨酸o-琥珀酰基转移酶的meta基因进行编辑。通过pcr使用引物33和引物34，以及ptargetf载体作为模板构建能够表达靶定目的基因meta(核苷酸序列为seqidno.9所示)的sgrna的ptarget-δmeta突变载体。pcr反应条件如下：95℃5min；95℃15s，55℃15s，72℃2min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将pcr产物用dpni于37℃处理3h，灭活后转化至e.colibl21(de3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/l盐酸壮观霉素抗性的lb固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/l盐酸壮观霉素抗性的lb液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得ptarget-δmeta载体。通过pcr使用引物35和引物36，以w3110δmetiδmetjδmetbδthrb菌株的基因组为模板扩增得到meta基因上游同源片段，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法使用引物37和引物38扩增得到meta基因下游同源片段，pcr产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段(核苷酸序列为seqidno.10所示)。将回收的两个dna片段使用引物35和引物38进行融合pcr，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，重复30个循环；72℃继续延伸10min，pcr产物用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段。将ptarget-δmeta载体和回收的dna片段一同电转化至含有pcas9载体的w3110δmetiδmetjδmetbδthrb菌株，。为了电穿孔，转化有pcas9载体的w3110δmetiδmetjδmetbδthrb菌株在含有50mg/l的卡那霉素和10mml-阿拉伯糖的lb培养基中在30℃下培养，直到od达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5kv下进行。将电转化后的菌液涂至含有50mg/l的卡那霉素和50mg/l的盐酸壮观霉素抗性的lb平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物39和引物40进行pcr，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在1600bp的dna条带确认meta基因的缺失。将通过此确认的菌株在含有50mg/l的卡那霉素和5mmiptg的lb培养基中在30℃下培养过夜以去除ptarget-δmeta载体。然后将已经去除ptarget-δmeta载体的菌株在lb培养基中在37℃下培养过夜以去除pcas载体。如此构建的菌株记为w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmeta。表5引物序列引物33taatactagtctgggcctggtggagtttaagttttagagctagaaatagc引物34gctctaaaacttaaactccaccaggcccagactagtattatacctaggac引物35atgagaaaaaatcgcctacg引物36tcacagaagaaacctgattacctcactaca引物37taatcaggtttcttctgtgatagtcgatcg引物38ataaagactttcacattggc引物39ttgtcacaggttgaggaacg引物40tgacatgtttttccggcaag(6)tdcc基因的敲除为了阻止细胞对分泌至胞外环境中的l-高丝氨酸重新吸收摄取，以增加胞外l-高丝氨酸的积累，需要阻断负责l-高丝氨酸内运基因的表达，即编码内运蛋白的tdcc基因。因此，对w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmeta菌株中的tdcc基因进行敲除。通过crispr-cas9系统对w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmeta菌株基因组中编码l-高丝氨酸内运蛋白相关tdcc基因进行编辑。通过pcr使用引物41和引物42，以及ptargetf载体作为模板构建能够表达靶定目的基因tdcc(核苷酸序列为seqidno.11所示)的sgrna的ptarget-δtdcc突变载体。pcr反应条件如下：95℃5min；95℃15s，55℃15s，72℃2min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将pcr产物用dpni于37℃处理3h，灭活后转化至e.colibl21(de3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/l盐酸壮观霉素抗性的lb固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/l盐酸壮观霉素抗性的lb液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得ptarget-δtdcc载体。通过pcr使用引物43和引物44，以w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmeta菌株的基因组为模板扩增得到tdcc基因上游同源片段，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法使用引物45和引物46扩增得到tdcc基因下游同源片段，pcr产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。将回收的两个dna片段使用引物43和引物46进行融合pcr，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，重复30个循环；72℃继续延伸10min，pcr产物用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段(核苷酸序列为seqidno.12所示)。将ptarget-δtdcc载体和回收的dna片段一同电转化至含有pcas9载体的w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmeta菌株。为了电穿孔，转化有pcas9载体的w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmeta菌株在含有50mg/l的卡那霉素和10mml-阿拉伯糖的lb培养基中在30℃下培养，直到od达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5kv下进行。将电转化后的菌液涂至含有50mg/l的卡那霉素和50mg/l的盐酸壮观霉素抗性的lb平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物47和引物48进行pcr，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在1400bp的dna条带确认tdcc基因的缺失。将通过此确认的菌株在含有50mg/l的卡那霉素和5mmiptg的lb培养基中在30℃下培养过夜以去除ptarget-δtdcc载体。然后将已经去除ptarget-δtdcc载体的菌株在lb培养基中在37℃下培养过夜以去除pcas载体。如此构建的菌株记为w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc。表6引物序列实施例2基于w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc菌株的代谢改造(1)metl基因表达的增强metl基因编码的酶也是具有天冬氨酸激酶ii和高丝氨酸脱氢酶ii双功能酶活性，在l-天冬氨酸的代谢中，metl和thra基因发挥相似的作用，因此也将用trc启动子序列替换metl基因(核苷酸序列为seqidno.13所示)中的原始启动子序列以达到增强metl基因表达的目的。通过crispr-cas9系统编辑w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc菌株基因组中编码高丝氨酸脱氢酶的metl基因的启动子序列。通过pcr使用引物49和引物50，以及ptargetf载体作为模板构建能够表达靶定目的基因metl启动子序列的sgrna的ptarget-δpmetl::ptrc突变载体。pcr反应条件如下：95℃5min；95℃15s，55℃15s，72℃2min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将pcr产物用dpni于37℃处理3h，灭活后转化至e.colibl21(de3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/l盐酸壮观霉素抗性的lb固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/l盐酸壮观霉素抗性的lb液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得ptarget-δpmetl::ptrc载体。通过pcr使用引物51和引物52，以w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc菌株的基因组为模板扩增得到metl基因启动子序列上游同源片段，metl基因的启动子序列信息是基于ecocyce.colidatabase数据库中获得的(ecocyc基因登记号：eg10590，核苷酸序列为seqidno.19所示)，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法使用引物53和引物54扩增得到metl基因启动子序列下游同源片段，pcr产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。将回收的两个dna片段使用引物51和引物54的引物进行融合pcr，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，重复30个循环；72℃继续延伸10min，pcr产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段(核苷酸序列为seqidno.14所示)，该基因条带中已将ptrc启动子序列(核苷酸序列为seqidno.22所示)插入至两同源片段之间。将ptarget-δpmetl::ptrc载体和回收的dna片段一同电转化至含有pcas9载体的w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc菌株。为了电穿孔，转化有pcas9载体的w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc菌株在含有50mg/l的卡那霉素和10mml-阿拉伯糖的lb培养基中在30℃下培养，直到od600达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5kv下进行。将电转化后的菌液涂至含有50mg/l的卡那霉素和50mg/l的盐酸壮观霉素抗性的lb平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物55和引物56进行pcr，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在700bp的dna条带确认metl基因的原始启动子序列已被ptrc启动子序列替换。将通过此确认的菌株在含有50mg/l的卡那霉素和5mmiptg的lb培养基中在30℃下培养过夜以去除ptarget-δpmetl::ptrc载体。然后将已经去除ptarget-δpmetl::ptrc载体的菌株在lb培养基中在37℃下培养过夜以去除pcas载体。将去除pcas载体后的菌株使用引物55和引物54进行pcr扩增，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min15s，重复30个循环；72℃继续延伸10min，将pcr产物进行测序验证，测序结果通过blast序列比对确认metl基因的原位启动子序列已被ptrc启动子成功替换。构建的菌株记为w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc-metl(trc)。表7引物序列(2)thra基因表达的增强thra基因编码的酶具有天冬氨酸激酶i和高丝氨酸脱氢酶i双功能酶活性，为了使l-天冬氨酸往l-高丝氨酸的主路径代谢过程中将更多的碳源流向l-高丝氨酸，将用trc启动子序列替换thra基因中的原始启动子序列以达到增强thra基因表达的目的。通过crispr-cas9系统编辑w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc-metl(trc)菌株基因组中编码高丝氨酸脱氢酶的thra基因(核苷酸序列为seqidno.15所示)的启动子序列。通过pcr使用引物57和引物58，以ptargetf载体作为模板构建能够表达靶定目的基因thra启动子序列的sgrna的ptarget-δpthra::ptrc突变载体。pcr反应条件如下：95℃5min；95℃15s，55℃15s，72℃2min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将pcr产物用dpni于37℃处理3h，灭活后转化至e.colibl21(de3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/l盐酸壮观霉素抗性的lb固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/l盐酸壮观霉素抗性的lb液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得ptarget-δpthra::ptrc载体。通过pcr使用引物59和引物60，以w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc-metl(trc)菌株的基因组为模板扩增得到thra基因启动子序列上游同源片段，thra基因的启动子序列信息是基于ecocyce.colidatabase数据库中获得的(ecocyc基因登记号：eg10998，核苷酸序列为seqidno.20所示)，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法使用引物61和引物62扩增得到thra基因启动子序列下游同源片段，pcr产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。将回收的两个dna片段使用引物59和引物62的引物进行融合pcr，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，重复30个循环；72℃继续延伸10min，pcr产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段(核苷酸序列为seqidno.16所示)，该基因条带中已将ptrc启动子序列(核苷酸序列为seqidno.22所示)插入至两同源片段之间。将ptarget-δpthra::ptrc载体和回收的dna片段一同电转化至含有pcas9载体的w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc-metl(trc)菌株。为了电穿孔，转化有pcas9载体的w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc-metl(trc)菌株在含有50mg/l的卡那霉素和10mml-阿拉伯糖的lb培养基中在30℃下培养，直到od600达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5kv下进行。将电转化后的菌液涂至含有50mg/l的卡那霉素和50mg/l的盐酸壮观霉素抗性的lb平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物63和引物64进行pcr，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在700bp的dna条带确认thra基因的原始启动子序列已被ptrc启动子序列替换。将通过此确认的菌株在含有50mg/l的卡那霉素和5mmiptg的lb培养基中在30℃下培养过夜以去除ptarget-δpthra::ptrc载体。然后将已经去除ptarget-δpthra::ptrc载体的菌株在lb培养基中在37℃下培养过夜以去除pcas载体。将去除pcas载体后的菌株使用引物63和引物62进行pcr扩增，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min15s，重复30个循环；72℃继续延伸10min，将pcr产物进行测序验证，测序结果通过blast序列比对确认thra基因的原位启动子序列已被ptrc启动子成功替换。如此构建的菌株记为w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc-metl-thra(trc)。表8引物序列(3)rhta基因表达的增强rhta基因编码l-高丝氨酸外运蛋白可以将胞内合成的l-高丝氨酸产物即使有效地运送至胞外，减轻了胞内l-高丝氨酸的积累和高浓度产物的负担，为了实现l-高丝氨酸更有效的胞外运输策略，将用trc启动子序列替换rhta基因中的原始启动子序列以达到增强rhta基因表达的目的。通过crispr-cas9系统编辑w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc-metl-thra(trc)菌株基因组中编码高丝氨酸脱氢酶的rhta基因(核苷酸序列为seqidno.17所示)的启动子序列。通过pcr使用引物65和引物66，以及ptargetf载体作为模板构建能够表达靶定目的基因thra启动子序列的sgrna的ptarget-δprhta::ptrc突变载体。pcr反应条件如下：95℃5min；95℃15s，55℃15s，72℃2min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将pcr产物用dpni于37℃处理3h，灭活后转化至e.colibl21(de3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/l盐酸壮观霉素抗性的lb固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/l盐酸壮观霉素抗性的lb液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得ptarget-δprhta::ptrc载体。通过pcr使用引物67和引物68，以w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc-metl-thra(trc)菌株的基因组为模板扩增得到rhta基因启动子序列上游同源片段，rhta基因的启动子序列信息是基于ecocyce.colidatabase数据库中获得的(ecocyc基因登记号：eg10998，核苷酸序列为seqidno.21所示)，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法使用引物69和引物70扩增得到rhta基因启动子序列下游同源片段，pcr产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。将回收的两个dna片段使用引物71和引物72的引物进行融合pcr，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，重复30个循环；72℃继续延伸10min，pcr产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段(核苷酸序列为seqidno.18所示)，该基因条带中已将ptrc启动子序列(核苷酸序列为seqidno.22所示)插入至两同源片段之间。将ptarget-δprhta::ptrc载体和回收的dna片段一同电转化至w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc-metl-thra(trc)菌株，其已经转化有pcas9载体。为了电穿孔，转化有pcas9载体的w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc-metl-thra(trc)菌株在含有50mg/l的卡那霉素和10mml-阿拉伯糖的lb培养基中在30℃下培养，直到od600达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5kv下进行。将电转化后的菌液涂至含有50mg/l的卡那霉素和50mg/l的盐酸壮观霉素抗性的lb平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物71和引物70进行pcr，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在700bp的dna条带确认rhta基因的原始启动子序列已被ptrc启动子序列替换。将通过此确认的菌株在含有50mg/l的卡那霉素和5mmiptg的lb培养基中在30℃下培养过夜以去除ptarget-δprhta::ptrc载体。然后将已经去除ptarget-δprhta::ptrc载体的菌株在lb培养基中在37℃下培养过夜以去除pcas载体。将去除pcas载体后的菌株使用引物63和引物62进行pcr扩增，pcr反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min15s，重复30个循环；72℃继续延伸10min，将pcr产物进行测序验证，测序结果通过blast序列比对确认rhta基因的原位启动子序列已被ptrc启动子成功替换。如此构建的菌株记为w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc-metl-thra-rhta(trc)。表9引物序列实施例3摇瓶发酵实验对上述菌体在摇瓶中进行发酵实验测试，以比较各基因型菌株之间生产l-高丝氨酸的能力。摇瓶发酵实验按如下方案进行：将每个菌株划线接种在lb平板上，在37℃培养箱中培养过夜，挑取单菌落接种至5ml的lb培养基中，并且以200rpm的转速在37℃培养箱中培养过夜，获得种子液。在500ml的摇瓶中添加20ml的发酵培养基，并将1ml每种菌株的种子液接种至发酵培养基中。然后以180rpm的转速在30℃的培养箱中培养48小时，从摇瓶中取1ml液体，用超纯水稀释100倍，过滤膜后通过氨基酸分析仪检测发酵液中l-高丝氨酸的含量，最终比较不同基因型菌株获得l-高丝氨酸的量。结果如表10代谢改造菌株摇瓶发酵实验所示。发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖40g/l、磷酸二氢钾2g/l、硫酸铵17g/l、酵母粉4g/l、碳酸钙30g/l、l-苏氨酸0.2g/l、l-异亮氨酸0.2g/l、维生素b10.0001g/l、mgso42g/l、feso40.005g/l、mnso40.005g/l、znso40.005g/l，溶剂为去离子水，ph值6.8。表10各菌株摇瓶发酵结果菌株l-高丝氨酸(g/l)w31100w3110δmeti0w3110δmetiδmetj0w3110δmetiδmetjδmetb2.1w3110δmetiδmetjδmetbδthrb3.8w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmeta5.7w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc6.5w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc-metl(trc)8.1w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc-metl-thra(trc)9.3w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδmetaδtdcc-metl-thra-rhta(trc)11.2//l根据表10可知，经过代谢改造的w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδtdcc-metl-thra-rhta(trc)菌株无需携带外源质粒且具有生产并在胞外积累l-高丝氨酸的能力，相比于野生型能够更好的利用葡萄糖等碳源物质进行l-高丝氨酸的生产。经过改造后性能最优的菌株在发酵生产l-高丝氨酸的水平相比于野生型的菌株从0g/l提高到11.2g/l。其他经过改造后的菌株在生产l-高丝氨酸的水平相较于原始菌株都有不同程度的提高。实施例4大型发酵罐培养实验为了大规模生产l-高丝氨酸，使用w3110δmetiδmetjδmetbδthrbδtdcc-metl-thra-rhta(trc)菌株，在5l发酵罐中进行培养。将菌株划线接种在lb平板上，在37℃培养箱中培养过夜。挑取单菌落接种至10ml的lb培养基中，在37℃下培养8h，然后将1ml试管培养物再接种入含有100ml的种子(lb液体)培养基的500ml三角瓶中，并且以200rpm的转速在37℃培养箱中培养8-10h，将200ml的种子培养物接种入含1.5l发酵培养基的5l发酵罐(biotech-5jg)中，通过补料分批方法补加补料培养基，并且培养50-100h。发酵过程中通过补料将葡萄糖浓度控制在2–10g/l。通过搅拌耦合溶氧(do)模式控制发酵过程中do水平在30％左右，搅拌转速控制在200–600rpm，通气速率控制在1–2vvm，发酵过程中控制培养温度在30℃并用50％的氨水调节ph在6.8～7.0的范围。培养基成分如表11所示，并通过氨基酸分析仪分析如此培养的发酵液中的l-高丝氨酸的浓度为60g/l。培养基成分如表11所示，并通过氨基酸分析仪分析如此培养的发酵液中的l-高丝氨酸的浓度为60g/l。表11培养基配方(溶剂为去离子水，ph6.8)组成发酵培养基补料培养基葡萄糖(g/l)40500酵母粉(g/l)4kh2po4(g/l)212.5mgso4(g/l)2(nh4)2so4(g/l)17l-蛋氨酸(g/l)0.22l-苏氨酸(g/l)0.22l-异亮氨酸(g/l)0.22feso4(g/l)0.005mnso4(g/l)0.005znso4(g/l)0.005维生素b1(g/l)0.0001序列表<110>浙江工业大学<120>一种高产l-高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用<160>22<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>654<212>dna<213>未知(unknown)<400>1atgtctgagccgatgatgtggctgctggttcgtggcgtatgggaaacgctggcaatgacc60ttcgtatccggtttttttggctttgtgattggtctgccggttggcgttctgctttatgtc120acgcgtccggggcaaattattgctaacgcgaagctgtatcgtaccgtttctgcgattgtg180aacattttccgttccatcccgttcattatcttgcttgtatggatgattccgtttacccgc240gttattgtcggtacatcgattggtttgcaggcagcgattgttccgttaaccgttggtgca300gcaccgtttattgcccgtatggtcgagaacgctctgctggagatcccaaccgggttaatt360gaagcttcccgcgcaatgggtgccacgccgatgcagatcgtccgtaaggtgctgttaccg420gaagcgctgccgggtctggtgaatgcggcaactatcaccctgattaccctggtcggttat480tccgcgatgggtggtgcagtcggtgccggtggtttaggtcagattggctatcagtatggc540tacatcggctataacgcgacggtgatgaatacggtactggtattgctggtcattctggtt600tatttaattcagttcgcaggcgaccgcatcgtccgggctgtcactcgcaagtaa654<210>2<211>1000<212>dna<213>未知(unknown)<400>2gacacgttctattctcgaactgctgaaagacatcaaccgccgtctggggttgacgattct60gttgatcacccacgaaatggacgttgtgaagcgcatttgtgattgcgtggcggtcatcag120caatggagaactgatcgagcaggacacggtaagtgaagtgttctcgcatccgaaaacgcc180gctggcgcagaagtttattcagtcgaccctgcatctggatatcccggaagattaccagga240acgtctgcaagcggagccatttactgactgcgtgccgatgctgcgtctggagtttaccgg300tcaatcggtcgatgccccactgctttctgaaaccgcgcgtcgtttcaacgtcaacaacaa360cattattagcgcgcagatggattacgccggtggcgttaagttcggcatcatgctgactga420aatgcacggcacacaacaagatacgcaagccgccattgcctggctgcaggaacaccatgt480aaaagtagaggtactgggttcgttcaacacaacataaataattgaagaaggaataaggta540tggcgttcaaattcaaaacctttgcggcagtgggagccctgatcggatcactggcactgg600taggctgcggtcaggatgaaaaagatccaaaccacattaaagtcggcgtgattgttggtg660ccgaacagcaggttgcagaagtcgcgcagaaagttgcgaaagacaaatatggcctggacg720ttgagctggtaaccttcaacgactatgttctgccaaacgaagcattgagcaaaggcgata780tcgacgccaacgccttccagcataaaccgtaccttgatcagcaactgaaagatcgtggct840acaaactggtcgcagtaggcaacacttttgtttatccgattgctggttactccaagaaaa900tcaaatcactggatgaactgcaggatggttcgcaggttgccgtgccaaacgacccaacta960accttggtcgttcactgctgctgctgcaaaaagtgggctt1000<210>3<211>318<212>dna<213>未知(unknown)<400>3atggctgaatggagcggcgaatatatcagcccatacgctgagcacggcaagaagagtgaa60caagtcaaaaagattacggtttccattcctcttaaggtgttaaaaatcctcaccgatgaa120cgcacgcgtcgtcaggtgaacaacctgcgtcacgctaccaacagcgagctgctgtgcgaa180gcgtttctgcatgcctttaccgggcaacctttgccggatgatgccgatctgcgtaaagag240cgcagcgacgaaatcccggaagcggcaaaagagatcatgcgtgagatggggattaacccg300gagacgtgggaatactaa318<210>4<211>1013<212>dna<213>未知(unknown)<400>4atgccggtattagtaagtactgcaccagcaccaccttccagttctgccagcgcacgctga60accacatcgcgcgttgggttgccgcgacgcgagtaatcatgcgcgcgcggttcattaaat120ccggtaaagttataggtgctggaaagatggatcggtgggacaacgcaaccatactgttcg180tcgtcatttaacccgctacgcactgcgatggtggcctgtttacgcgtcatgtgatgaagt240tccctgggctttgtcggtgaaatgtcaggcaccagagtaaacattgtgttaatggacgtc300aatacatctggacatctaaacttctttgcgtatagattgagcaaatcccaaatagccgtt360aaaattatatgcattatcacgccgacaggtgcattacacgatgtcacggtaacgcctgta420cggtaaactatgcgggtttacggtcagtacccacatcaactgtgtggtctggtctcaatt480tattgacgaagaggattaagtatctcagcaaaaaagagcggcgcggagtggaatcgcctg540atgcgctacgcttatcaggcctacgtcatattgcaatttattgaatttgcacgaacttgt600aggccggataaggcgttcacgccgcatccggcataaacaacgagcacgttgtctgcgacc660caccgctttttatacatggacgtttaactatgaaaaacaggctgctgatcctcagcctgc720tggtttctgtacctgcctttgcctggcagccacaaaccggcgacatcatctttcagatct780ctcgctcatcgcaaagtaaagcgatccaactggcgacccataccgattatagccacaccg840gtatgctggtgatacgcaacaaaaagccctacgtttttgaagcagtcggcccggtgaaat900acaccccgctcaagcagtggatcgcccatggtgaaaagggcaaatacgttgttcgccgcg960ttgaaggcggactgagtgttgaacaacagcaaaaactggcgcaaacggcaaaa1013<210>5<211>1160<212>dna<213>未知(unknown)<400>5atgacgcgtaaacaggccaccatcgcagtgcgtagcgggttaaatgacgacgaacagtat60ggttgcgttgtcccaccgatccatctttccagcacctataactttaccggatttaatgaa120ccgcgcgcgcatgattactcgcgtcgcggcaacccaacgcgcgatgtggttcagcgtgcg180ctggcagaactggaaggtggtgctggtgcagtacttactaataccggcatgtccgcgatt240cacctggtaacgaccgtctttttgaaacctggcgatctgctggttgcgccgcacgactgc300tacggcggtagctatcgcctgttcgacagtctggcgaaacgcggttgctatcgcgtgttg360tttgttgatcaaggcgatgaacaggcattacgggcagcgctggcagaaaaacccaaactg420gtactggtagaaagcccaagtaatccattgttacgcgtcgtggatattgcgaaaatctgc480catctggcaagggaagtcggggcggtgagcgtggtggataacaccttcttaagcccggca540ttacaaaatccgctggcattaggtgccgatctggtgttgcattcatgcacgaaatatctg600aacggtcactcagacgtagtggccggcgtggtgattgctaaagacccggacgttgtcact660gaactggcctggtgggcaaacaatattggcgtgacgggcggcgcgtttgacagctatctg720ctgctacgtgggttgcgaacgctggtgccgcgtatggagctggcgcagcgcaacgcgcag780gcgattgtgaaatacctgcaaacccagccgttggtgaaaaaactgtatcacccgtcgttg840ccggaaaatcaggggcatgaaattgccgcgcgccagcaaaaaggctttggcgcaatgttg900agttttgaactggatggcgatgagcagacgctgcgtcgtttcctgggcgggctgtcgttg960tttacgctggcggaatcattagggggagtggaaagtttaatctctcacgccgcaaccatg1020acacatgcaggcatggcaccagaagcgcgtgctgccgccgggatctccgagacgctgctg1080cgtatctccaccggtattgaagatggcgaagatttaattgccgacctggaaaatggcttc1140cgggctgcaaacaaggggta1160<210>6<211>1388<212>dna<213>未知(unknown)<400>6gctttactttgcgatgagcgagagatctgaaagatgatgtcgccggtttgtggctgccag60gcaaaggcaggtacagaaaccagcaggctgaggatcagcagcctgtttttcatagttaaa120cgtccatgtataaaaagcggtgggtcgcagacaacgtgctcgttgtttatgccggatgcg180gcgtgaacgccttatccggcctacaagttcgtgcaaattcaataaattgcaatatgacgt240aggcctgataagcgtagcgcatcaggcgattccactccgcgccgctcttttttgctgaga300tacttaatcctcttcgtcaataaattgagaccagaccacacagttgatgtgggtactgac360cgtaaacccgcatagtttaccgtacaggcgttaccgtgacatcgtgtaatgcacctgtcg420gcgtgataatgcatataattttaacggctatttgggatttgctcaatctatacgcaaaga480agtttagatgtccagatgtattgacgtccattaacacaatgtttactctggtgcctgaca540tttcaccgacaaagcccagggaacttcatcacgagatacttaatcctcttcgtcaataaa600ttgagaccagaccacacagttgatgtgggtactgaccgtaaacccgcatagtttaccgta660caggcgttaccgtgacatcgtgtaatgcacctgtcggcgtgataatgcatataattttaa720cggctatttgggatttgctcaatctatacgcaaagaagtttagatgtccagatgtattga780cgtccattaacacaatgtttactctggtgcctgacatttcaccgacaaagcccagggaac840ttcatcacaaaatgagtgtgattgcgcaggcaggggcgaaaggtcgtcagctgcataaat900ttggtggcagtagtctggctgatgtgaagtgttatttgcgtgtcgcgggcattatggcgg960agtactctcagcctgacgatatgatggtggtttccgccgccggtagcaccactaaccagt1020tgattaactggttgaaactaagccagaccgatcgtctctctgcgcatcaggttcaacaaa1080cgctgcgtcgctatcagtgcgatctgattagcggtctgctacccgctgaagaagccgata1140gcctcattagcgcttttgtcagcgaccttgagcgcctggcggcgctgctcgacagcggta1200ttaacgacgcagtgtatgcggaagtggtgggccacggggaagtatggtcggcacgtctga1260tgtctgcggtacttaatcaacaagggctgccagcggcctggcttgatgcccgcgagtttt1320tacgcgctgaacgcgccgcacaaccgcaggttgatgaagggctttcttacccgttgctgc1380aacagctg1388<210>7<211>933<212>dna<213>未知(unknown)<400>7atggttaaagtttatgccccggcttccagtgccaatatgagcgtcgggtttgatgtgctc60ggggcggcggtgacacctgttgatggtgcattgctcggagatgtagtcacggttgaggcg120gcagagacattcagtctcaacaacctcggacgctttgccgataagctgccgtcagaacca180cgggaaaatatcgtttatcagtgctgggagcgtttttgccaggaactgggtaagcaaatt240ccagtggcgatgaccctggaaaagaatatgccgatcggttcgggcttaggctccagtgcc300tgttcggtggtcgcggcgctgatggcgatgaatgaacactgcggcaagccgcttaatgac360actcgtttgctggctttgatgggcgagctggaaggccgtatctccggcagcattcattac420gacaacgtggcaccgtgttttctcggtggtatgcagttgatgatcgaagaaaacgacatc480atcagccagcaagtgccagggtttgatgagtggctgtgggtgctggcgtatccggggatt540aaagtctcgacggcagaagccagggctattttaccggcgcagtatcgccgccaggattgc600attgcgcacgggcgacatctggcaggcttcattcacgcctgctattcccgtcagcctgag660cttgccgcgaagctgatgaaagatgttatcgctgaaccctaccgtgaacggttactgcca720ggcttccggcaggcgcggcaggcggtcgcggaaatcggcgcggtagcgagcggtatctcc780ggctccggcccgaccttgttcgctctgtgtgacaagccggaaaccgcccagcgcgttgcc840gactggttgggtaagaactacctgcaaaatcaggaaggttttgttcatatttgccggctg900gatacggcgggcgcacgagtactggaaaactaa933<210>8<211>1137<212>dna<213>未知(unknown)<400>8taaattcctctatgacaccaacgttggggctggattaccggttattgagaacctgcaaaa60tctgctcaatgcaggtgatgaattgatgaagttctccggcattctttctggttcgctttc120ttatatcttcggcaagttagacgaaggcatgagtttctccgaggcgaccacgctggcgcg180ggaaatgggttataccgaaccggacccgcgagatgatctttctggtatggatgtggcgcg240taaactattgattctcgctcgtgaaacgggacgtgaactggagctggcggatattgaaat300tgaacctgtgctgcccgcagagtttaacgccgagggtgatgttgccgcttttatggcgaa360tctgtcacaactcgacgatctctttgccgcgcgcgtggcgaaggcccgtgatgaaggaaa420agttttgcgctatgttggcaatattgatgaagatggcgtctgccgcgtgaagattgccga480agtggatggtaatgatccgctgttcaaagtgaaaaatggcgaaaacgccctggccttcta540tagccactattatcagccgctgccgttggtactgcgcggatatggtgcgggcaatgacgt600tacagctgccggtgtctttgctgatctgctacgtaccctctcatggaagttaggagtctg660aatgaaactctacaatctgaaagatcacaacgagcaggtcagctttgcgcaagccgtaac720ccaggggttgggcaaaaatcaggggctgttttttccgcacgacctgccggaattcagcct780gactgaaattgatgagatgctgaagctggattttgtcacccgcagtgcgaagatcctctc840ggcgtttattggtgatgaaatcccacaggaaatcctggaagagcgcgtgcgcgcggcgtt900tgccttcccggctccggtcgccaatgttgaaagcgatgtcggttgtctggaattgttcca960cgggccaacgctggcatttaaagatttcggcggtcgctttatggcacaaatgctgaccca1020tattgcgggtgataagccagtgaccattctgaccgcgacctccggtgataccggagcggc1080agtggctcatgctttctacggtttaccgaatgtgaaagtggttatcctctatccacg1137<210>9<211>930<212>dna<213>未知(unknown)<400>9atgccgattcgtgtgccggacgagctacccgccgtcaatttcttgcgtgaagaaaacgtc60tttgtgatgacaacttctcgtgcgtctggtcaggaaattcgtccacttaaggttctgatc120cttaacctgatgccgaagaagattgaaactgaaaatcagtttctgcgcctgctttcaaac180tcacctttgcaggtcgatattcagctgttgcgcatcgattcccgtgaatcgcgcaacacg240cccgcagagcatctgaacaacttctactgtaactttgaagatattcaggatcagaacttt300gacggtttgattgtaactggtgcgccgctgggcctggtggagtttaatgatgtcgcttac360tggccgcagatcaaacaggtgctggagtggtcgaaagatcacgtcacctcgacgctgttt420gtctgctgggcggtacaggccgcgctcaatatcctctacggcattcctaagcaaactcgc480accgaaaaactctctggcgtttacgagcatcatattctccatcctcatgcgcttctgacg540cgtggctttgatgattcattcctggcaccgcattcgcgctatgctgactttccggcagcg600ttgattcgtgattacaccgatctggaaattctggcagagacggaagaaggggatgcatat660ctgtttgccagtaaagataagcgcattgcctttgtgacgggccatcccgaatatgatgcg720caaacgctggcgcaggaatttttccgcgatgtggaagccggactagacccggatgtaccg780tataactatttcccgcacaatgatccgcaaaatacaccgcgagcgagctggcgtagtcac840ggtaatttactgtttaccaactggctcaactattacgtctaccagatcacgccatacgat900ctacggcacatgaatccaacgctggattaa930<210>10<211>1227<212>dna<213>未知(unknown)<400>10atgagaaaaaatcgcctacgcccccacatacgccagattcagcaacggatacggtttccc60caaatcgtccacctcagagcgtcccgtaaccttaaaacccaccttcttatagaacccaac120cgcctgctcattttgctcattaacgttggttgtcagttccggtgccatcgagagcgcatg180ctccaccagcacccgacctacgccgcagccgcgcacatcaggatcgataaacagcgcatc240catatgctgcccacttagcaacataaatccaaccggctgatcccgctcattaaccgcgac300ccacaacggcgcttccggcaggaaggaacgaactaggtcctccagctcggtccgatactc360tgctgatagaaaatcgtgagtggcatcgacagaacgacaccaaatcgcaacgagttcctc420cccttcctcatgccgtgagcggcgaatactaataaccattttctctccttttagtcattc480ttatattctaacgtagtcttttccttgaaactttctcaccttcaacatgcaggctcgaca540ttggcaaattttctggttatcttcagctatctggatgtctaaacgtataagcgtatgtag600tgaggtaatcaggtttcttctgtgatagtcgatcgttaagcgattcagcaccttacctca660ggcaccttcgggtgccttttttatttccgaaacgtacctcagcaggtgaataaattttat720tcatattgttatcaacaagttatcaagtatttttaattaaaatggaaattgtttttgatt780ttgcattttaaatgagtagtcttagttgtgctgaacgaaaagagcacaacgatccttcgt840tcacagtggggaagttttcggatccatgacgaggagctgcacgatgactgaacaggcaac900aacaaccgatgaactggctttcacaaggccgtatggcgagcaggagaagcaaattcttac960tgccgaagcggtagaatttctgactgagctggtgacgcattttacgccacaacgcaataa1020acttctggcagcgcgcattcagcagcagcaagatattgataacggaacgttgcctgattt1080tatttcggaaacagcttccattcgcgatgctgattggaaaattcgcgggattcctgcgga1140cttagaagaccgccgcgtagagataactggcccggtagagcgcaagatggtgatcaacgc1200gctcaacgccaatgtgaaagtctttat1227<210>11<211>1332<212>dna<213>未知(unknown)<400>11atgagtacttcagatagcattgtatccagccagacaaaacaatcgtcctggcgtaaatca60gataccacatggacgttaggcttgtttggtacggcaatcggcgccggggtgctgttcttc120cctatccgcgcaggttttggcggactgatcccgattcttctgatgttggtattggcatac180cccatcgcgttttattgccaccgggcgctggcgcgtctgtgtctttctggctctaaccct240tccggcaacattacggaaacggtggaagagcattttggtaaaactggcggcgtggttatc300acgttcctgtacttcttcgcgatttgcccactgctgtggatttatggcgttactattacc360aatacctttatgacgttctgggaaaaccagctcggctttgcaccgctgaatcgcggcttt420gtggcgctgttcctgttgctgctgatggctttcgtcatctggtttggtaaggatctgatg480gttaaagtgatgagctacctggtatggccgtttatcgccagcctggtgctgatttctttg540tcgctgatcccttactggaactctgcagttatcgaccaggttgacctcggttcgctgtcg600ttaaccggtcatgacggtatcctgatcactgtctggctggggatttccatcatggttttc660tcctttaacttctcgccaatcgtctcttccttcgtggtttctaagcgtgaagagtatgag720aaagacttcggtcgcgacttcaccgaacgtaaatgttcccaaatcatttctcgtgccagc780atgctgatggttgcagtggtgatgttctttgcctttagctgcctgtttactctgtctccg840gccaacatggcggaagccaaagcgcagaatattccagtgctttcttatctggctaaccac900tttgcgtccatgaccggtaccaaaacaacgttcgcgattacactggaatatgcggcttcc960atcatcgcactcgtggctatcttcaaatctttcttcggtcactatctgggaacgctggaa1020ggtctgaatggcctggtcctgaagtttggttataaaggcgacaaaactaaagtgtcgctg1080ggtaaactgaacactatcagcatgatcttcatcatgggctccacctgggttgttgcctac1140gccaacccgaacatccttgacctgattgaagccatgggcgcaccgattatcgcatccctg1200ctgtgcctgttgccgatgtatgccatccgtaaagcgccgtctctggcgaaataccgtggt1260cgtctggataacgtgtttgttaccgtgattggtctgctgaccatcctgaacatcgtatac1320aaactgttttaa1332<210>12<211>1045<212>dna<213>未知(unknown)<400>12aaattatggaagatctctatgatgtcgataacgtgattgtgccaattggtggtggcggtt60taattgctggtattgcggtggcaattaaatctattaacccgaccattcgtgttattggcg120tacagtctgaaaacgttcacggcatggcggcttctttccactccggagaaataaccacgc180accgaactaccggcaccctggcggatggttgtgatgtctcccgcccgggtaatttaactt240acgaaatcgttcgtgaattagtcgatgacatcgtgctggtcagcgaagacgaaatcagaa300acagtatgattgccttaattcagcgcaataaagtcgtcaccgaaggcgcaggcgctctgg360catgtgctgcattattaagcggtaaattagaccaatatattcaaaacagaaaaaccgtca420gtattatttccggcggcaatatcgatctttctcgcgtctctcaaatcaccggtttcgttg480acgcttaattaattcgttgaggataggatatgtaatccgtaactcaggatgagaaaagag540atgaatgaatttccggttgttttggttattaactgtggttcgtcttcgattaagttttcc600gtgctcgatgccagcgactgtgaagtattaatgtcaggtattgccgacggtattaactcg660gaaaatgcattcttatccgtaaatgggggagagccagcaccgctggctcaccacagctac720gaaggtgcattgaaggcaattgcatttgaactggaaaaacggaatttaaatgacagtgtg780gccttaattggccaccgcatcgctcacggcggcagtatttttaccgagtccgccattatt840accgatgaagtcattgataatatccgtcgcgtttctccactggcacccctgcataattac900gccaatttaagtggtattgaatcggcgcagcaattatttccgggcgtaactcaggtggcg960gtatttgataccagtttccaccagacgatggctccggaagcttatttatacggcctgccg1020tggaaatattatgaagagttaggtg1045<210>13<211>2433<212>dna<213>未知(unknown)<400>13atgagtgtgattgcgcaggcaggggcgaaaggtcgtcagctgcataaatttggtggcagt60agtctggctgatgtgaagtgttatttgcgtgtcgcgggcattatggcggagtactctcag120cctgacgatatgatggtggtttccgccgccggtagcaccactaaccagttgattaactgg180ttgaaactaagccagaccgatcgtctctctgcgcatcaggttcaacaaacgctgcgtcgc240tatcagtgcgatctgattagcggtctgctacccgctgaagaagccgatagcctcattagc300gcttttgtcagcgaccttgagcgcctggcggcgctgctcgacagcggtattaacgacgca360gtgtatgcggaagtggtgggccacggggaagtatggtcggcacgtctgatgtctgcggta420cttaatcaacaagggctgccagcggcctggcttgatgcccgcgagtttttacgcgctgaa480cgcgccgcacaaccgcaggttgatgaagggctttcttacccgttgctgcaacagctgctg540gtgcaacatccgggcaaacgtctggtggtgaccggatttatcagccgcaacaacgccggt600gaaacggtgctgctggggcgtaacggttccgactattccgcgacacaaatcggtgcgctg660gcgggtgtttctcgcgtaaccatctggagcgacgtcgccggggtatacagtgccgacccg720cgtaaagtgaaagatgcctgcctgctgccgttgctgcgtctggatgaggccagcgaactg780gcgcgcctggcggctcccgttcttcacgcccgtactttacagccggtttctggcagcgaa840atcgacctgcaactgcgctgtagctacacgccggatcaaggttccacgcgcattgaacgc900gtgctggcctccggtactggtgcgcgtattgtcaccagccacgatgatgtctgtttgatt960gagtttcaggtgcccgccagtcaggatttcaaactggcgcataaagagatcgaccaaatc1020ctgaaacgcgcgcaggtacgcccgctggcggttggcgtacataacgatcgccagttgctg1080caattttgctacacctcagaagtggccgacagtgcgctgaaaatcctcgacgaagcggga1140ttacctggcgaactgcgcctgcgtcaggggctggcgctggtggcgatggtcggtgcaggc1200gtcacccgtaacccgctgcattgccaccgcttctggcagcaactgaaaggccagccggtc1260gaatttacctggcagtccgatgacggcatcagcctggtggcagtactgcgcaccggcccg1320accgaaagcctgattcaggggctgcatcagtccgtcttccgcgcagaaaaacgcatcggc1380ctggtattgttcggtaagggcaatatcggttcccgttggctggaactgttcgcccgtgag1440cagagcacgctttcggcacgtaccggctttgagtttgtgctggcaggtgtggtggacagc1500cgccgcagcctgttgagctatgacgggctggacgccagccgcgcgttagccttcttcaac1560gatgaagcggttgagcaggatgaagagtcgttgttcctgtggatgcgcgcccatccgtat1620gatgatttagtggtgctggacgttaccgccagccagcagcttgctgatcagtatcttgat1680ttcgccagccacggtttccacgttatcagcgccaacaaactggcgggagccagcgacagc1740aataaatatcgccagatccacgacgccttcgaaaaaaccgggcgtcactggctgtacaat1800gccaccgtcggtgcgggcttgccgatcaaccacaccgtgcgcgatctgatcgacagcggc1860gatactattttgtcgatcagcgggatcttctccggcacgctctcctggctgttcctgcaa1920ttcgacggtagcgtgccgtttaccgagctggtggatcaggcgtggcagcagggcttaacc1980gaacctgacccgcgtgacgatctctctggcaaagacgtgatgcgcaagctggtgattctg2040gcgcgtgaagcaggttacaacatcgaaccggatcaggtacgtgtggaatcgctggtgcct2100gctcattgcgaaggcggcagcatcgaccatttctttgaaaatggcgatgaactgaacgag2160cagatggtgcaacggctggaagcggcccgcgaaatggggctggtgctgcgctacgtggcg2220cgtttcgatgccaacggtaaagcgcgtgtaggcgtggaagcggtgcgtgaagatcatccg2280ttggcatcactgctgccgtgcgataacgtctttgccatcgaaagccgctggtatcgcgat2340aaccctctggtgatccgcggacctggcgctgggcgcgacgtcaccgccggggcgattcag2400tcggatatcaaccggctggcacagttgttgtaa2433<210>14<211>1069<212>dna<213>未知(unknown)<400>14cagttggatcgctttactttgcgatgagcgagagatctgaaagatgatgtcgccggtttg60tggctgccaggcaaaggcaggtacagaaaccagcaggctgaggatcagcagcctgttttt120catagttaaacgtccatgtataaaaagcggtgggtcgcagacaacgtgctcgttgtttat180gccggatgcggcgtgaacgccttatccggcctacaagttcgtgcaaattcaataaattgc240aatatgacgtaggcctgataagcgtagcgcatcaggcgattccactccgcgccgctcttt300tttgctgagatacttaatcctcttcgtcaataaattgagaccagaccacacagttgatgt360gggtactgaccgtaaacccgcatagtttaccgtacaggcgttaccgtgacatcgtgtaat420gcacctgtcggcgtgataatgcatataattttaacggctatttgggatttgctcaatcta480tacgcaaagaagtttagatgtccagatgtattgacaattaatcatccggctcgtataatg540tgtggtcacaaaggagatatacatgagtgtgattgcgcaggcaggggcgaaaggtcgtca600gctgcataaatttggtggcagtagtctggctgatgtgaagtgttatttgcgtgtcgcggg660cattatggcggagtactctcagcctgacgatatgatggtggtttccgccgccggtagcac720cactaaccagttgattaactggttgaaactaagccagaccgatcgtctctctgcgcatca780ggttcaacaaacgctgcgtcgctatcagtgcgatctgattagcggtctgctacccgctga840agaagccgatagcctcattagcgcttttgtcagcgaccttgagcgcctggcggcgctgct900cgacagcggtattaacgacgcagtgtatgcggaagtggtgggccacggggaagtatggtc960ggcacgtctgatgtctgcggtacttaatcaacaagggctgccagcggcctggcttgatgc1020ccgcgagtttttacgcgctgaacgcgccgcacaaccgcaggttgatgaa1069<210>15<211>2463<212>dna<213>未知(unknown)<400>15atgcgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggcaaatgcagaacgttttctgcgtgtt60gccgatattctggaaagcaatgccaggcaggggcaggtggccaccgtcctctctgccccc120gccaaaatcaccaaccacctggtggcgatgattgaaaaaaccattagcggccaggatgct180ttacccaatatcagcgatgccgaacgtatttttgccgaacttttgacgggactcgccgcc240gcccagccggggttcccgctggcgcaattgaaaactttcgtcgatcaggaatttgcccaa300ataaaacatgtcctgcatggcattagtttgttggggcagtgcccggatagcatcaacgct360gcgctgatttgccgtggcgagaaaatgtcgatcgccattatggccggcgtattagaagcg420cgcggtcacaacgttactgttatcgatccggtcgaaaaactgctggcagtggggcattac480ctcgaatctaccgtcgatattgctgagtccacccgccgtattgcggcaagccgcattccg540gctgatcacatggtgctgatggcaggtttcaccgccggtaatgaaaaaggcgaactggtg600gtgcttggacgcaacggttccgactactctgctgcggtgctggctgcctgtttacgcgcc660gattgttgcgagatttggacggacgttgacggggtctatacctgcgacccgcgtcaggtg720cccgatgcgaggttgttgaagtcgatgtcctaccaggaagcgatggagctttcctacttc780ggcgctaaagttcttcacccccgcaccattacccccatcgcccagttccagatcccttgc840ctgattaaaaataccggaaatcctcaagcaccaggtacgctcattggtgccagccgtgat900gaagacgaattaccggtcaagggcatttccaatctgaataacatggcaatgttcagcgtt960tctggtccggggatgaaagggatggtcggcatggcggcgcgcgtctttgcagcgatgtca1020cgcgcccgtatttccgtggtgctgattacgcaatcatcttccgaatacagcatcagtttc1080tgcgttccacaaagcgactgtgtgcgagctgaacgggcaatgcaggaagagttctacctg1140gaactgaaagaaggcttactggagccgctggcagtgacggaacggctggccattatctcg1200gtggtaggtgatggtatgcgcaccttgcgtgggatctcggcgaaattctttgccgcactg1260gcccgcgccaatatcaacattgtcgccattgctcagggatcttctgaacgctcaatctct1320gtcgtggtaaataacgatgatgcgaccactggcgtgcgcgttactcatcagatgctgttc1380aataccgatcaggttatcgaagtgtttgtgattggcgtcggtggcgttggcggtgcgctg1440ctggagcaactgaagcgtcagcaaagctggctgaagaataaacatatcgacttacgtgtc1500tgcggtgttgccaactcgaaggctctgctcaccaatgtacatggccttaatctggaaaac1560tggcaggaagaactggcgcaagccaaagagccgtttaatctcgggcgcttaattcgcctc1620gtgaaagaatatcatctgctgaacccggtcattgttgactgcacttccagccaggcagtg1680gcggatcaatatgccgacttcctgcgcgaaggtttccacgttgtcacgccgaacaaaaag1740gccaacacctcgtcgatggattactaccatcagttgcgttatgcggcggaaaaatcgcgg1800cgtaaattcctctatgacaccaacgttggggctggattaccggttattgagaacctgcaa1860aatctgctcaatgcaggtgatgaattgatgaagttctccggcattctttctggttcgctt1920tcttatatcttcggcaagttagacgaaggcatgagtttctccgaggcgaccacgctggcg1980cgggaaatgggttataccgaaccggacccgcgagatgatctttctggtatggatgtggcg2040cgtaaactattgattctcgctcgtgaaacgggacgtgaactggagctggcggatattgaa2100attgaacctgtgctgcccgcagagtttaacgccgagggtgatgttgccgcttttatggcg2160aatctgtcacaactcgacgatctctttgccgcgcgcgtggcgaaggcccgtgatgaagga2220aaagttttgcgctatgttggcaatattgatgaagatggcgtctgccgcgtgaagattgcc2280gaagtggatggtaatgatccgctgttcaaagtgaaaaatggcgaaaacgccctggccttc2340tatagccactattatcagccgctgccgttggtactgcgcggatatggtgcgggcaatgac2400gttacagctgccggtgtctttgctgatctgctacgtaccctctcatggaagttaggagtc2460tga2463<210>16<211>1304<212>dna<213>未知(unknown)<400>16ttaaagttttcccgacattggctgaatcgttacacgatgtcgatttcactgtcgccacca60ctgcgcgcagtcgggcgaaatatcattactacgccacgccagttgaactggtgccgctgt120tagaggaaaaatcttcatggatgagccatgccgcgctggtgtttggtcgcgaagattccg180ggttgactaacgaagagttagcgttggctgacgttcttactggtgtgccgatggtggcgg240attatccttcgctcaatctggggcaggcggtgatggtctattgctatcaattagcaacat300taatacaacaaccggcgaaaagtgatgcaacggcagaccaacatcaactgcaagctttac360gcgaacgagccatgacattgctgacgactctggcagtggcagatgacataaaactggtcg420actggttacaacaacgcctggggcttttagagcaacgagacacggcaatgttgcaccgtt480tgctgcatgatattgaaaaaaatatcaccaaataaaaaacgccttagtaagtatttttca540gcttttcattctgactgcaacgggcaatatgtctctgtgtggattaaaaaaagagtgtct600gatagcagcttctgaactggttacctgccgtgagtaaattaaaattttattgacaattaa660tcatccggctcgtataatgtgtggtcacaaaggagatatacatgcgagtgttgaagttcg720gcggtacatcagtggcaaatgcagaacgttttctgcgtgttgccgatattctggaaagca780atgccaggcaggggcaggtggccaccgtcctctctgcccccgccaaaatcaccaaccacc840tggtggcgatgattgaaaaaaccattagcggccaggatgctttacccaatatcagcgatg900ccgaacgtatttttgccgaacttttgacgggactcgccgccgcccagccggggttcccgc960tggcgcaattgaaaactttcgtcgatcaggaatttgcccaaataaaacatgtcctgcatg1020gcattagtttgttggggcagtgcccggatagcatcaacgctgcgctgatttgccgtggcg1080agaaaatgtcgatcgccattatggccggcgtattagaagcgcgcggtcacaacgttactg1140ttatcgatccggtcgaaaaactgctggcagtggggcattacctcgaatctaccgtcgata1200ttgctgagtccacccgccgtattgcggcaagccgcattccggctgatcacatggtgctga1260tggcaggtttcaccgccggtaatgaaaaaggcgaactggtggtg1304<210>17<211>888<212>dna<213>未知(unknown)<400>17atgcctggttcattacgtaaaatgccggtctggttaccaatagtcatattgctcgttgcc60atggcgtctattcagggtggagcctcgttagctaagtcactttttcctctggtgggcgca120ccgggtgtcactgcgctgcgtctggcattaggaacgctgatcctcatcgcgttctttaag180ccatggcgactgcgctttgccaaagagcaacggttaccgctgttgttttacggcgtttcg240ctgggtgggatgaattatcttttttatctttctattcagacagtaccgctgggtattgcg300gtggcgctggagttcaccggaccactggcggtggcgctgttctcttctcgtcgcccggta360gatttcgtctgggttgtgctggcggttcttggtctgtggttcctgctaccgctggggcaa420gacgtttcccatgtcgatttaaccggctgtgcgctggcactgggggccggggcttgttgg480gctatttacattttaagtgggcaacgcgcaggagcggaacatggccctgcgacggtggca540attggttcgttgattgcagcgttaattttcgtgccaattggagcgcttcaggctggtgaa600gcactctggcactggtcggttattccattgggtctggctgtcgctattctctcgaccgct660ctgccttattcgctggaaatgattgccctcacccgtttgccaacacggacatttggtacg720ctgatgagcatggaaccggcgctggctgccgtttccgggatgattttcctcggagaaaca780ctgacacccatacagctactggcgctcggcgctatcatcgccgcttcaatggggtctacg840ctgacagtacgcaaagagagcaaaataaaagaattagacattaattaa888<210>18<211>1034<212>dna<213>未知(unknown)<400>18tgtcgtgtttgtaggtcgggtattcagtggtctggaatttaccataacccacacccacta60caccgtagatgcttgcccagtcgttaatgcggtaagccggaccagcagtgatgccgtagt120actggtttttgttgtagtcaccagagcttgcagtacggcttttctcggtgtaagtgaaag180aaccgatcacacccagcgggctgttgtcttcttcatagcggtatttcaggttgaaaccgc240ccattttgttcatttggccctgagcgtcgctctgtgcgtaaccgccagttacagtagaag300tcgcagctacggaagtacctgcggtgaaagccagaactgcggccagtgctgaaagacatg360caatttttttcataaccacctcaaatgtgattcaaataagtcctaagttttaaatatatc420aaaaattaatgggaaactcttcgcgatttgtgatgtctaacgggccatttcatgtaacag480aacgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggtcacaaaggagatatacatgc540ctggttcattacgtaaaatgccggtctggttaccaatagtcatattgctcgttgccatgg600cgtctattcagggtggagcctcgttagctaagtcactttttcctctggtgggcgcaccgg660gtgtcactgcgctgcgtctggcattaggaacgctgatcctcatcgcgttctttaagccat720ggcgactgcgctttgccaaagagcaacggttaccgctgttgttttacggcgtttcgctgg780gtgggatgaattatcttttttatctttctattcagacagtaccgctgggtattgcggtgg840cgctggagttcaccggaccactggcggtggcgctgttctcttctcgtcgcccggtagatt900tcgtctgggttgtgctggcggttcttggtctgtggttcctgctaccgctggggcaagacg960tttcccatgtcgatttaaccggctgtgcgctggcactgggggccggggcttgttgggcta1020tttacattttaagt1034<210>19<211>72<212>dna<213>未知(unknown)<400>19ttgacgtccattaacacaatgtttactctggtgcctgacatttcaccgacaaagcccagg60gaacttcatcac72<210>20<211>226<212>dna<213>未知(unknown)<400>20ttgacttaggtcactaaatactttaaccaatataggcatagcgcacagacagataaaaat60tacagagtacacaacatccatgaaacgcattagcaccaccattaccaccaccatcaccat120taccacaggtaacggtgcgggctgacgcgtacaggaaacacagaaaaaagcccgcacctg180acagtgcgggctttttttttcgaccaaaggtaacgaggtaacaacc226<210>21<211>241<212>dna<213>未知(unknown)<400>21tttccatacaccgctatccatctaaatttaaatcactttttcagagaactgcgtaagtat60tacgcatgttttccctgtcattcatccagattattcctaatcaccagactaatgattcca120tcaatcctggcgcattttagtcaaaacgggggaaaattttttcaacaaatgctcaaccag180cattgggtatatccagtacactccacgctttacttaagtctagatatttgtgggagaaag240g241<210>22<211>52<212>dna<213>未知(unknown)<400>22ttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggtcacaaaggagatatac52当前第1页12