本发明属于分离纯化
技术领域：
，具体涉及一种鼠李糖脂发酵液的在线分离及纯化方法。技术背景鼠李糖脂，是一种生物表面活性剂，主要由铜绿假单胞菌在一定的环境下代谢生成，其具有良好的表面活性及界面活性，可以广泛地应用于石化、环境、医药、食品以及农业等领域。鼠李糖脂具有良好的化学和生物特性，随着目前国家在环境保护及修复方面越来越重视，同时由于鼠李糖脂在环境修复方面突出的表现，其需求量与日俱增。但鼠李糖脂产率低，发酵培养基成分复杂，副产物多，直接导致其提取工艺复杂，成本较高，阻碍了产品的工业化发展。传统的鼠李糖脂提纯方法主要采用离心、酸沉、萃取工艺，提取过程复杂，如果采用有机溶剂萃取不仅影响产品品质、消耗大量有机溶剂而且生产过程存在安全隐患。专利cn103833800a报道使用有机溶剂萃取水相中鼠李糖脂进而进行分离的方法，使用的溶剂可以是乙酸乙酯、丁醇或二乙醚，最终产品纯度仅为75％，并且需要处理大量的废有机溶剂。鼠李糖脂的生产过程中存在的另一大问题是发泡问题。鼠李糖脂本身是一种表面活性剂，发酵液中成分复杂，随着鼠李糖脂含量的不断累积，发酵罐中的起泡现象会越来越严重，不利于发酵过程的持续进行。普通的物理消泡方法是将泡沫引入溢流罐，待完全消泡后再打回发酵罐，但是增加回路极容易引起染菌；如果加入化学消泡剂，可以明显消泡，但最终产品中残留了消泡剂，影响产品使用效果，降低了产品品质。专利cn103966282b中介绍了一种物理消泡法，将发酵罐中的泡沫导入到消泡罐顶部，并通过孔径为1-2mm的泡沫喷淋头喷淋到消泡罐内，同时将高于消泡罐内气压0.1-0.25mpa的无菌空气瞬间释放到消泡罐内，待泡沫消除后停止释放，将泡沫液化后的发酵液用蠕动泵导回发酵罐，该方法虽然可以实现消泡，但增加了一整套消泡体系，包括消泡罐、消泡回路及消泡装置，需要进行压力控制，增加了染菌的可能性与操作的复杂性。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种收率高、纯度高，同时减少起泡现象的鼠李糖脂分离纯化方法。为达到上述目地，本发明采用如下技术方案：一种鼠李糖脂发酵液的在线分离及纯化方法，包含以下步骤：(1)使用工程菌发酵生产鼠李糖脂时，在发酵过程中向发酵液中一次性加入阴离子交换树脂，继续完成发酵；(2)分离树脂和发酵液，用洗脱剂反洗树脂，得到鼠李糖脂水溶液；(3)调节鼠李糖脂水溶液ph值，过滤浓缩，干燥浓缩液，得到鼠李糖脂纯品。步骤(1)在发酵中后期加入阴离子交换树脂，优选在开始发酵72-96小时后加入；树脂加入后继续发酵96-120小时至发酵终点，上述发酵周期合计为168-216小时。步骤(1)中阴离子交换树脂为碱性阴离子树脂，优选苯乙烯系弱碱性阴离子树脂；阴离子交换树脂加入体积为发酵液体积的1-10％，优选3-8％。步骤(1)中树脂加入后控制发酵液的ph值为6.8-7.0。步骤(2)中树脂与发酵液的分离方式采用沉降或过滤方式；分离后的树脂用2-5倍体积超纯水洗涤1-2次，然后装入树脂交换柱，其树脂装填的长径比为19:1-100:1，优选30:1-50:1。步骤(2)中树脂洗脱剂为氢氧化钾和/或氢氧化钠的水溶液，浓度为0.1-4wt％，优选0.5-1wt％；洗脱剂用量为待洗脱树脂体积的10-200倍，优选20-50倍，洗脱方式为动态洗脱，洗脱剂体积流速为每分钟0.2-5倍于树脂体积，优选0.5-2倍于树脂体积。步骤(3)调节鼠李糖脂水溶液ph为7-8。步骤(3)中使用超滤工艺对鼠李糖脂水溶液进行过滤浓缩，采用截留分子量3k-5k的超滤膜；待超滤截留体积为鼠李糖脂水溶液原体积的1/10-1/5时停止过滤，保留浓缩液。步骤(3)中使用冷冻干燥方法干燥浓缩液。采用该方法分离鼠李糖脂，产品回收率大于90％，所获鼠李糖脂为含量大于98％的粉末状高纯品，发酵过程中无明显起泡现象。本发明的有益效果：(1)本方法的鼠李糖脂回收率大于90％，所获鼠李糖脂为含量大于98％的粉末状高纯品；(2)采用在线分离的方法，通过离子交换树脂将产生的鼠李糖脂即时吸附到树脂表面，从根本上解决了发酵过程中的起泡问题，有利于发酵过程的持续进行，与其他物理消泡或化学消泡法相比，该方法操作简单、不引入其他杂质，大大降低了破泡的成本；(3)与传统使用有机溶剂萃取等方法相比，通过离子交换树脂分离纯化鼠李糖脂的分离过程工艺简单、无复杂设备、不使用有毒有害溶剂、三废量少、绿色环保。具体实施方式下面的实施例将对本发明所提供的方法予以进一步的说明，但本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其它任何公知的改变。发酵罐：容积3l，上海保兴生物设备工程有限公司；树脂：717强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、d382弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、d301型弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，蓝星集团。鼠李糖脂含量检测方法为硫酸-蒽酮法，具体操作方法如下：1)配制蒽酮溶液：取0.2g蒽酮溶于100ml体积分数为80％硫酸中，避光待用，现用现配，不可存放。2)取0.5ml待测样品于10-15ml具塞刻度试管中，将其置于冰水浴充分冷却，保持冰水浴加入2ml蒽酮溶液，快速混匀(尽量减少反应)，然后沸水浴10min，取出放入冰水浴中冷却至室温，620nm测吸光度。3)鼠李糖标准曲线：称取0.1g鼠李糖定容到250ml容量瓶，配置成400mg/l鼠李糖母液，然后按比例稀释得到不同浓度的标样，见下表：母液(ml)00.20.40.60.81.0纯水(ml)0.51.81.61.41.21终浓度(mg/l)04080120160200利用蒽酮法测定吸光值，绘制标准曲线。y＝ax+b其中y为鼠李糖含量，x为吸光度，最终鼠李糖脂的计算公式为：鼠李糖脂含量＝反应液中鼠李糖的含量×稀释倍数×3.4。鼠李糖脂发酵液通过以下工艺制备得到：摇瓶和发酵罐的发酵培养基配方为：大豆油30g/l、甘油15g/l、硝酸钠5g/l、酵母粉10g/l，kh2po40.5g/l、mgso40.5g/l、znso4·7h2o0.29g/l、cacl2·6h2o0.28g/l、cuso4·5h2o0.25g/l、mnso4·h2o0.17g/l。按上述配方配制1.5l发酵培养基，121℃灭菌20mins，冷却备用。平板培养基为lb固体培养基，配方如下：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉15g/l。按上述配方配制25ml平板培养基，121℃灭菌20mins，然后降温至50℃，在超净工作台中倒平板，冷却至室温待用。工程菌为pseudomonasspvts-1，菌种保藏号：cgmcc2200，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，通过购买获得，将保存在-80℃的菌种pseudomonasspvts-1在室温下解冻，取5μl接种在平板培养基上，30℃培养24小时，取100ml已灭菌的摇瓶培养基，从生长24小时平板上转接菌种到摇瓶，200rpm，30℃摇床培养18小时得到种子液。然后按照2％接种量接种到装有1.5l培养基的3l发酵罐中，保持30℃，120vvm通气量，维持ph7.0发酵。实施例1在前述发酵条件下发酵72小时得到发酵中期的发酵液1.5l。向发酵液中加入已经活化好的717强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂75ml，保持ph7.0不变，继续发酵96小时后结束。含有树脂的发酵液通过过滤分离，树脂先用375ml去离子水洗涤一次，然后全部装入直径为1cm离子交换柱(树脂对应的长径比为95.5:1)，用3l浓度为1％的naoh水溶液进行洗脱，流速为75ml/min，收集全部洗脱液，得到2.95l鼠李糖脂水溶液，经过检测，鼠李糖脂含量为11.1g/l。过滤分离树脂后的发酵液未检测到鼠李糖脂。将鼠李糖脂水溶液先加盐酸调节ph为7.5，然后用孔径3k的聚醚砜膜进行过滤，过滤压力为1.5公斤(表压)，浓缩至300ml时停止超滤，保留浓缩液，冷冻干燥得到淡黄色冻干粉末31g，经过检测鼠李糖脂含量为98.5％。计算回收率：若不经离子交换树脂分离，维持原发酵条件至发酵结束，发酵液体积为1.5l，鼠李糖脂含量为22g/l，鼠李糖脂理论产量为33g，对应回收率为92.5％。实施例2维持前述条件下发酵96小时得到发酵中期的发酵液1.5l。向发酵液中加入已经活化好的d382弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂150ml，维持ph6.8继续发酵96小时后结束。含有树脂的发酵液过滤分离，树脂用750ml去离子水洗涤一次，然后全部装入直径为1.6cm离子交换柱(树脂对应的长径比为46.7:1)，用1.5l浓度为4％koh水溶液进行洗脱，洗脱流速为30ml/min。收集全部洗脱液，得到1.45l鼠李糖脂水溶液，经过检测，鼠李糖脂含量为22g/l，过滤分离树脂后的发酵液未检测出鼠李糖脂。将鼠李糖脂水溶液先加盐酸调节ph为8，然后用孔径5k的聚醚砜卷式超滤膜进行过滤，过滤方式为错流过滤，浓缩液为300ml时停止超滤，保留浓缩液，冷冻干燥得到淡黄色冻干粉末30g，经检测鼠李糖脂含量为99.5％。计算回收率：若不经离子交换树脂分离，维持原发酵条件至发酵结束，发酵液体积为1.5l，鼠李糖脂含量为22g/l，鼠李糖脂理论产量为33g，对应回收率为90.5％。实施例3在前述条件下发酵96小时，得到发酵中期发酵液1.5l，向发酵液中加入已经活化好的d301型弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂15ml，维持ph为7继续发酵120小时直到发酵结束。含有树脂的发酵液沉降分离，树脂用30ml去离子水洗涤两次，然后全部装入直径1cm离子交换柱(树脂对应的长径比为19.1:1)，用3l0.1％koh和0.1％naoh混合溶液洗脱，洗脱流速为75ml/min，收集全部洗脱液，得到2.98l溶液，经检测，鼠李糖脂含量为11g/l，过滤分离树脂后的发酵液未检测出鼠李糖脂。鼠李糖脂水溶液先加盐酸调节ph为7，然后用孔径3k的聚醚砜卷式超滤膜进行过滤，过滤方式为错流过滤，浓缩液为300ml时停止过滤，保留浓缩液，冷冻干燥得到淡黄色冻干粉末31g，鼠李糖脂含量为99.0％。计算回收率：若不经离子交换树脂分离，维持原发酵条件至发酵结束，发酵液体积为1.5l，鼠李糖脂含量为22g/l，鼠李糖脂理论产量为33g，对应回收率为93.0％。对比例1在前述发酵条件下发酵196小时，发酵罐外接10l压力可调的溢流罐，发酵后期泡沫引入溢流罐，通过改变溢流罐内的压力使泡沫消除，将消泡后的发酵液再重新打回发酵罐，如此重复直到发酵结束，检测发酵液鼠李糖脂含量为22g/l。发酵液离心除菌，保留上清液，然后加入80％硫酸，调节ph为2.5，有固体沉淀析出，用等体积乙酸乙酯分两次对析出固体进行萃取，分离有机相，合并两次萃取液，在60℃下抽真空蒸干溶剂，得到褐色粘稠状液体35g，纯度55％，鼠李糖脂收率为58.3％。当前第1页12