参与西红花苷合成的糖基转移酶GjUGT94E13和GjUGT74F8的筛选鉴定及应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及栀子中西红花酸合成至西红花苷生物合成途径中糖基转移酶的筛选、鉴定及应用。

背景技术：

西红花酸与葡萄糖基结合形成西红花苷，根据其糖基数目的不同将其分为西红花苷i、西红花苷ii、西红花苷iii、西红花苷iv、西红花苷v，总称为西红花苷。西红花苷最初是从鸢尾科西红花的柱头中提取出来的，具有广泛的应用价值。现代药理学研究证明其具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗糖尿病等作用，尤其是在中枢神经系统以及心脑血管系统疾病方面作用显著。西红花苷也是一种水溶性的食用色素。由于西红花柱头采收困难且成本高，限制了西红花苷的发展与应用。

茜草科栀子果实中也富含西红花苷，与西红花相比，栀子具有资源丰富、易于取材等特点，被认为是西红花苷理想的替代资源。西红花苷的生物合成途径研究在国际上备受关注，本研究旨在揭示栀子中西红花苷的生物合成途径，研究发现两个糖基转移酶(gjugt94e13和gjugt74f8)能够催化西红花酸合成西红花苷产物，为西红花苷的体外合成及大规模应用奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供两个参与西红花酸合成至西红花苷的糖基转移酶基因及其编码的蛋白质。

本发明的另一目的在于提供一种栀子中西红花苷合成关键酶基因的筛选方法。本发明的第三个目的在于提供对上述筛选出的关键酶基因gjugt94e13和gjugt74f8的功能验证方法。

本发明提供的gjugt94e13和gjugt74f8基因，其核苷酸序列为seqidno.1和seqidno.2所示，或其突变序列。

本发明提供的gjugt94e13和gjugt74f8基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示，或其突变序列。

本发明目的可通过如下技术方案实现，技术方案一：基于转录组的栀子西红花苷合成关键酶基因筛选，步骤如下：

1)uplc检测栀子根、茎、叶、花、幼果、绿果和红果中西红花苷i和ii的含量差异。

2)基于栀子基因组，鉴定栀子糖基转移酶ugts基因家族成员，构建进化树分析栀子与其他物种ugts之间的进化关系，初筛栀子西红花苷生物合成途径中催化西红花酸至西红花苷的关键酶蛋白序列。

3)基于栀子不同组织部位转录组数据，分析差异基因表达，进一步筛选栀子西红花苷生物合成途径中催化西红花酸至西红花苷的关键酶基因。

技术方案二：关键酶基因gjugt94e13和gjugt74f8的功能验证。采用原核表达体系，以西红花酸为底物，体外鉴定糖基转移酶gjugt94e13和gjugt74f8的功能。

本发明公开了栀子中西红花酸合成至西红花苷的糖基转移酶编码基因gjugt94e13和gjugt74f8的筛选及功能鉴定方法，验证gjugt94e13和gjugt74f8具有催化西红花酸至西红花苷的功能，对阐明西红花苷生物合成途径提供分子基础，同时具有重大的应用价值。

附图说明

图1：栀子不同组织器官中西红花苷i和西红花苷ii的uplc检测。

图2：基于栀子基因组的糖基转移酶(ugts)家族成员鉴定及进化关系。

图3：栀子ugts编码基因在其不同组织部位中的差异表达。flower：花；leaf：叶；root：根；stem：茎；fruitlet：幼果；greenfruit：绿果；redfruit：红果。

图4：gjugt94e13和gjugt74f8的体外功能验证。a：gjugt94e13催化西红花酸生成西红花苷iv和西红花苷i，gjugt94e13分别催化西红花苷ii和西红花苷iii产生西红花苷i；b：gjugt74f8催化西红花酸产生西红花苷v和西红花苷iii，gjugt74f8催化西红花苷iii产生西红花苷v和西红花酸，gjugt74f8可逆地催化西红花苷iv和西红花苷ii的合成；c：推测的西红花苷合成途径。

图5：液相-质谱联用技术鉴定底物西红花酸和产物西红花苷i、ii、iii、iv、v。

具体实施方案

以下结合实例详细说明本发明。实施是为更好的理解本发明，但不限定于本发明。以下实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。

实施例1栀子根、茎、叶、花、幼果、绿果、红果中西红花苷含量检测

1.1实验方法

将栀子根、茎、叶、花、幼果、绿果、红果样品干燥后研磨成细粉过筛，每份样品精确称量0.25g于三角瓶中，加入50％色谱级甲醇25ml，称定容量，超声提取30分钟，放冷，再称定容量，50％甲醇补足失重。提取液过滤后过0.22μm滤膜获得供试样品。

利用uplc检测其化学成分。仪器型号，thermoultimate3000。进样量10μl，色谱柱：watersacquitybehc18column(1.7μm，100×2.1mm)，柱温：30℃。色谱条件：uv440nm，流动相：(a)：乙腈(含0.1％甲酸)，(b)：水(含0.1％甲酸)，流速：0.25ml/min，洗脱程序：0-5min，10％a线性增长至40％a；5-10min，40％a；10-11min，40％a-100％a，11-13min，100％a。

1.2结果与分析

在栀子根、茎、叶、花、幼果中皆未检测到西红花苷，在栀子绿果和红果中检测到西红花苷，且红果中的西红花苷含量高于绿果。其中幼果的果肉全部未成熟，为浅棕色；绿果的果肉有部分成熟，为浅红色；红果的果肉全部成熟，为红色。研究证明西红花苷在果实中特异性积累，并且随着果实的成熟，西红花苷的积累量增多。西红花苷在不同部位的差异分布为关键酶基因的筛选提供重要依据。

实施例2基于栀子基因组与转录组数据ugts基因的筛选及系统进化分析

2.1实验方法

基于栀子基因组注释信息，从tair数据库中提取拟南芥的ugts蛋白序列对栀子进行blastp，寻找同源基因，全长蛋白序列利用mega6软件构建nj系统进化树，boostrap选择重复1000次。采用hisat2将栀子根、茎、叶、花、幼果、绿果、红果的rna-seq数据比对至栀子基因组，利用cufflinks计算基因的表达量(fpkm)，进一步筛选出在栀子果实中特异高表达的ugts基因。

2.2结果与分析

基于栀子基因组数据，筛选出了173个ugts，聚类于15个亚家族，其中有超过50％的糖基转移酶属于ugt79、ugt73、ugt85和ugt94亚家族，68％的糖基转移酶不表达或低表达。四个糖基转移酶(gjgjugt74f8、gjgjugt94e13、gjugt85a15和gjugt87a7)在栀子绿果与红果中特异性高表达。

实施例3候选ugts编码基因的功能验证

3.1实验方法

将ugts编码基因克隆至pet32a载体中形成pet32a-ugts重组表达载体，将载体转化至bl21(de3)大肠杆菌表达菌株中。取过夜诱导的菌液2ml加入50mllb液体培养集中(含有50μg/ml氨苄青霉素抗性的培养基)，37℃，200rpm，活化2-3h，待其od600至0.4-0.5时，加入终浓度为0.3mm的iptg进行诱导，15℃，130rpm。诱导24h后，离心取菌体沉淀进行蛋白纯化，并利用bca蛋白试剂盒测定其浓度。

纯化的ugts蛋白在体外按照以下反应体系进行功能验证(200μl)：100mmtris-hcl(ph8.5)，50μg纯化的蛋白，5mmudp-glucose，40μm的西红花酸。用甲醇终止反应后混匀过0.22μm滤膜，利用uplc检测其化学成分。仪器型号，thermoultimate3000。进样量10μl，色谱柱：watersacquitybehc18column(1.7μm，100×2.1mm)，柱温：30℃。色谱条件：uv440nm，流动相：(a)：乙腈(含0.1％甲酸)，(b)：水(含0.1％甲酸)，流速：0.3ml/min，洗脱程序：0-5min，10％a线性增长至50％a；5-8min，50％a线性增长至90％a；8-10min，90％a线性增长至100％a，100％a持续一分钟后回到起始状态。

3.2结果与分析

3.2.1gjugt94e13功能验证结果与分析

液相检测结果显示该蛋白具有以下功能：

①催化西红花酸至西红花苷iv，并进一步转化为西红花苷i；

②催化西红花苷ii转化为西红花苷i；

③催化西红花苷iii转化为西红花苷i。

3.2.2gjugt74f8功能验证结果与分析

①催化西红花酸至西红花苷v，并进一步转化为西红花苷iii；

②催化西红花苷iv至西红花苷ii；

③催化西红花苷ii至西红花苷iv；

④催化西红花苷iii产生西红花苷v和西红花酸。

其他候选ugts显示无催化活性，以上描述均在液相色谱检测基础上判断，即与标准品相比具有相同的色谱行为(如：保留时间、光谱图等)，化合物的定性分析需要进行液质检测。

实施例4西红花苷产物的定性分析

4.1实验方法

利用agilenttechnologies1290infinityii和6545q-tof液质联用仪器检测产生的反应提取出来的产物，进行定性分析。进样量10μl，色谱柱：watersacquitybehc18column(1.7μm，100×2.1mm)，柱温：30℃。色谱条件：uv440nm，流动相：(a)：乙腈(含0.1％甲酸)，(b)：水(含0.1％甲酸)，流速：0.3ml/min，洗脱程序：0-5min，10％a线性增长至50％a：5-8min，50％a线性增长至90％a；8-10min，90％a线性增长至100％a，100％a持续一分钟后回到起始状态。6545q-tof质谱参数为：干燥气体温度为325℃，流速6l/min；鞘气为350℃，流速12.0l/min；喷雾器为45psig；vcap为4000v。

4.2结果与分析

液质检测结果显示催化底物及产物皆与标准品一致，因此确定这两个糖基转移酶具有催化西红花酸至西红花苷的功能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。