一种密码子优化的玉足海参α-淀粉酶基因及其重组表达载体与应用的制作方法

本发明涉及基因改造与蛋白表达技术领域，具体涉及一种密码子优化的玉足海参ɑ-淀粉酶基因及其重组表达载体与应用。

背景技术：

淀粉酶是一种水解酶，是目前发酵工业上应用最广泛的一类酶。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉和糖原等α-1,4-葡聚糖，水解其α-1,4-糖苷键。根据作用的方式，淀粉酶可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶能水解淀粉中的α-1,4-葡萄糖苷键，将淀粉切成长短不一的短链糊精和少量的低分子糖类，从而使淀粉糊的黏度迅速下降，起到降低稠度和“液化”的作用，从而提高动物肠道消化食物和吸收营养的能力。在鱼类研究中，α-淀粉酶被认为是鱼类幼体消化能力成熟的标志。在海参幼体发育前期，淀粉酶可作为一种饲料调节剂，提高海参的摄食和消化吸收效率。

玉足海参(holothurialeucospilota)属于楯手目(aspidochirotida)、海参科(holothuriidae)、海参属(holothuria)，在海洋生态修复方面起重要作用。基于玉足海参对推动我国热带海参资源恢复的积极作用，中国科学院南海海洋研究所相关课题组率先开展了玉足海参的人工育苗和养殖研究。为了提高海参的摄食和消化吸收效率，课题组试图通过原核表达的方法获得玉足海参α-淀粉酶。然而，玉足海参的α-淀粉酶基因无法在原核表达系统中成功表达，因此需要借助基因改造的方法来使玉足海参α-淀粉酶在原核表达系统中进行表达。

在众多的基因改造技术中，密码子优化技术是目前应用较广泛的技术。密码子优化是基于氨基酸具有密码子简并性的原理，通过改变基因序列中的一个或多个适合在原核表达系统中表达的密码子，而不改变原有的氨基酸序列，以确保表达的蛋白和内源分泌的蛋白具有相同的理化特性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种密码子优化的玉足海参α-淀粉酶基因及其重组表达载体与应用。通过密码子优化使玉足海参的α-淀粉酶基因在原核表达系统中成功表达出具有α-淀粉酶活性的蛋白，进而为人工养殖海参提供一种饲料调节剂，提高海参的摄食和消化吸收效率。

为实现上述发明目的，本发明以本课题组构建的玉足海参第二代转录组数据库中的α-淀粉酶基因的部分序列为基础，通过race技术获得该基因的全长序列，然后在ncbi数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测出其开放读码框(orf)。结果显示该淀粉酶基因全长cdna为1734bp，开放阅读框(orf)为1578bp，编码525个氨基酸，预测的分子量大小为59.34kda。该蛋白在n端含有信号肽和淀粉酶功能结构域，其中包括催化活性位点(图1)。

在图1所示玉足海参ɑ-淀粉酶基因序列基础上，对该基因信号肽后的前20个氨基酸的密码子进行优化。具体如下：(a)将第2和17位氨基酸密码子ttc替换为ttt；(b)将第6位氨基酸密码子gcc替换为gcg；(c)将第7位氨基酸密码子gtt替换为gtg；(d)将第8位氨基酸密码子gga替换为ggc；(e)将第10位氨基酸密码子cgt替换为cgc；(f)将第12位氨基酸密码子aca替换为acc；(g)将第13位氨基酸密码子ata替换为att；(h)将第16位氨基酸密码子ctt替换为ctg；(i)将第18位氨基酸密码子agt替换为agc。

即是：优化前α-淀粉酶蛋白编码基因序列(信号肽后的前20个氨基酸基因编码序列)：cagttcgataccaacgccgttggagatcgtgaaacaatagtgcagcttttcagttggaaa，氨基酸序列：qfdtnavgdretivqlfswk。

优化后的α-淀粉酶蛋白编码基因序列(信号肽后的前20个氨基酸基因编码序列，优化的密码子用加粗字体表示)：cagtttgataccaacgcggtgggcgatcgcgaaaccattgtgcagctgtttagctggaaa，氨基酸序列qfdtnavgdretivqlfswk。

具体的，本发明提供的一种密码子优化的玉足海参α-淀粉酶基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

一组扩增所述的密码子优化的玉足海参α-淀粉酶基因的引物，其包括以下引物：

amy-co-f1：5'-tggaaatggacagacgtagctctt-3'；

amy-co-f2：5'-cagtttgataccaacgcggtgggcgatcgcgaaaccattgtgcagctgtttagctggaaatggacagacgtagctctt-3'；

a-xho1-r：5'-gtggtggtggtggtgctcgagtctatatgaaagaaagtgac-3'；

其中，引物amy-co-f1和a-xho1-r用于ɑ-淀粉酶基因的剪辑，引物amy-co-f2和a-xho1-r用于ɑ-淀粉酶密码子优化序列的获得。

一种重组表达载体，含有上述的密码子优化的玉足海参α-淀粉酶基因。

优选，所述的重组表达载体的表达载体为pet28a质粒。

一种重组基因工程菌，上述的重组表达载体。

优选，所述的重组基因工程菌的宿主菌为大肠杆菌bl21。

本发明还提供一种上述的重组基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

将上述的密码子优化的玉足海参α-淀粉酶基因克隆至pet28a质粒，得到重组表达载体，将重组表达载体转化大肠杆菌bl21，得到重组基因工程菌。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

由于相比于其它动植物或细菌来源的淀粉酶，通过海参基因表达的淀粉酶作为饲料调节剂更有助于提高人工养殖海参的摄食和消化吸收效率，我们利用密码子优化技术对玉足海参的α-淀粉酶基因进行了改造，优化的玉足海参淀粉酶基因序列所编码的氨基酸序列与原基因序列编码一致，但可以在原核表达系统(大肠杆菌bl21)中成功表达出具有α-淀粉酶活性的蛋白。而未优化的α-淀粉酶序列无法在原核表达系统中表达(图4)。本发明有望为人工养殖海参提供一种利于摄食和消化的饲料调节剂。

附图说明

图1为玉足海参α-淀粉酶基因的核苷酸和氨基酸序列及密码子优化位点信息。

图2是用引物amy-co-f1和a-xho1-r进行pcr扩增所获得的玉足海参α-淀粉酶基因剪辑序列；

图3是用引物amy-co-f2和a-xho1-r进行pcr扩增所获得的玉足海参α-淀粉酶基因优化序列，加粗字体为含有优化密码子的序列，灰色标亮为优化后的密码子；

图4是未优化的α-淀粉酶序列无法在原核表达系统中表达。左边为加入1.0mmiptg诱导0,1,2,4,8小时未优化密码子的玉足海参α-淀粉酶重组蛋白的表达情况，右边为加入iptg至终浓度为0.1,0.3,0.5,0.7,1.0mm诱导4小时未优化密码子的玉足海参α-淀粉酶重组蛋白的表达情况，均未出现大小为59kda的目的条带。

图5为玉足海参α-淀粉酶基因密码子优化序列的原核表达及纯化。a为加入iptg诱导0,1,2,4,8小时玉足海参ɑ-淀粉酶重组蛋白的表达情况，b为加入iptg至终浓度为0.1,0.3,0.5,0.7,1.0mm玉足海参ɑ-淀粉酶重组蛋白的表达情况，c为ɑ-淀粉酶重组蛋白的纯化，m表示marker；1：37℃诱导的上清；2：37℃诱导的沉淀；3：20mmimidazole洗脱组分；4-5：50mmimidazole洗脱组分；6：500mmimidazole洗脱组分。

图6为玉足海参α-淀粉酶基因密码子优化序列原核表达后α-淀粉酶活性的测定。a为葡萄糖标准曲线，b为不同温度下α-淀粉酶的活性测定结果，c为不同ph下α-淀粉酶的活性测定结果。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法或者按照试剂盒说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。引物合成和测序由上海生物工程有限公司完成。

实施例1

1、玉足海参淀粉酶基因全长的获得以及开放读码框的预测

从本课题组构建的玉足海参第二代转录组数据库中筛选出α-淀粉酶基因的部分序列，并通过race技术获得该基因的全长序列。然后在ncbi数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测出其开放读码框(orf)。结果显示该淀粉酶基因全长cdna为1734bp，开放阅读框(orf)为1578bp，编码525个氨基酸，预测的分子量大小为59.34kda。该蛋白在n端含有信号肽和淀粉酶功能结构域，其中包括催化活性位点(图1)。

2、玉足海参α-淀粉酶基因密码子的优化和蛋白表达载体的构建

2.1玉足海参α-淀粉酶基因密码子的优化

2.1.1玉足海参α-淀粉酶拟优化序列的剪辑

(1)玉足海参肠组织dna的提取

取玉足海参肠组织，采用海洋动物组织基因组dna提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取玉足海参肠组织基因组dna，操作步骤严格按照说明书进行。基因组dna定量采用nanodrop^tm2000分光光度计完成，质量采用琼脂糖电泳来检测。

(2)序列剪辑引物的设计

以获得的α-淀粉酶基因的orf为基础，以剪辑掉orf信号肽之后的20个氨基酸所对应的基因序列为目的，采用primerpremier5软件设计引物amy-co-f1和a-xho1-r(表1)。为后续原核表达载体构建之需，a-xho1-r包含一段可与pet28a载体进行同源重组的序列，且包含酶切位点xho-i。

(3)pcr扩增

以玉足海参肠组织基因组dna为模板，利用引物amy-co-f1和a-xho1-r进行pcr扩增，反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，35个循环。

通过上述pcr扩增，获得被剪辑的玉足海参α-淀粉酶基因序列(如seqidno.2所示)。

2.1.2玉足海参α-淀粉酶基因优化序列的获得

(1)引物设计

设计引物amy-co-f2(表1)，该引物含有优化后的密码子以及部分与amy-co-f1相同的序列。

(2)pcr扩增

以2.1.1(3)pcr扩增所获得的pcr产物(被剪辑的玉足海参α-淀粉酶基因序列，稀释100倍)为模板，利用引物amy-co-f2和a-xho1-r进行pcr扩增，反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟，35个循环。

通过上述pcr扩增，获得玉足海参α-淀粉酶基因密码子优化序列(如seqidno.1所示)。该序列与图1所示的玉足海参ɑ-淀粉酶基因原序列有如下改变：(a)将第2和17位氨基酸密码子ttc替换为ttt；(b)将第6位氨基酸密码子gcc替换为gcg；(c)将第7位氨基酸密码子gtt替换为gtg；(d)将第8位氨基酸密码子gga替换为ggc；(e)将第10位氨基酸密码子cgt替换为cgc；(f)将第12位氨基酸密码子aca替换为acc；(g)将第13位氨基酸密码子ata替换为att；(h)将第16位氨基酸密码子ctt替换为ctg；(i)将第18位氨基酸密码子agt替换为agc，具体如图2和3所示。

2.2玉足海参α-淀粉酶蛋白表达载体的构建

(1)引物设计

采用primerpremier5软件，根据玉足海参α-淀粉酶基因密码子优化序列信息和pet28a载体的特点，设计引物amy-co-f3(表1)，该引物含有一段可与pet28a载体进行同源重组的序列，且包含酶切位点sac-i以及部分与amy-co-f2相同的序列。

(2)pcr扩增

以2.1.2(2)pcr扩增获得的pcr产物(玉足海参α-淀粉酶基因密码子优化序列，稀释100倍)为模板，利用引物amy-co-f3和a-xho1-r进行pcr扩增，反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟，35个循环，获得pcr产物。

(3)原核表达载体构建

将2.2(2)pcr扩增获得的pcr产物回收纯化后再利用同源重组的方法构建pet28a载体，具体为制备带有xho-i和sac-i酶切位点的线性化pet28a载体，然后在16℃的水浴条件下按一定比列与含有两个相同酶切位点以及优化密码子的玉足海参淀粉酶目的基因进行同源重组，得到优化密码子的玉足海参α-淀粉酶重组表达质粒[即将玉足海参α-淀粉酶基因密码子优化序列(其核苷酸序列如seqidno.1所示)插入到pet28a载体的xho-i和sac-i酶切位点之间]，然后将重组表达质粒转化到bl21大肠杆菌表达系统。

表1.玉足海参α-淀粉酶密码子优化及原核表达载体构建引物表

3、玉足海参α-淀粉酶蛋白的表达纯化和活性检测

3.1玉足海参α-淀粉酶蛋白的表达和纯化

经测序验证后，将构建好的优化密码子的玉足海参α-淀粉酶重组表达质粒转入宿主大肠杆菌bl21(de3)中；随机挑取5个单克隆菌落，分别接种至5ml1μg/mlkan+的kan+lb液体培养基中，37℃，250rpm振荡培养过夜(12-16小时)；第二天将过夜培养的菌液按1:50v/v比例接种至新鲜的kan+lb液体培养基中，37℃，250rpm培养至od600约为0.6；加入iptg至终浓度1.0mm分别诱导0,1,2,4,8小时，30℃，200rpm；或分别加入iptg至终浓度为0.1,0.3,0.5,0.7,1.0mm，30℃，200rpm，诱导4小时；以确定最佳iptg浓度和诱导时间，1000xg，离心1min，收集菌体于4℃保存；向收集的菌体中加入50μl双蒸水涡旋混匀，并从中取10μl加入等体积2×loadingbuffer，于沸水中煮3-5分钟，得到蛋白样品；将处理后的蛋白样品进行sds-page蛋白电泳分析，检测玉足海参ɑ-淀粉酶重组蛋白的表达情况，结果见图5。以未优化的α-淀粉酶作为对照(即以未优化的α-淀粉酶的编码序列代替玉足海参α-淀粉酶基因密码子优化序列进行与玉足海参α-淀粉酶基因密码子优化序列相同的原核表达载体构建，α-淀粉酶蛋白的表达和纯化步骤)，结果显示未优化的α-淀粉酶序列无法在原核表达系统中表达(图4)。

确定iptg诱导浓度为1mm，诱导时间为4小时，将此诱导条件下获得的菌液进行以下实验：

收集粗蛋白：将菌体用缓冲液(8murea,50mmtris-hcl,300mmnacl,0.1％tritonx-100,ph8.0)溶解、超声破碎，离心收集上清粗蛋白。平衡：取5mlni-nta，用5倍柱床体积的bindingbuffer清洗平衡柱子，流速5ml/min；孵育：将粗蛋白与平衡后的柱填料孵育1h；上柱：将孵育后的产物上柱，收集流出；平衡：用bindingbuffer清洗平衡柱子；洗杂：用washingbuffer洗柱子，并收集流出；洗脱：用elutionbuffer洗脱，收集流出；纯化检测：对粗蛋白、洗杂流出、洗脱流出分别处理，制样，准备sds-page检测。透析浓缩：将洗脱收集流出的组分透析到含50mmtris，300mmnacl，ph8.0的溶液中，透析结束后用peg20000浓缩，0.22μm滤膜过滤后分装1ml/tube，-80℃保存，得到纯化后的玉足海参α-淀粉酶。

3.2玉足海参ɑ-淀粉酶蛋白的活性检测

利用α-淀粉酶(α-al)活性检测试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司，型号bc0615)检测纯化后的玉足海参α-淀粉酶活性，具体检测方法参考该试剂盒说明书，然后制作葡萄糖标准曲线，检测在不同ph和不同温度条件下的淀粉酶活性。一个单位酶活定义为：在最优的温度(50℃)和ph(6.0)的情况下每分钟产生1mol葡萄糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位。玉足海参α-淀粉酶在562nm(a562)处的吸光度为a562＝0.836，代入标准曲线y＝1.966x+0.2246(r²＝0.997)中得到x＝0.56mg/ml，经过计算确定玉足海参α-淀粉酶的活性为62.2u/mg，结果见图6。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国科学院南海海洋研究所

<120>一种密码子优化的玉足海参α-淀粉酶基因及其重组表达载体与应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1533

<212>dna

<213>玉足海参(holothurialeucospilota)

<400>1

cagtttgataccaacgcggtgggcgatcgcgaaaccattgtgcagctgtttagctggaaa60

tggacagacgtagctcttgaatgtgaaagattcttggggcccaacggatatggaggggta120

caagtatcaccaccaaacgaccacactatcatgaatgatccatttcgaccgtggtgggag180

agatatcaagtcgcagggtacaacctcgtaagtcgcagtggtgacgaaaacgagtttgcg240

gacatggtggagagatgtaatcaagccaacgttagaatatatgtagacgccgtcattaac300

cacatggcgttctttggtggggattcagcaagcggggagccttttaatccggacgaacta360

gattatccaactgtgccatacacggaggaagatttcagcgtttattacggtctctgtagc420

accacgaaccaagatattctcaaccagtcgagtgttaaggagttacgcgactgtaacctg480

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agaggagaaggccaagaagagattgtgaattttaaagaacccaaggaatacaaaatggct960

aacgctctcatgctggcgtggccttacggtatcaacagggtcatgtcaagttatgaattt1020

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aatatggtcaagtaccagaacgtggtgcgcaaagaatctgttatgaattggtgggacaat1200

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ctcgaacagaatctgaccgagaccataatgacaggcctaccacagggtgaatactgtaat1320

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ttggcgttcctcctgtcaccttctttcatatag1533

<210>2

<211>1479

<212>dna

<213>玉足海参(holothurialeucospilota)

<400>2

tggaaatggacagacgtagctcttgaatgtgaaagattcttggggcccaacggatatgga60

ggggtacaagtatcaccaccaaacgaccacactatcatgaatgatccatttcgaccgtgg120

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