本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定番茄果形的方法及其专用引物对。
背景技术
果实形状(简称果形)是园艺作物的一种重要农艺性状，直接决定园艺产品的外观品质与用途。在番茄中，相较于圆形果，长形果的腔室横截面积更小，机械强度更大，同时不易在传送带上滚动，因而更适于机械采收与加工。在全世界范围内，绝大多数的加工番茄果实都是长形的。因此，在加工番茄育种中鉴定与筛选长果材料是十分重要的。
分子标记辅助育种是当前育种工作的重要辅助手段，其核心是开发出准确、稳定、便捷、高效的分子标记，可以直接对基因型进行选择，加速育种中选择的准确性与效率，显著缩短育种周期。因此，开发高效的分子标记对于品种改良及新品种选育具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种鉴定番茄果形的方法及其专用引物对。
本发明首先保护一种特异引物对，由序列表的序列1所示的单链dna分子和序列表的序列2所示的单链dna分子组成。
本发明还保护所述特异引物对在鉴定番茄果形性状中的应用。
本发明还保护所述特异引物对在筛选具有长果果形性状的番茄中的应用。
本发明还保护所述特异引物对在鉴定番茄基因组中是否具有sun突变中的应用。
本发明还保护所述特异引物对在筛选基因组中具有sun突变的番茄中的应用。
本发明还保护一种试剂盒，包括所述特异引物对；
所述试剂盒的功能为如下(a)、(b)、(c)或(d)：
(a)鉴定番茄果形性状；
(b)筛选具有长果果形性状的番茄；
(c)鉴定番茄基因组中是否具有sun突变；
(d)筛选基因组中具有sun突变的番茄。
本发明还保护所述特异引物对或所述试剂盒在番茄育种中的应用。
本发明还保护一种鉴定番茄果形性状的方法，包括如下步骤：以待测番茄的基因组dna为模板，采用所述特异引物对进行pcr扩增，如果可以实现特异性扩增，待测番茄为或候选为具有长果果形性状的番茄。可以实现特异性扩增具体体现为具有355bp-375bp的扩增产物。可以实现特异性扩增具体体现为具有360bp-370bp的扩增产物。可以实现特异性扩增具体体现为具有365bp的扩增产物。可以实现特异性扩增具体体现为获得序列表的序列3所示的扩增产物。
本发明还保护一种筛选具有长果果形性状的番茄的方法，包括如下步骤：以待测番茄的基因组dna为模板，采用所述特异引物对进行pcr扩增，选择可以实现特异性扩增的待测番茄，即为或候选为具有长果果形性状的番茄。可以实现特异性扩增具体体现为具有355bp-375bp的扩增产物。可以实现特异性扩增具体体现为具有360bp-370bp的扩增产物。可以实现特异性扩增具体体现为具有365bp的扩增产物。可以实现特异性扩增具体体现为获得序列表的序列3所示的扩增产物。
本发明还保护一种鉴定番茄基因组中是否具有sun突变的方法，包括如下步骤：以待测番茄的基因组dna为模板，采用所述特异引物对进行pcr扩增，如果可以实现特异性扩增，待测番茄基因组中具有sun突变。可以实现特异性扩增具体体现为具有355bp-375bp的扩增产物。可以实现特异性扩增具体体现为具有360bp-370bp的扩增产物。可以实现特异性扩增具体体现为具有365bp的扩增产物。可以实现特异性扩增具体体现为获得序列表的序列3所示的扩增产物。
本发明可以用于筛选或者培育具有长果果形性状的番茄，实现早期鉴定，操作简便，准确性极高，具有重大的应用推广价值。
附图说明
图1为引物相对位置示意图。
图2为采用引物对1或引物对2作为供试引物对时电泳图。
图3为采用引物对5或引物对6或引物对11或引物对12作为供试引物对时电泳图。
图4为采用引物对14或引物对15或引物对16或引物对17作为供试引物对时电泳图。
图5为采用引物对7或引物对8作为供试引物对时电泳图。
图6为采用引物对3或引物对4或引物对9或引物对10或引物对13作为供试引物对时电泳图。
图7为50种番茄材料采用引物对1的电泳图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
现有技术中，番茄果形性状通常采用如下标准判断：果实长宽比>1.05，为长果；果实长宽比为0.95-1.05(含两个端值)，为圆果；果实长宽比<0.95，为扁果。
实施例1、引物的设计
番茄长果形性状主要受3个数量性状位点控制，包括sun、ovate和fs8.1。其中，sun位点的作用最大。具有sun突变的果实，其果形指数(果实最大长度与最大宽度之比)均在1.2以上。细胞学水平研究发现，具有sun突变的果实，纵向细胞数增加，横向细胞数减小，从而果实伸长，但果实细胞总不改变数。遗传与分子生物学水平研究发现，sun突变位于番茄7号染色体，是由一个长度为24.7kb的长片段插入所导致的。这一插入片段来源于番茄10号染色体，包含多个基因，其中包括sun基因与逆转录酶rider基因。在逆转座酶rider的介导下，这一长片段发生转录本的通读与重排，并最终形成了24.7kb的转座子，插入到7号染色体defl1基因的第一个内含子中。sun突变及其周边序列以及相应的野生型序列的比较示意图见图1。在defl1启动子的驱动下，sun基因高度表达，最终导致了果形的改变。由于插入片段长度大、序列结构复杂，导致针对这一变异的分子标记开发较为困难。
对24.7kb的长片段、番茄7号染色体和番茄10号染色体进行序列分析，以defl1基因第一外显子至24.7kb插入片段中sun基因上游之间为靶区域，设计若干引物对。
引物相对位置示意图见图1。
引物对1如下：
sun-fd2(序列表的序列1)：5’-agccatgcttgttatggctactggt-3’；
sun-lr3(序列表的序列2)：5’-agacgctatgggaaaccctattctg-3’。
引物对1在番茄bananalegs和番茄orangebanana中的靶序列均为365bp，如序列表的序列3所示。
引物对2如下：
sun-fd2：5’-agccatgcttgttatggctactggt-3’；
sun-lr2：5’-gccaatttgttggtgaaccacgt-3’；
理论靶序列284bp。sun-lr2对应于sun-lr3上游81bp。
引物对3如下：
sun-fd2：5’-agccatgcttgttatggctactggt-3’；
sun-lr4：5’-caagcctgttagggcgtagcttag-3’；
理论靶序列399bp，sun-lr4对应于sun-lr3下游34bp。
引物对4如下：
sun-fd2：5’-agccatgcttgttatggctactggt-3’；
sun-lr5：5’-ttgggcccttaattttctgttgatt-3’；
理论靶序列438bp，sun-lr5对应于sun-lr3下游73bp。
引物对5如下：
sun-fd2：5’-agccatgcttgttatggctactggt-3’；
sun-lr6：5’-acccgctacaaacagaaaggacg-3’；
理论靶序列577bp，sun-lr6对应于sun-lr3下游212bp。
引物对6如下：
sun-fd2：5’-agccatgcttgttatggctactggt-3’；
sun-lr7：5’-ggtctgttgaatgccttgaatcgg-3’；
理论靶序列601bp，sun-lr7对应于sun-lr3下游236bp。
引物对7如下：
sun-ef2：5’-agccatgcttgttatggctactggt-3’；
sun-lr2：5’-gccaatttgttggtgaaccacgt-3’；
理论靶序列323bp，sun-ef2对应于sun-fd2上游39bp，sun-lr2对应于sun-lr3上游81bp。
引物对8如下：
sun-ef2：5’-agccatgcttgttatggctactggt-3’；
sun-lr3：5’-agacgctatgggaaaccctattctg-3’；
理论靶序列404bp，sun-ef2对应于sun-fd2上游39bp。
引物对9如下：
sun-ef2：5’-agccatgcttgttatggctactggt-3’；
sun-lr4：5’-caagcctgttagggcgtagcttag-3’；
理论靶序列438bp，sun-ef2对应于sun-fd2上游39bp，sun-lr4对应于sun-lr3下游34bp。
引物对10如下：
sun-ef2：5’-agccatgcttgttatggctactggt-3’；
sun-lr5：5’-ttgggcccttaattttctgttgatt-3’；
理论靶序列477bp，sun-ef2对应于sun-fd2上游39bp，sun-lr5对应于sun-lr3下游73bp。
引物对11如下：
sun-ef2：5’-agccatgcttgttatggctactggt-3’；
sun-lr6：5’-acccgctacaaacagaaaggacg-3’；
理论靶序列616bp，sun-ef2对应于与sun-fd2上游39bp，sun-lr6对应于sun-lr3下游212bp。
引物对12如下：
sun-ef2：5’-agccatgcttgttatggctactggt-3’；
sun-lr7：5’-ggtctgttgaatgccttgaatcgg-3’；
理论靶序列640bp，sun-ef2对应于sun-fd2上游39bp，sun-lr7对应于sun-lr3下游236bp。
引物对13如下：
sun-ef3：5’-atcttccacaagataagactttagagc-3’；
sun-lr2：5’-gccaatttgttggtgaaccacgt-3’；
理论靶序列447bp，sun-ef3对应于sun-fd2上游163bp，sun-lr2对应于sun-lr3上游81bp。
引物对14如下：
sun-ef3：5’-atcttccacaagataagactttagagc-3’；
sun-lr4：5’-caagcctgttagggcgtagcttag-3’；
理论靶序列562bp，sun-ef3对应于sun-fd2上游163bp，sun-lr4对应于sun-lr3下游34bp。
引物对15如下：
sun-ef3：5’-atcttccacaagataagactttagagc-3’；
sun-lr5：5’-ttgggcccttaattttctgttgatt-3’；
理论靶序列601bp，sun-ef3对应于sun-fd2上游163bp，sun-lr5对应于sun-lr3下游73bp。
引物对16如下：
sun-ef3：5’-atcttccacaagataagactttagagc-3’；
sun-lr6：5’-acccgctacaaacagaaaggacg-3’；
理论靶序列740bp，sun-ef3对应于sun-fd2上游163bp，sun-lr6对应于sun-lr3下游212bp。
引物对17如下：
sun-ef3：5’-atcttccacaagataagactttagagc-3’；
sun-lr7：5’-ggtctgttgaatgccttgaatcgg-3’；
理论靶序列764bp，sun-ef3对应于sun-fd2上游163bp，sun-lr7对应于sun-lr3下游236bp。
实施例2、引物对的应用方法
番茄bananalegs，属于大果型鲜食番茄，果形性状为长果(长宽比为2.10)，具有sun突变(已经测序验证)。番茄orangebanana，属于大果型鲜食番茄，果形性状为长果(长宽比为1.60)，具有sun突变(已经测序验证)。番茄la1589，属于醋栗番茄，果形性状为圆果(长宽比为1.00)，不具有sun突变(已经测序验证)。番茄greengrape，属于樱桃番茄，果形性状为圆果(长宽比为1.01)，不具有sun突变(已经测序验证)。
待测番茄分别为：番茄bananalegs、番茄orangebanana、番茄la1589、番茄greengrape。供试引物对分别为实施例1设计的17个引物对。
1、取待测番茄植株的基因组dna。
2、以步骤1得到的基因组dna为模板，采用供试引物对进行pcr扩增。
3、将步骤2得到的pcr扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。
采用引物对1或引物对2作为供试引物对时电泳图见图2。采用引物对5或引物对6或引物对11或引物对12作为供试引物对时电泳图见图3。采用引物对14或引物对15或引物对16或引物对17作为供试引物对时电泳图见图4。采用引物对7或引物对8作为供试引物对时电泳图见图5。采用引物对3或引物对4或引物对9或引物对10或引物对13作为供试引物对时电泳图见图6。图2至图6中：a代表番茄bananalegs，b代表番茄orangebanana，c代表番茄la1589，d代表番茄greengrape；m中，在上的箭头代表500bp，在下的箭头代表300bp。
采用引物对1，具有sun突变的番茄显示特异性扩增产物且不显示非特异性扩增杂带且不同品种条带亮度相当(代表扩增效率一致)，不具有sun突变的番茄无扩增产物。采用引物对2，a中显示非特异性扩增杂带，d中具有非目标性扩增产物。采用引物对3，a和b中均显示非特异性杂带，c和d中均显示非目标性扩增产物。采用引物对4，a中均不显示特异性带。采用有引物对5，a和b中均显示非特异性杂带，d中具有非目标性扩增产物。采用引物对6，a和b中均显示非特异性杂带，c和d中均具有非目标性扩增产物。采用引物对7，c和d中均显示非目标性扩增产物。采用引物对8，a和b中均显示非特异性杂带，c和d中均显示非目标性扩增产物。采用引物对9，a和b中均显示非特异性杂带，c和d中均显示非目标性扩增产物。采用引物对10，a和b中均显示非特异性杂带，d中显示非目标性扩增产物。采用引物对11，a和b和c和d中均显示非目标性扩增产物，无法区分sun突变。采用引物对12，a和b中均显示非特异性杂带，c和d中均具有非目标性扩增产物。采用引物对13，a和b中均显示非特异性杂带，c和d中均显示非目标性扩增产物。采用引物对14，c和d中均显示非目标性扩增产物。采用引物对15，a和b条带亮度差距大(代表扩增效率差距大)。采用引物对16，a和b中均显示非特异性杂带，c和d中均具有非目标性扩增产物。采用引物对17，a和b中均显示非特异性杂带，c和d中均具有非目标性扩增产物。
回收采用引物对1时番茄bananalegs和番茄orangebanana的特异性扩增产物，均为365bp，如序列表的序列3所示。
4、对待测番茄植株基因组中是否具有sun突变进行测序验证，准确率100％。
实施例3、引物对的应用
50份番茄材料。50份材料，包括樱桃番茄(例如农大珍珠)、大果型鲜食番茄(例如annarussian)、大果型加工番茄(例如sun1642)和醋栗番茄(例如la1215)。
每份番茄材料分别进行如下检查：
1、取待测番茄植株的基因组dna。
2、以步骤1得到的基因组dna为模板，采用引物对1进行pcr扩增。
pcr扩增的反应体系(25μl)：模板溶液2.0μl、10×buffer2.5μl、dntps1.0μl、dna聚合酶0.5μl、10μm/l正向引物1.0μl、10μm/l反向引物1.0μl，用ddh2o补齐至25μl。
pcr扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸5min。
3、将步骤2得到的pcr扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图7。
4、对番茄基因组中是否具有sun突变进行测序验证。
结果见表1。结果显示，采用引物对1鉴定番茄材料是否具有sun突变的成功率为100％，表明这个标记的适用性较强，育种实际应用中可以利用该标记对sun突变进行快速鉴定与筛选。具有sun突变的番茄，即为果形性状为长果的番茄。
表1
la开头的材料可以从美国番茄遗传资源中心(tomatogeneticsresourcecenter,http://tgrc.ucdavis.edu/)查询或并获得。pi开头品种可从u.s.nationalplantgermplasmsystem(https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/search.aspx？)查询并索取。annarussian，goldballlivingston，可从victoryseedco.(https://www.victoryseeds.com/)查询并购得。howardgerman，superitalianpaste，blackplum，grape，orangestrawberry，plumlemon，riograndevff和opalka可从tomatogrowerssupplyco.(http://www.tomatogrowers.com/)查询并购得。orangesanta可从wikigardener(http://gardener.wikia.com/wiki/orange_santa)查询。rosatotondo可从seedsfromitaly(http://www.growitalian.com/tomato-tondo-liscio-106-289/)查询并获取。“农大珍珠”可从中国农业大学园艺学院获得。“绿宝石”与“红贝贝”可从京研种业获取。齐达利可从先正达公司获取。t1379可从sgn查询。
sequencelisting
<110>中国农业大学
<120>一种鉴定番茄果形的方法及其专用引物对
<130>gncyx181635
<160>3
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>25
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>1
agccatgcttgttatggctactggt25
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<211>25
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<213>artificialsequence
<400>2
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<210>3
<211>365
<212>dna
<213>lycopersiconesculentum
<400>3
agccatgcttgttatggctactggttagacttctatcttttttatttaggttacgttcaa60
aatttattagcttttcgatattatgtcgataatgttatcgaataaatcactttctatcaa120
aaatatcgataattcaagtcatctcctcacattttttagttatttctagtaaaaaattta180
aatatcgtaccataatatttgttgtgcggaatttgagataatacgagaaaatataaacgc240
gaaaaataagacaacagatttacgtggttcaccaacaaattggctacgtccacgggaaga300
gagggagcagttttattatggagaggcaaaaacagaattacagaatagggtttcccatag360
cgtct365