本发明涉及肿瘤干细胞分离检测技术领域，具体为一种肿瘤干细胞的分离检测方法。
背景技术
肿瘤干细胞是指肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞，传统观念认为，肿瘤是由体细胞突变而成，每个肿瘤细胞都可以无限制地生长，但这无法解释肿瘤细胞似乎具有无限的生命力以及并非所有肿瘤细胞都能无限制生长的现象，肿瘤细胞生长、转移和复发的特点与干细胞的基本特性十分相似，因此，有学者提出肿瘤干细胞的理论，这一理论为我们重新认识肿瘤的起源和本质，以及临床肿瘤治疗提供了新的方向和视觉角度，近年来大量报道发现肿瘤中有极少数的一群细胞，其恶性程度极高，当病人放化疗后大的肿瘤块随即消失，然而这些极少量的细胞仍然能够存活，pet-ct也不能够检测其存在，而正是这些恶性细胞复发以后，便更加凶猛，大量转移吞噬生命，这些细胞就是肿瘤干细胞，当今许多主流的观点认为放化疗富集的肿瘤干细胞是导致传统治疗方法失败的主要原因，2006年美国癌症研究协会给出tsc的定义是：肿瘤中具有自我更新能力并能分化产生异质性肿瘤细胞的细胞，它的自我更新能力以及分化能力完全满足干细胞特有的两个主要特征，而这两个特征正是造成肿瘤复发和肿瘤转移的必要原因。
目前的肿瘤干细胞分离和检测过程中，大多是直接通过显微镜对组织细胞进行分离和检测，然而，这样通过简单目测的方式不能更加直观的观察肿瘤干细胞分离和检测情况，不能实现通过对肿瘤干细胞内的dna物质进行荧光染色来方便工作人员进行更加直观的贯穿肿瘤干细胞，无法达到缩短工作人员分离和检测肿瘤干细胞时间的目的，从而给工作人员的肿瘤干细胞分离和检测工作带来了极大的不便。
技术实现要素：
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种肿瘤干细胞的分离检测方法，解决了不能更加直观的观察肿瘤干细胞分离和检测情况，不能实现通过对肿瘤干细胞内的dna物质进行荧光染色来方便工作人员进行更加直观的贯穿肿瘤干细胞，无法达到缩短工作人员分离和检测肿瘤干细胞时间目的的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种肿瘤干细胞的分离检测方法，具体包括以下步骤：
s1、样本的制备：首先将取样的肿瘤细胞加入试管中，然后向试管中加入一号消化酶液，可将取样的肿瘤细胞消化至单个细胞，然后对样本进行离心和沉淀，再对沉淀的细胞进行收集，即可得到样本细胞；
s2、消化酶状态模拟：将s1中收集的样本细胞中加入二号消化酶液，并在20～36℃孵育1～10h，从而实现模拟消化酶的应激状态，之后将孵育后的细胞移至1～18℃条件下继续孵育10～72h，即可实现模拟低温和消化酶应激状态；
s3、无血清和低氧状态模拟：将s2中孵育后的细胞分别经洗涤、离心和沉淀后，得到的细胞加入不含血清或血清低于6％的细胞培养液，均匀混合，在密闭条件下，在20～36℃下孵育25～65h，即可实现模拟无血清和低氧应激状态；
s4、肿瘤细胞的分离：将s3中孵育后的细胞离心和沉淀收集的细胞，加入含5～15％fbs的细胞培养液，均匀混合，之后将细胞接种到细胞培养皿中进行贴壁生长，细胞贴壁后换肿瘤干细胞tsc培养基进行培养，当细胞长满后，重复s1-s4步骤即可得到肿瘤细胞；
s5、肿瘤干细胞的检测筛选：将s4述获得的肿瘤细胞接种到细胞培养皿中，采用tsc培养基，并向tsc培养基中加入hoechst33342荧光染料，使荧光染料穿透细胞膜与dna结合，即可实现将肿瘤细胞的细胞核进行染色，染成蓝色，然后使肿瘤细胞进行单细胞低密度贴壁生长，之后检测人员使用荧光显微镜对tsc培养基内的培养细胞进行检测，肿瘤细胞染上色深，肿瘤干细胞染上色少，再通过流式细胞仪将肿瘤干细胞分离出来，即可得到肿瘤干细胞。
优选的，所述步骤s5中的hoechst33342是一种脂溶性的蓝色荧光染料，可以穿透细胞膜与dna结合，常用于细胞调亡的检测，也用于普通的细胞核染色或常规dna染色。
优选的，所述所有细胞培养液根据不同种类肿瘤细胞选择不同的细胞基础培养基。
优选的，所述步骤s1中一号消化酶液中的消化酶为胰蛋白酶，且步骤s2中的二号消化酶液为0.1～3u/ml的dispase分散酶液。
(三)有益效果
本发明提供了一种肿瘤干细胞的分离检测方法。与现有技术相比具备以下有益效果：该肿瘤干细胞的分离检测方法，通过在具体包括以下步骤：s1、样本的制备：首先将取样的肿瘤细胞加入试管中，然后向试管中加入一号消化酶液，可将取样的肿瘤细胞消化至单个细胞，s2、消化酶状态模拟：将s1中收集的样本细胞中加入二号消化酶液，并在20～36℃孵育1～10h，从而实现模拟消化酶的应激状态，s3、无血清和低氧状态模拟：将s2中孵育后的细胞分别经洗涤、离心和沉淀后，得到的细胞加入不含血清或血清低于6％的细胞培养液，均匀混合，在密闭条件下，在20～36℃下孵育25～65h，s4、肿瘤细胞的分离：将s3中孵育后的细胞离心和沉淀收集的细胞，加入含5～15％fbs的细胞培养液，均匀混合，s5、肿瘤干细胞的检测筛选：将s4述获得的肿瘤细胞接种到细胞培养皿中，采用tsc培养基，并向tsc培养基中加入hoechst33342荧光染料，使荧光染料穿透细胞膜与dna结合，即可实现将肿瘤细胞的细胞核进行染色，可实现更加直观的观察肿瘤干细胞分离和检测情况，很好的实现了通过对肿瘤干细胞内的dna物质进行荧光染色来方便工作人员进行更加直观的贯穿肿瘤干细胞，达到了缩短工作人员分离和检测肿瘤干细胞时间的目的，从而大大方便了工作人员的肿瘤干细胞分离和检测工作。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供一种技术方案：一种肿瘤干细胞的分离检测方法，具体包括以下步骤：
s1、样本的制备：首先将取样的肿瘤细胞加入试管中，然后向试管中加入一号消化酶液，可将取样的肿瘤细胞消化至单个细胞，然后对样本进行离心和沉淀，再对沉淀的细胞进行收集，即可得到样本细胞；
s2、消化酶状态模拟：将s1中收集的样本细胞中加入二号消化酶液，并在20～36℃孵育1～10h，从而实现模拟消化酶的应激状态，之后将孵育后的细胞移至1～18℃条件下继续孵育10～72h，即可实现模拟低温和消化酶应激状态；
s3、无血清和低氧状态模拟：将s2中孵育后的细胞分别经洗涤、离心和沉淀后，得到的细胞加入不含血清或血清低于6％的细胞培养液，均匀混合，在密闭条件下，在20～36℃下孵育25～65h，即可实现模拟无血清和低氧应激状态；
s4、肿瘤细胞的分离：将s3中孵育后的细胞离心和沉淀收集的细胞，加入含5～15％fbs的细胞培养液，均匀混合，之后将细胞接种到细胞培养皿中进行贴壁生长，细胞贴壁后换肿瘤干细胞tsc培养基进行培养，当细胞长满后，重复s1-s4步骤即可得到肿瘤细胞；
s5、肿瘤干细胞的检测筛选：将s4述获得的肿瘤细胞接种到细胞培养皿中，采用tsc培养基，并向tsc培养基中加入hoechst33342荧光染料，使荧光染料穿透细胞膜与dna结合，即可实现将肿瘤细胞的细胞核进行染色，染成蓝色，然后使肿瘤细胞进行单细胞低密度贴壁生长，之后检测人员使用荧光显微镜对tsc培养基内的培养细胞进行检测，肿瘤细胞染上色深，肿瘤干细胞染上色少，再通过流式细胞仪将肿瘤干细胞分离出来，即可得到肿瘤干细胞。
本发明中，步骤s5中的hoechst33342是一种脂溶性的蓝色荧光染料，可以穿透细胞膜与dna结合，常用于细胞调亡的检测，也用于普通的细胞核染色或常规dna染色。
本发明中，所有细胞培养液根据不同种类肿瘤细胞选择不同的细胞基础培养基。
本发明中，步骤s1中一号消化酶液中的消化酶为胰蛋白酶，且步骤s2中的二号消化酶液为0.1～3u/ml的dispase分散酶液。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。