一种促进人骨髓间充质干细胞增殖的方法与流程

本发明属于生物领域，涉及一种促进人骨髓间充质干细胞增殖的方法。
背景技术：
骨髓间充质干细胞是骨髓中成骨细胞的祖细胞，对其成骨性分化能力的研究一直是骨科领域的一大热点，而促进其向成骨方向分化也是防治骨质疏松症的主要方法之一。目前，骨髓间充质干细胞应用的一个难点在于如何大量获得骨髓间充质干细胞。α-雪松烯、β-雪松烯、γ-雪松烯和异雪松酮为雪松中分离得到的化合物，化学结构如下。目前尚未见上述化合物在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种促进人骨髓间充质干细胞增殖的方法。本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：一种促进人骨髓间充质干细胞增殖的方法，包括如下步骤：采集新鲜骨髓，肝素钠抗凝后加等量生理盐水，percoll细胞分离液密度梯度离心，取中间单核细胞层以低糖dmem培养基清洗，接种入培养皿中，加入完全培养基后，置于5％co2培养箱中培养。24h后换液，弃未贴壁的细胞。以后每2～3d换液，待细胞生长至90％汇合后胰蛋白酶消化传代培养；取传代细胞，消化制成细胞悬液，接种于培养瓶中，培养于完全培养基中，37℃、5％co2培养24h后，更换为含药完全培养基继续培养；所述含药完全培养基含有有效浓度的α-雪松烯或β-雪松烯。优选地，所述完全培养基为含10％fbs的dmem/f12培养基。α-雪松烯或β-雪松烯在制备促进人骨髓间充质干细胞增殖的培养基中的应用。α-雪松烯或β-雪松烯在制备促进人骨髓间充质干细胞增殖的药物中的应用。有益效果：本发明发现，α-雪松烯、β-雪松烯和异雪松酮可以有效促进人骨髓间充质干细胞的增殖，且不会影响其多向分化能力，α-雪松烯、β-雪松烯和异雪松酮可以用作添加剂制备促进人骨髓间充质干细胞增殖的培养基，可以制成促进人骨髓间充质干细胞增殖的药物。附图说明图1为各组450nm测定吸光度；图2为茜素红染色结果，其中：a为对照组染色结果，b为α-雪松烯组染色结果，c为β-雪松烯组染色结果，d为异雪松酮组染色结果；图3为油红o染色结果，其中：a为对照组染色结果，b为α-雪松烯组染色结果，c为β-雪松烯组染色结果，d为异雪松酮组染色结果。具体实施方式下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。一、实验材料dmem/f12培养基、低糖dmem培养基、胎牛血清购自美国gibco公司。α-雪松烯、β-雪松烯、γ-雪松烯和异雪松酮自制或购买，纯度不低于98％。细胞计数试剂盒(cck-8)购自日本株式会社同仁化学研究所。二、实验方法1、人骨髓间充质干细胞的分离与培养采集健康志愿者额骨内骨髓20ml，肝素钠抗凝后加等量生理盐水，percoll细胞分离液(1.073×10-3g/l)密度梯度离心，取中间单核细胞层以低糖dmem培养基清洗2次，接种入15cm培养皿中，加入完全培养基(含10％fbs的dmem/f12培养基)后，置于5％co2培养箱中培养。24h后换液，弃未贴壁的细胞。以后每2～3d换液，待细胞生长至90％汇合后胰蛋白酶消化传代培养，记为p1。使用p5细胞用于后续实验。2、分组及干预取第5代人骨髓间充质干细胞，按如下组别进行分组干预：对照组：使用完全培养基培养；α-雪松烯组：使用含有15μmα-雪松烯的完全培养基培养；β-雪松烯组：使用含有15μmβ-雪松烯的完全培养基培养；γ-雪松烯组：使用含有15μmγ-雪松烯的完全培养基培养；异雪松酮组：使用含有15μm异雪松酮的完全培养基培养。3、细胞增殖活力测定取第5代人骨髓间充质干细胞，消化制成细胞悬液，以4×105/孔接种于96孔培养板上，培养于完全培养基中，37℃，5％co2培养24h后，按照上述分组及干预方法更换培养基继续培养24h；培养结束后，每孔加入细胞计数试剂盒中的cck-8溶液10μl，在细胞培养箱内继续孵育2h后，分别用酶标仪在450nm测定吸光度，每组实验重复3次。4、诱导验证人骨髓间充质干细胞成骨成脂分化能力取第5代人骨髓间充质干细胞，消化制成细胞悬液，以2.5×105个/cm2细胞数接种于培养瓶中，培养于完全培养基中，37℃，5％co2培养24h后，按照上述分组及干预方法更换培养基继续培养24h；培养结束后，弃培养基洗涤，消化制成细胞悬液，以8×103个/cm2细胞数种植于12孔板；分别添加成骨、成脂分化诱导液，每3d换液，分别培养20d、16d后利用茜素红、油红o染色染色。具体步骤为：将人骨髓间充质干细胞漂洗后，4℃、40g/l多聚甲醛固定10min；去离子水漂洗，分别用1ml的茜素红、油红o染色室温下染色30min，彻底清洗后显微镜下观察拍照。其中：成骨分化诱导液为含10％胎牛血清、0.1μm地塞米松、10mmβ-甘油磷酸钠、50μm抗坏血酸的dmem/f12；成脂分化诱导液为含10％胎牛血清、0.1μm地塞米松、10μm胰岛素、200μm吲哚美辛、0.5mm异丁甲基黄嘌呤的dmem/f12。5、数据处理采用均数±标准差表示，用spss17.0统计软件包进行t检验，p＜0.05为有显著性差异。三、实验结果1、α-雪松烯、β-雪松烯、γ-雪松烯和异雪松酮对人骨髓间充质干细胞增殖能力的影响结果如表1和图1所示，可见，α-雪松烯、β-雪松烯和异雪松酮可以显著促进人骨髓间充质干细胞的增殖，差异具有统计学意义(p＜0.05)；γ-雪松烯促进作用不明显(p＞0.05)。表1各组450nm测定吸光度(od450)组别od450对照组0.4622±0.023α-雪松烯组0.7525±0.027β-雪松烯组0.7454±0.026γ-雪松烯组0.4908±0.021异雪松酮组0.8117±0.0242、α-雪松烯、β-雪松烯和异雪松酮对人骨髓间充质干细胞分化能力的影响实验结果如图2、3所示，结果可见，各组人骨髓间充质干细胞均具有优异的成骨成脂分化能力，α-雪松烯、β-雪松烯和异雪松酮不会影响人骨髓间充质干细胞的分化能力。综上可见，α-雪松烯、β-雪松烯和异雪松酮可以有效促进人骨髓间充质干细胞的增殖，且不会影响其多向分化能力，α-雪松烯、β-雪松烯和异雪松酮可以用作添加剂制备促进人骨髓间充质干细胞增殖的培养基，可以制成促进人骨髓间充质干细胞增殖的药物。上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。当前第1页12