本发明涉及一种从爬山虎中提取分离木犀草素和异槲皮苷的方法，属于天然产物化学的技术领域。
背景技术：
爬山虎，又叫捆石龙、枫藤、小虫儿卧草、红丝草、红葛、趴山虎、红葡萄藤、巴山虎，葡萄科植物。夏季开花，花小，呈黄绿色，浆果紫黑色。常见攀缘在墙壁岩石上。爬山虎的根茎可入药，破瘀血、消肿毒；果可酿酒，但它的根会分泌酸性物质腐蚀石灰岩,它的根会沿着墙的缝隙钻入其中,使缝隙过大,严重可至墙体碎裂倒塌。
木犀草素为黄色针状结晶，熔点328-330℃。具弱酸性，可溶于碱性溶液中，溶于乙醇、甲醇等有机溶剂中,难溶于冷水,微溶于热水,在浓硫酸溶液中生成烊盐,暗红色,紫外灯照射下,呈现暗棕色,无旋光性。
异槲皮苷为黄色针状结晶(水)，熔点225～227℃，几乎不溶于冷水，微溶于沸水，溶于碱溶液显深黄色。黄色结晶(乙醇)，熔点206～208℃和232～236℃。淡黄色针晶，熔点220～222℃(分解)。结晶(热水)，熔点230℃。
公开号为cn101973975a的中国专利介绍了一种从灰毡毛忍冬提取木犀草素的方法，步骤包括：(1)粉碎干燥灰毡毛忍冬，并将灰毡毛忍冬、60％乙醇按重量(kg)/体积比(v)＝1∶1-3进行混合，加热回流提取；(2)提取液先纱布粗滤，然后离心取上清液，减压浓缩至无乙醇味；(3)将浓缩液用1.5-3倍体积的乙酸乙酯萃取三次，分离乙酸乙酯层并进行浓缩，直至获得干燥物；(4)加入60％乙醇进行加热溶解，然后加入活性碳进行脱色，再进行浓缩直至获得干燥物；(5)加入90％乙醇进行加热溶解，然后加入热水调节乙醇终浓度为30-40％，室温过夜结晶，得木犀草素纯品。
公开号为cn104710391a的中国专利介绍了一种利用花生壳提取木犀草素和β-谷甾醇的方法，步骤包括：(1)花生壳的收集：将花生壳晒干或烘干粉碎原料至20～40目，加入70～85％乙醇水溶液，加热至35～55℃回流提取2～5h，陶瓷膜过滤一次得滤液，滤渣重复提取一次，合并滤液；(2)向滤液中加入颗粒活性碳进行脱色，陶瓷膜过滤得脱色滤液；(3)将脱色滤液在40～50℃下进行减压浓缩至干，得干燥物，再加入质量比为7～12％的氢氧化钠水溶液，混合均匀后静置20～30min；(4)向第(3)步所得混合溶液加入乙酸乙酯进行萃取，得含有乙酸乙酯的萃取液和不含有乙酸乙酯的水溶液；(5)将含有乙酸乙酯的萃取液减压浓缩至干得到β-谷甾醇产品；(6)将不含有乙酸乙酯的水溶液加入盐酸调节ph，使ph小于5.5以下，加入两倍至三倍体积的石油醚进行萃取得萃取液；(7)将萃取液40℃下减压浓缩至干得到木犀草素粗品用75％乙醇水溶液溶解，加入等体积的45～70℃热水，减压浓缩回收乙醇，余液放入冰箱冷却至4℃下静置48h，得到木犀草素结晶，重结晶一次得到高纯度的木犀草素。
公开号为cn105566273a的中国专利介绍了一种玉米须中木犀草素的提取方法，具体步骤是：a)原料处理：将玉米须制备成玉米须粉末，置于干燥环境中备用；b)微波提取：将步骤a)中玉米须粉末按20ml/g～40ml/g液料比加入体积分数为60％-80％的乙醇溶液中，充分振荡并密封，后置于微波炉中进行微波提取；c)超声波提取：将步骤b)微波处理后的提取液放入超声波清洗器中，进行超声波提取；然后进行离心处理，得到玉米须木犀草素样品液；d)浓缩：将步骤c)得到的玉米须木犀草素样品液在45℃-55℃温度条件下减压浓缩，得到玉米须木犀草素浓缩液；e)储存：将步骤d)得到的玉米须木犀草素浓缩液于2℃-8℃温度条件下避光储存。
综上所述，木犀草素和异槲皮苷均具有较强的药理作用，在医药学领域的应用前景广阔。目前爬山虎未得到综合开发利用，探索从爬山虎中同时提取木犀草素和异槲皮苷意义非凡。
技术实现要素：
目前公开的文献资料仅研究爬山虎中含有木犀草素和异槲皮苷等活性成份，但未对其他活性成分进行综合利用。针对爬山虎的活性成分未综合开发利用问题，本发明提供一种操作简单、工艺合理、快速同时提取木犀草素和异槲皮苷的生产工艺。
本发明采用的技术方案包括：爬山虎粉碎后加入复合菌发酵，乙醇回流提取，过滤，浓缩，加乙醚萃取去除脂溶性物质，碱溶过滤，调节ph再加乙醇后上大孔吸附树脂柱，用含氢氧化钠的乙醇溶液进行洗脱，浓缩，结晶再结晶得异槲皮苷纯品和木犀草素纯品。
因此，本发明提供一种从爬山虎中提取木犀草素和异槲皮苷的方法，具体步骤包括如下：
(1)将爬山虎根茎粉碎后加入水，喷洒5～15％复合菌发酵液2～3天，得发酵物，其中加入水体积l与爬山虎重量kg比为3～5:10。
(2)向发酵物中加入80～90％乙醇溶液回流提取2～4h，过滤得滤液ⅰ，进行浓缩至原有体积的1/30～1/60，得浓缩液ⅰ，其中加入乙醇溶液体积l与爬山虎重量kg比为2～4:1。
(3)将浓缩液ⅰ加两倍体积的乙醚萃取60～120min，去除含乙醚的溶液(上层)后，向其中加入氢氧化钠溶液至ph8.5～9.5，过滤得滤液ⅱ。
(4)将滤液ⅱ的ph调至5.5～6，再加入无水乙醇，上大孔吸附树脂柱，吸附30～60min后，先用两倍至四倍柱体积的水进行洗柱，弃去水洗脱液，用四倍至六倍柱体积的ph7.5的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液ⅰ，其中加入无水乙醇溶液与滤液ⅱ体积l比为3～5:1。
(5)将洗脱液ⅰ调节ph至6后浓缩至原有体积的1/20～1/40，室温下放置至结晶析出，过滤得粗结晶，重结晶得异槲皮苷纯品。
(6)再用四倍至六倍柱体积的ph8.5的乙醇溶液继续进行洗脱，得到洗脱液ⅱ。
(7)将洗脱液ⅱ调节ph至6后浓缩至原有体积的1/25～1/35，结晶，过滤，重结晶得木犀草素纯品。
所述过滤优选陶瓷膜过滤1次，膜孔孔径大小为0.22μm，所述浓缩过程都是在减压条件下进行，温度在55℃～65℃之间。
所述步骤(1)中所述加入复合菌发酵液的量l与爬山虎重量kg比5～15：100；复合菌为市场直接购买的木霉与酵母菌，其混合比例为3：1或4：1。
所述步骤(4)和(6)中所述乙醇溶液优选40～60％乙醇水溶液，即为乙醇与水的混合液，再用0.01mol/l氢氧化钠调节ph，其中40％乙醇溶液是指40ml乙醇加入60ml水进行混合即可。
所述步骤(4)中所述大孔吸附树脂柱优选nka-9、d1400、ads-17、d941。
所述步骤(6)中所述加入乙醇溶液的量l与下层液体ⅰ的体积l比为2～6:1。
技术效果
1、通过爬山虎进行微生物降解预处理，大大提高了爬山虎中异槲皮苷和木犀草素，大大提高了爬山虎的利用率和附加值，这有效降低了木犀草素和异槲皮苷的生产成本。
2、本发明原料采用乙醇回流提取和碱溶解方式，同时获得木犀草素和异槲皮苷醇提物，又提高了提取率，同时缩短了提取时间，又大大节省了能耗。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
实施例1
将100kg爬山虎根茎粉碎后加入40l水，喷洒10l复合菌发酵液3天，得发酵物，向其中加入85％乙醇溶液300l回流提取4h，过滤得滤液ⅰ，进行浓缩至6l，得浓缩液ⅰ。将浓缩液ⅰ加16l乙醚萃取60min，去除含乙醚的溶液(上层)后，向其中加入氢氧化钠溶液至ph9，过滤得5l滤液ⅱ。将滤液ⅱ的ph调至6，再加入20l无水乙醇，上ads-17大孔吸附树脂柱，吸附30～60min后，先用四倍柱体积的水进行洗柱，弃去水洗脱液，用六倍柱体积的ph7.5的乙醇溶液洗脱，收集150l洗脱液ⅰ。将洗脱液ⅰ调节ph至6后浓缩至5l，室温下放置至结晶析出，过滤得粗结晶，重结晶得1.52kg异槲皮苷纯品。再用六倍柱体积的ph8.5的乙醇溶液继续进行洗脱，得到150l洗脱液ⅱ。将洗脱液ⅱ调节ph至6后浓缩至5l，结晶，过滤，重结晶得1.84kg木犀草素纯品。按hplc法检测，异槲皮苷的纯度为98.85％，木犀草素的纯度为99.18％。
对照实施例1
将100kg爬山虎根茎粉碎后加入50l水放置3天，向其中加入85％乙醇溶液300l回流提取4h，过滤得滤液ⅰ，进行浓缩至6l，得浓缩液ⅰ。将浓缩液ⅰ加16l乙醚萃取60min，去除含乙醚的溶液(上层)后，向其中加入氢氧化钠溶液至ph9，过滤得5l滤液ⅱ。将滤液ⅱ的ph调至6，再加入20l无水乙醇，上ads-17大孔吸附树脂柱，吸附30～60min后，先用四倍柱体积的水进行洗柱，弃去水洗脱液，用六倍柱体积的ph7.5的乙醇溶液洗脱，收集150l洗脱液ⅰ。将洗脱液ⅰ调节ph至6后浓缩至5l，室温下放置至结晶析出，过滤得粗结晶，重结晶得934g异槲皮苷纯品。再用六倍柱体积的ph8.5的乙醇溶液继续进行洗脱，得到150l洗脱液ⅱ。将洗脱液ⅱ调节ph至6后浓缩至5l，结晶，过滤，重结晶得1.04kg木犀草素纯品。按hplc法检测，异槲皮苷的纯度为98.56％，木犀草素的纯度为98.87％。
实施例2
将200kg爬山虎根茎粉碎后加入90l水，喷洒25l复合菌发酵液3天，得发酵物，向其中加入85％乙醇溶液700l回流提取4h，过滤得滤液ⅰ，进行浓缩至14l，得浓缩液ⅰ。将浓缩液ⅰ加30l乙醚萃取60min，去除含乙醚的溶液(上层)后，向其中加入氢氧化钠溶液至ph9，过滤得12l滤液ⅱ。将滤液ⅱ的ph调至6，再加入45l无水乙醇，上ads-17大孔吸附树脂柱，吸附30～60min后，先用四倍柱体积的水进行洗柱，弃去水洗脱液，用五倍柱体积的ph7.5的乙醇溶液洗脱，收集320l洗脱液ⅰ。将洗脱液ⅰ调节ph至6后浓缩至5l，室温下放置至结晶析出，过滤得粗结晶，重结晶得3.24kg异槲皮苷纯品。再用五倍柱体积的ph8.5的乙醇溶液继续进行洗脱，得到320l洗脱液ⅱ。将洗脱液ⅱ调节ph至6后浓缩至5l，结晶，过滤，重结晶得3.76kg木犀草素纯品。按hplc法检测，异槲皮苷的纯度为98.90％，木犀草素的纯度为99.23％。