PITX2基因用于筛选伊犁马泌乳性状试剂盒及其应用的制作方法

发明涉及动物遗传选育的鉴定方法，具体的，本发明涉及一种伊犁马泌乳性状筛选的试剂盒的技术领域。

背景技术：

马奶不仅具有较高的营养价值，容易被人体消化吸收，且马奶中各营养成分比例接近人奶，可作为母乳的替代品之一。马奶因其独特的成分自古以来就成为一种医疗用品和滋补营养品。马奶中富含许多免疫活性物质和抗癌物质具有较广泛的药用价值，可以作为一种免疫促进剂，增强人体免疫功能、延缓衰老，还可预防心血管疾病、神经系统疾病以及胃肠道疾病，同时对结核病有预防和治疗作用。但马奶产量低，同时也缺乏乳用马品种，马奶产量远低于牛奶产量，无法满足人们对马奶等具有医疗、保健作用特殊乳制品的需要。因此，提高马奶产奶性能成为了开发利用马奶的首要任务。

单核昔酸多态性(singlesnuleotidepolmorphism，snp)是指在基因组水平上由单个核昔酸的变异所引起的序列多态性。表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现形式有转换、颠换、插入和缺失等。

测序、单链构象多态性聚合酶链式反应(pcr-single-strandconformationpolyrphism，pcr-sscp)是近年来应用较为广泛的一种基因多态性检测技术，即应用一技术对控制家畜性状的基因进行分型，联合经济性状的遗传规律进行分析，找到与经济性状相连锁的重要标记基因，做到早期选种、准确选种。通过分子育种，综合改良畜禽重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。随着分子生物学的快速发展，分子标记在家畜育种中的应用日益广泛，其重要性也日益凸现。

技术实现要素：

针对现有技术中未见报道专门针对pitx2基因在伊犁马泌乳性状筛选中的snp标记研究的技术现状，本发明旨在为了提供了含pitx2基因用于提高伊犁马泌乳性状的检测试剂盒，用于选育提高伊犁马泌乳性状。

本发明提供了一种含pitx2基因用于筛选伊犁马泌乳性状检测试剂盒，所述用于检测pitx2基因的等位基型因包括aa、ab和bb。

本发明中，等位基因型aa、ab和bb从伊犁马血浆中检测。

本发明同时提供一种含pitx2基因用于筛选哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒，包括盒体，盒体上方与盖体通过活动合页连接，盒体底部设置底板，底板内设有电池板，盒体内由隔板二分为96孔板区、枪头区、采血管区、dna提取试剂区、pcr反应试剂区和sscp分型检测试剂区，采血管区、dna提取试剂区、pcr反应试剂区和sscp分型检测试剂区底部均设置抬升机构，抬升机构中，开关两侧设置弹簧柱，弹簧柱顶端高于开关顶端设置，开关下方设置电机，开关和电机间设置定时器，电机输出端向上设置伸缩杆，电机与电池板电性连接。

本发明中，伸缩杆的数量大于四组。

本发明中，96孔板区内设置多组隔板一。

本发明中，盒体一侧设置标签，盒体一侧表面设置透明袋，透明袋内设有说明材料。

本发明中，盖体上设置把手，盒体与底板通过活动锁和合页连接。

本发明中，dna提取试剂区的试剂为蛋白酶k、无水乙醇、缓冲液gb、磁悬浮液b、缓冲液gd、漂洗液pw、洗脱液tb、超纯灭菌水。

本发明中，pcr反应试剂的试剂为2×mastermix、上下游引物和灭菌超纯水。

本发明中，sscp分型检测试剂区的试剂为变性缓冲液、95％甲酰胺、10mmol/ledta、0.05％溴酚兰、0.05％二甲苯青、30％丙烯酰胺、5×tbe、temed、10％过硫酸铵、0.1％硝酸银染色液、2％氢氧化钠、0.1％甲醛、aa等位基因标记物、ab等位基因标记物、bb等位基因标记物。

本发明中，96孔板区放置灭菌96孔板。

本发明中，枪头区放置灭菌枪头。

本发明中，采血管区放置装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管。

本发明提供含pitx2基因用于检测伊犁马泌乳性状的试剂盒，试剂盒通过以下共建体系建成获得：

(1)引物设计及合成：根据ncbi中公布的马pitx2基因序列(genbankid：nc009145.2)，自行人工设计特异性引物。

(2)pcr反应试剂：master、上下游引物、dna模板和ddh2o。

优选的，共建体系(1)中所述的特异性引物如下所示：

pitx2引物：

上游引物f5'-gagcattgtcttcggtga-3'；

下游引物r5'-cgactttaccccattcca-3'。

进一步，本发明提供含pitx2基因用于筛选哈伊犁马泌乳性状检测试剂盒的应用，通过其检测方法体现，包括以下步骤：

(1)伊犁马基因组dna的提取：

利用装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管，活体采集伊犁马颈静脉血5ml，利用以上所述试剂盒提取基因组dna，-20℃保存待用。

(2)pitx2基因pcr扩增：

根据设计的引物，以上所述试剂盒中试剂特异性扩增pitx2基因；pcr反应体系为，由步骤(1)获得的马基因组dna模板1.0μl，pcrmixture10μl，f、r引物各0.5μl，加ddh2o至总体积为20μl；反应条件为，94℃5min，94℃30s，56.5℃30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃5min；4℃保存。

(3)sscp检测：

pcr扩增产物变性，取5μl步骤(2)获得的pcr产物，加入8μl变性缓冲液，95％甲酰胺、10mmol/ledta、0.05％溴酚兰、0.05％二甲苯青，离心后，在pcr仪中98℃变性10min，取出后立即置于冰上，10min后全部上样于8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上。

聚丙烯酰胺凝胶电泳，将适量0.5×tbe缓冲液加入上下槽，预电泳30min后，用微量进样器吸取变性后的pcr产物加入点样孔，电压180v，电流50ma，电泳16h。

染色及显色，将凝胶从电泳槽中取出，用蒸馏水漂洗2次后，加入0.1％硝酸银染色液250ml，放于摇床避光轻摇15min，倒出染色液；加入显色液250ml，浸没凝胶，观察，直到凝胶上显现电泳带；倒出显色液，迅速用去离子水冲洗2-3次；用bio-rad凝胶成像系统成像，根据条带数量和位置进行基因判型。

本发明中，显色液按体积百分比2％氢氧化钠和0.1％甲醛混合制成。

本发明中，非变性聚丙烯酰胺凝胶按体积比30％丙烯酰胺18ml、5×tbe11ml、temed36ml、10％过硫酸铵385μl和超纯水25ml混合制成。

本发明中，伊犁马的pitx2基因特异性引物设计中，通过国际分子生物信息网站ncbi(nationalcenterforbiotechnology)，检索得到马的pitx2基因的dna序列(genbankid:nc009145.2)，借助公知软件primer3.0，自行人工设计特异性引物。

通过采用上述提供的技术方案，本发明获得以下有益效果：

(1)本发明中，虽然如上所述，在构建一种用于选育伊犁马泌乳性状的检测试剂盒中，在采用现有技术中pitx2因作为影响家畜泌乳性状候选基因并构建试剂盒，在新疆伊犁马群体中，pitx2基因snp位点与伊犁马的产奶量相关，存在3种基因型：aa、ab和bb，a为优势等位基因，此位点突变使伊犁马产奶量下降，为选育泌乳性状优良的伊犁马品种，提供分子辅助育种的理论基础和技术支持。

(2)本发明通过提供用于选育伊犁马泌乳性状的试剂盒，利用试剂盒对伊犁马的pitx2基因的表达量进行检测，并与伊犁马的日均产奶量(kg/d)进行差异显著性检验，得出pitx2基因的snp位点与伊犁马泌乳性状密切相关，bb基因型个体的总体日均产奶量极显著低于aa、ab基因型个体(p<0.01)；而bb基因型个体的总体乳蛋白率显著高于aa、ab基因型个体(p<0.05)。在实际生产应用中，可通过选择aa、ab基因型个体，淘汰基因型为bb的个体，选育提高伊犁马的产奶量，用于专门化乳用马品种的培育，对于保护伊犁马的优良品种资源、提高农牧民经济收入、加快乳用马发展具有实际应用价值。

附图说明

图1显示为本发明提供的含pitx2基因用于筛选伊犁泌乳性状的检测试剂盒结构示意图一。

图2显示为本发明提供的含pitx2基因用于筛选伊犁泌乳性状的检测试剂盒结构示意图二。

图1-2中，1—盒体，11—透明袋，111—说明材料，12—标签，13—96孔板区，131—隔板一，14—枪头区，15—采血管区，16—dna提取试剂区，17—pcr反应试剂区，18—sscp分型检测试剂区，19—隔板二，2—底板，21—活动锁，3—盖体，31—活动合页，32—把手，4—抬升机构，41—开关，42—弹簧柱，43—伸缩杆，44—电机，45—定时器。

图3所示为pitx2的pcr检测结果凝胶电泳图，其中m道：d2000dnamarker，1-5道，pitx2基因pcr扩增产物。

图4所示为pitx2基因pcr-sscp检测结果图。

图5所示为pitx2基因测序结果图。

具体实施方式

下面结合附图1-5和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，但本发明的方法不限于下述实施例。

本发明中选用的所有试剂、原料和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

本发明采用的透明袋11、说明材料111、标签12、活动锁21、活动合页31、合页、开关41、弹簧柱42、伸缩杆43、电机44、定时器45和电池板均可通过公共渠道购买或定制。

实施例一：

本发明提供了一种用于检测pitx2基因的伊犁马泌乳性状的检测试剂盒，所述用于检测pitx2基因的等位基型因包括aa、ab和bb。

本发明中，等位基因型aa、ab和bb从伊犁马血浆中检测。

本发明同时提供一种含pitx2基因用于筛选哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒，包括盒体1，盒体1上方与盖体3通过活动合页31连接，盒体1底部设置底板2，底板2内设有电池板，盒体1内由隔板二19分为96孔板区13、枪头区14、采血管区15、dna提取试剂区16、pcr反应试剂区17和sscp分型检测试剂区18，采血管区15、dna提取试剂区16、pcr反应试剂区17和sscp分型检测试剂区18底部均设置抬升机构4，抬升机构4中，开关41两侧设置弹簧柱42，弹簧柱42顶端高于开关41顶端设置，开关41下方设置电机44，开关41和电机44间设置定时器45，电机44输出端向上设置伸缩杆43，电机44与电池板电性连接。

本发明中，伸缩杆43的数量大于四组。

本发明中，96孔板区13内设置多组隔板一131。

本发明中，盒体1一侧设置标签12，盒体1一侧表面设置透明袋11，透明袋11内设有说明材料111。

本发明中，盖体3上设置把手32，盒体1与底板2通过活动锁21和合页连接。

本发明中，dna提取试剂区16的试剂为蛋白酶k、无水乙醇、缓冲液gb、磁悬浮液b、缓冲液gd、漂洗液pw、洗脱液tb、超纯灭菌水。

本发明中，pcr反应试剂区17的试剂为2×mastermix、上下游引物和灭菌超纯水。

本发明中，sscp分型检测试剂区18的试剂为变性缓冲液、95％甲酰胺、10mmol/ledta、0.05％溴酚兰、0.05％二甲苯青，30％丙烯酰胺、5×tbe、temed、10％过硫酸铵、0.1％硝酸银染色液、2％氢氧化钠、0.1％甲醛、aa等位基因标记物、ab等位基因标记物、bb等位基因标记物。

本发明中，96孔板区13放置灭菌96孔板。

本发明中，枪头区14放置灭菌枪头。

本发明中，采血管区15放置装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管。

实施例二：

参见附图4、5，本发明提供含pitx2基因用于筛选哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒中，盒体1上方与盖体3通过活动合页31连接，盒体1底部设置底板2，底板2内设有电池板，盒体1内由隔板二19分为96孔板区13、枪头区14、采血管区15、dna提取试剂区16、pcr反应试剂区17和sscp分型检测试剂区18，采血管区15、dna提取试剂区16、pcr反应试剂区17和sscp分型检测试剂区18底部均设置抬升机构4，抬升机构4中，开关41两侧设置弹簧柱42，弹簧柱42顶端高于开关41顶端设置，开关41下方设置电机44，开关41和电机44间设置定时器45，电机44输出端向上设置伸缩杆43，电机44与电池板电性连接。

本发明中，伸缩杆43的数量大于四组，确保抬升机构4抬升平稳。

本发明中，96孔板区13内设置多组隔板一131，便于放置多组96孔板。

本发明中，盒体1一侧设置标签12，盒体1一侧表面设置透明袋11，透明袋11内设有说明材料111，方便识别和操作参考。

本发明中，盖体3上设置把手32，盒体1与底板2通过活动锁21和合页连接。

在使用本发明提供的含pitx2基因用于筛选哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒时，实验人员通过把手32打开盖体3，从96孔板区13取出96孔板，从枪头区14取出枪头，参照说明材料111，按压采血管区15，采血管区15底部压到开关41，电机44工作，伸缩杆43将采血管区15向上抬起，方便实验人员拿取采血管，定时器45设定时间到后，伸缩杆43收回，弹簧柱42顶住采血管区15，dna提取试剂区16、pcr反应试剂区17和sscp分型检测试剂区18取试剂的操作手法相同，利用装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管，活体采集伊犁马颈静脉血5ml，利用试剂盒提取基因组dna，-20℃保存待用；根据设计的引物，特异性扩增pitx2基因；pcr反应体系为：由获得的马基因组dna模板1.0μl，pcrmixture10μl，f、r引物各0.5μl，加ddh2o至总体积为20μl；反应条件为，94℃5min，94℃30s，56.5℃30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃5min，4℃保存；取5μl的pcr产物，加入8μl变性缓冲液，95％甲酰胺、10mmol/ledta、0.05％溴酚兰、0.05％二甲苯青，离心后，在pcr仪中98℃变性10min，取出后立即置于冰上，10min后全部上样于8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上；将适量0.5×tbe缓冲液加入上下槽，预电泳30min后，用微量进样器吸取变性后的pcr产物加入点样孔，电压180v，电流50ma，电泳16h；将凝胶从电泳槽中取出，用蒸馏水漂洗2次后，加入0.1％硝酸银染色液250ml，放于摇床避光轻摇15min，倒出染色液，加入显色液250ml，浸没凝胶，观察，直到凝胶上显现电泳带，倒出显色液，迅速用去离子水冲洗2-3次，用bio-rad凝胶成像系统成像，根据条带数量和位置进行基因判型；在标签12上做好记录，抬升机构4需要维修时，打开活动锁21，翻转底板2，取出抬升机构4。通过选择基因型为aa、ab的个体，淘汰基因型为bb的个体，提高伊犁马泌乳性状，加快专门化乳用马品种的培育。

实施例三：

本发明提供含pitx2基因用于提高伊犁马泌乳性状的检测试剂盒的应用，通过检测方法体现，具体包括如下步骤：

(1)伊犁马基因组dna的提取：

利用装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管，活体采集伊犁马颈静脉血5ml，利用试剂盒提取基因组dna，-20℃保存待用。

(2)pitx2基因pcr扩增：

根据设计的引物，特异性扩增pitx2基因；pcr反应体系为：由步骤(1)获得的基因组dna模板1.0μl，pcrmixture10μl，f、r引物各0.5μl，加ddh2o至总体积为20μl；反应条件为：94℃5min，94℃30s，56.5℃30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃5min；4℃保存。pitx2的pcr检测结果如附图3所示。

(3)sscp检测：

1)pcr扩增产物变性：取5μl步骤(2)获得的pcr扩增产物，加入8μl变性缓冲液，95％甲酰胺、10mmol/ledta、0.05％溴酚兰、0.05％二甲苯青，离心后，在pcr仪中98℃变性10min，取出后立即置于冰上，10min后全部上样于8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上。

2)聚丙烯酰胺凝胶电泳：将适量0.5×tbe缓冲液加入上下槽，预电泳30min后，用微量进样器吸取变性后的pcr产物加入点样孔，电压180v，电流50ma，电泳16h。

3)染色、显色：a.将凝胶从电泳槽中取出，用蒸馏水漂洗2次后，加入0.1％硝酸银染色液250ml，放于摇床避光轻摇15min，倒出染色液；b.加入显色液250ml，浸没凝胶，观察，直到凝胶上显现电泳带；c.倒出显色液，迅速用去离子水冲洗2-3次；d.用bio-rad凝胶成像系统成像，根据条带数量和位置进行基因判型。引物扩增的基因片段存在三种基因型：aa、ab和bb，检测结果检测结果如附图4所示。

(4)dna测序：

选取pcr产物40μl，进行测序，利用dnaman软件分析对比dna序列，在伊犁马中确定snp位点g.115289715dela，该位点位于马第2号染色体pitx2基因上，总长度为279bp，pitx2基因的分型结果图5所示。

实施例四：

本发明提供含pitx2基因用于提高伊犁马泌乳性状的检测试剂盒，试剂盒通过以下共建体系建成获得：

(1)引物设计及合成：根据ncbi中公布的伊犁马pitx2基因序列(genbankid:nc009145.2)，自行人工设计特异性引物。

(2)pcr反应试剂：master、上下游引物、dna模板和ddh2o。

优选的，共建体系(1)中所述的特异性引物如下所示：

pitx2引物：

上游引物f5'-gagcattgtcttcggtga-3'；

下游引物r5'-cgactttaccccattcca-3'。

实施例五：

按照实施例三中的方法进行操作，统计的分型结果，利用软件spss17.0，对pitx2基因不同基因型与伊犁马泌乳性状(日均产奶量、乳蛋白率)进行关联分析，结果如下表1。

表1：伊犁马pitx2基因不同基因型与平均日泌乳量的关联分析

注：mean±sd表示平均值±标准差；同行数据，肩标为不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)。

从表1中可以看出，在伊犁马群体中，bb基因型个体的总体日均产奶量极显著低于aa、ab基因型个体(p<0.01)；而bb基因型个体的总体乳蛋白率显著高于aa、ab基因型个体(p<0.05)。

结果表明，该snp位点可作为伊犁马产奶量相关的一个分子标记，选择基因型为aa、ab的个体，淘汰基因型为bb的个体，可用于选育产奶量高的伊犁马个体，提高伊犁马泌乳性状。

实施例六：

按照实施例三中的方法进行操作，将本发明提供的试剂盒应用于伊犁马、哈萨克马、新吉尔吉斯马、柯尔克孜马、库素木马中，pitx2基因在马泌乳性状(日均产奶量、乳蛋白率)的关联度。具体见表2和表3。

表2：pitx2基因与日均产奶量的关联度

注：mean±sd表示平均值±标准差；同行数据，肩标为不同小写字母时，表示差异显著(p<0.05)。肩标为不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)。

表3：pitx2基因与乳蛋白率的关联度

注：mean±sd表示平均值±标准差；同行数据，肩标为不同小写字母时，表示差异显著(p<0.05)

由表2可以看出，伊犁马pitx2基因aa、ab基因型个体日均泌乳量显著高于bb基因型，差异极显著(p＜0.01)表示极强关联度；马伊犁马、新吉尔吉斯马、柯尔克孜马、库素木马pitx2基因aa、ab基因型个体平均日泌乳量与bb基因型个体平均日泌乳量没有显著差异，无明显关联度。由表3可以看出，伊犁马pitx2基因bb基因型个体乳蛋白率显著高于aa、ab基因型，差异极显著(p＜0.01)表示极强关联度；马伊犁马、新吉尔吉斯马、柯尔克孜马、库素木马pitx2基因bb基因型个体平均日泌乳量与aa、ab基因型个体平均日泌乳量没有显著差异，无明显关联度，说明方法具有较好的特异性。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

序列表

<110>新疆农业大学

<120>pitx2基因用于筛选伊犁马泌乳性状试剂盒及其应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gagcattgtcttcggtga18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cgactttaccccattcca18