一种耐热性提高的L-氨基酸脱氨酶突变体及其制备方法与流程

文档序号：16501677发布日期：2019-01-05 08:46阅读：265来源：国知局

本发明属于生物技术领域，涉及一种提高l-氨基酸脱氨酶热稳定性的方法。

背景技术：

l-氨基酸脱氨酶，存在于真菌、放线菌、细菌中，是一类fad依赖型黄素酶，在有氧条件下，直接氧化l-氨基酸产生对应的酮酸和氨。在日用化学品、医药合成、食品加工等领域广泛使用。用l-氨基酸脱氨酶催化合成相应的酮酸，能够使氧化过程在相对温和的条件下高效地合成，避免高温、高压、强酸催化过程，同时还能在不使用或少使用诱导剂的情况下，实现高效的表达。整个过程高效，产品质量稳定。更为重要的是，酶法所生产的酮酸产品，不含有毒有害的强酸、重金属等成分，产生生物安全性好，可用于化妆品、医药等高附加值的领域。但目前l-氨基酸脱氨酶的酶比活较低，而且热稳定性比较差，酶使用周期短，影响其工业化运用。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是克服现有的l-氨基酸脱氨酶存在的上述酶比活较低、热稳定性差、酶使用周期短的缺陷，提供一种耐热性提高的l-氨基酸脱氨酶突变体。

本发明采用如下的技术方案：一种耐热性提高的l-氨基酸脱氨酶突变体，是对奇异变形杆菌(proteusmirabilis)l-氨基酸脱氨酶进行定点突变获得的酶突变体，其中突变位点为120位的trp。

本发明通过理性选择突变位点，是由奇异变形杆菌(proteusmirabilis)l-氨基酸脱氨酶（l-aminoaciddeaminase，laad）基因（genbank登录号eu669819.1），通过对其蛋白结构（pdb：5fjm）的分析，运用定点突变的方法而获得的脂肪酶突变体。原始l-氨基酸脱氨酶laad氨基酸序列seqidno：1中在氨基酸取代位置发生突变，采用“原始氨基酸-位置-替换的氨基酸”来表示l-氨基酸脱氨酶酶突变体中突变的氨基酸。

作为优选，120位的trp突变为ala或leu。

作为优选，突变体的dna序列为seqno.2、或seqno.3。

本发明还提供上述突变体的制备方法，包括如下步骤：

（1）全基因合成来源于奇异变形杆菌(proteusmirabilis)l-氨基酸脱氨酶（l-aminoaciddeaminase，laad）基因（genbank登录号eu669819.1），ndeⅰ和hindⅲ连入pet24a，构建质粒laad，转化至e.colibl21(de3)，构建重组菌pmlaad；

（2）以质粒laad（pet24a为表达载体，表达l-氨基酸脱氨酶基因）为模板，利用重叠延伸pcr方法引入目的突变氨基酸位点，先分段扩增含有突变氨基酸位点的上下游片段，然后将带有突变位点基因片段拼接成含有突变位点全长基因片段；

（3）将上述扩增产物经dna纯化后，限制性内切酶dpni对纯化的dna片段酶切消化，纯化后，转化至大肠杆菌e.colidh5α感受态细胞，得到突变体质粒；

（4）将突变体质粒电转至宿主细胞，将转化液涂布于含有卡纳霉素的lb平板中，37℃培养16h；

（5）挑取平板上单菌落于lb培养基中，置摇床37度，220rpm培养至od600=0.5-1，加iptg至终浓度为0.1mm，并降温至25℃诱导20小时，离心收集菌体并超声破胞，进行酶活测定来确定获得l-氨基酸脱氨酶突变体。

所述pcr的引物序列如下：

所述宿主细胞为大肠杆菌（e.coli）。

通过实施上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明基于蛋白空间结构信息，对结构内部特殊氨基酸位点周围的空间环境及氨基酸之间包括氢键，离子键，范德瓦尔里等的相互作用进行分析，结合分子生物学技术对特定的氨基酸位点进行改造，通过理性设计突变位点，运用定点突变的方法获得l-氨基酸脱氨酶突变体，可提高获得正向突变的酶突变体的概率，同时也大大减少了突变体筛选的工作量。本发明提高了酶的结构稳定性，进而有利于延长酶的使用寿命。

（2）本发明所得突变体为trp120ala，trp120leu两个热稳定性提高的突变体，更适合工业生物转化的应用。

具体实施方式

实施例1：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例中涉及到的培养基配方如下：

lb液体培养基：酵母提取液0.5%，蛋白胨1%，nacl1%，ph7.0。121℃灭菌20min。制作平板时加入琼脂2%，121℃灭菌20min。

卡那霉素抗生素筛选时，终浓度为50mg/l。

上述培养基中的单位为%（w/v）。

实施例1：

1.l-氨基酸脱氨酶120氨基酸位点突变体构建

全基因合成来源于奇异变形杆菌(proteusmirabilis)l-氨基酸脱氨酶（l-aminoaciddeaminase，laad）基因（genbank登录号eu669819.1），ndeⅰ和hindⅲ连入pet24a，构建质粒laad，转化至e.colibl21(de3)，构建重组菌pmlaad。

提取重组菌pmlaad的质粒laad，以质粒laad为模板，采用定点突变技术构建突变体trp120ala，trp120leu，利用重叠延伸pcr方法引入目的突变位点，定点突变反应条件：

使用的引物，见下表：

pcr扩增条件：94℃2min；94℃20s，55℃30s，68℃6min，25个循环；68℃10min,4℃5min，end。重叠延伸pcr扩增产物经限制性内切酶dpni酶切消化，电转化至大肠杆菌e.colidh5α感受态细胞。涂布于lb（含50mg/lkan）平板。生长16h后，挑取平板上10个单菌落进行菌落pcr，挑取阳性克隆通过基因测序，结果表明获得了正确的突变质粒。

2.l-氨基酸脱氨酶及其突变体重组菌株

将突变质粒电转至e.colibl21（de3）感受态态细胞。将转化液涂布于lb（50mg/lkan）平板，37℃培养16h，挑取平板上单菌落于100mllb培养基中，置摇床37度，220rpm培养至od600=0.5-1，（本实施例中od600=0.5）加iptg至终浓度为0.1mm，并降温至25℃诱导20小时后，离心收集菌体并超声破胞，进行酶活测定来确定获得l-氨基酸脱氨酶重组菌株。

原始菌株按同样的流程收集菌体并超声破胞。

原始l-氨基酸脱氨酶laad氨基酸序列seqidno：1中在氨基酸取代位置发生突变。

突变体的dna序列为seqno.2或seqno.3。

3.l-氨基酸脱氨酶突变体热稳定性测定

l-氨基酸脱氨酶活性测定：反应总体系为200μl，酶活性采用相对酶活性表示，hplc检测产物浓度来表示酶活力的大小。

实验组：向试管先各加入20μl的500mmph6.5的磷酸盐缓冲液，然后加入50μl的破胞酶液（突变菌株），置于30℃摇床中预热30min。然后加入130μl的l-phe底物溶液（10g/l，ph6.5,30℃预热30min），置于30℃摇床，250rpm反应30min，反应结束后，加入1.8ml的磷酸水溶液（ph3），并100℃水浴处理3min。离心取上清，hplc检测产物酮苯丙氨酸浓度。

对照组：向试管先加入20μl的500mmph6.5的磷酸盐缓冲液，然后加入50μl的破胞酶液（原始菌株），置于30℃摇床中预热30min。然后加入130μl的l-phe底物溶液（10g/l，ph6.5,30℃预热30min），置于30℃摇床，250rpm反应30min，反应结束后，加入1.8ml的磷酸水溶液（ph3），并100℃水浴处理3min。离心取上清，hplc检测产物酮苯丙氨酸浓度。

hplc检测条件：

流动相a：磷酸盐缓冲液（10mmol/l的磷酸二氢钾溶液，用磷酸调节ph值至3.5）；

流动相b：甲醇；

检测柱：c18，250*4.6mm*4.5μm；

检测波长：210nm；

流速：1ml/min；

柱温：35℃；

进样量：10μl；

梯度洗脱程序：

l-氨基酸脱氨酶保留酶活率的测定：

将超声破胞酶液于60℃下孵育1h，后4℃放置20min，检测酶的残留活力，根据实验组和对照组的数据的差异，并与初始酶活（0h）进行比较获得相对酶活性，残留酶活百分比（%）。试验数据如下表。

结果显示，两个trp120突变体耐热性均有不同程度的提高。其中trp120ala突变体60℃处理1h，酶活残留为75%，比野生型的l-氨基酸脱氨酶提高了3.3倍，具有更好的热稳定性能。同时突变株trp120ala酶活略有下降，而trp120leu突变株酶活有提高。

序列表

<110>浙江正硕生物科技有限公司

<120>一种耐热性提高的l-氨基酸脱氨酶突变体及其制备方法

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>471

<212>prt

<213>奇异变形杆菌(proteusmirabilis)

<220>

<222>(1)..(471)

<223>原始laad的氨基酸序列

<400>1

metalaileserargarglyspheileleuglyglythrvalvalala

151015

valalaalaglyalaglyvalleuthrprometleuthrargglugly

202530

argphevalproglythrproarghisglyphevalgluglythrgly

354045

glyproleuprolysglnaspaspvalvalvalileglyalaglyile

505560

leuglyilemetthralaileasnleualagluargglyleuserval

65707580

thrilevalglulysglyasnilealaglygluglnserserargphe

859095

tyrglyglnalailesertyrlysmetproaspgluthrpheleuleu

100105110

hishisleuglylyshisargtrpargglumetasnalalysvalgly

115120125

ileaspthrthrtyrargthrglnglyargvalgluvalproleuasp

130135140

glugluaspleugluasnvalarglystrpileaspalalysserlys

145150155160

aspvalglyseraspilepropheargthrlysmetilegluglyala

165170175

gluleulysglnargleuargglyalathrthrasptrplysileala

180185190

glypheglugluaspserglyserpheaspprogluvalalathrphe

195200205

valmetalaglutyralalyslysmetglyilelysilephethrasn

210215220

cysalaalaargglyleugluthrglnalaglyvalileseraspval

225230235240

valthrglulysglyproilelysthrserargvalvalvalalagly

245250255

glyvalglyserargleuphemetglnasnleuasnvalaspvalpro

260265270

thrleuproalatyrglnserglnglnleuileseralaalaproasn

275280285

alaproglyglyasnvalalaleuproglyglyilephepheargasp

290295300

glnalaaspglythrtyralathrserproargvalilevalalapro

305310315320

valvallysgluserphethrtyrglytyrlystyrleuproleuleu

325330335

alaleuproasppheprovalhisileserleuasngluglnleuile

340345350

asnserphemetglnserthrhistrpaspleuasnglugluserpro

355360365

pheglulystyrargaspmetthralaleuproaspleuprogluleu

370375380

asnalaserleuglulysleulyslysglupheproalaphelysglu

385390395400

serthrleuileaspglntrpserglyalametalailealaproasp

405410415

gluasnproileileseraspvallysglutyrproglyleuvalile

420425430

asnthralathrglytrpglymetthrgluserprovalseralaglu

435440445

ilethralaaspleuleuleuglylyslysprovalleuaspalalys

450455460

propheserleutyrargphe

465470

<210>2

<211>1416

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<220>

<222>(1)..(1416)

<223>突变株trp120aladna序列

<400>2

atggcaataagtagaagaaaatttattcttggtggcacagtggttgctgttgctgcaggc60

gctggggttttaacacctatgttaacgcgagaagggcgttttgttcctggtacgccgaga120

catggttttgttgagggaactggcggtccattaccgaaacaagatgatgttgttgtaatt180

ggtgcgggtattttaggtatcatgaccgcgattaaccttgctgagcgtggcttatctgtc240

acaatcgttgaaaaaggaaatattgccggcgaacaatcatctcgattctatggtcaagct300

attagctataaaatgccagatgaaaccttcttattacatcacctcgggaagcaccgcgcg360

cgtgagatgaacgctaaagttggtattgataccacttatcgtacacaaggtcgtgtagaa420

gttcctttagatgaagaagatttagaaaacgtaagaaaatggattgatgctaaaagcaaa480

gatgttggctcagacattccatttagaacaaaaatgattgaaggcgctgagttaaaacag540

cgtttacgtggcgctaccactgattggaaaattgctggtttcgaagaagactcaggaagc600

ttcgatcctgaagttgcgacttttgtgatggcagaatatgccaaaaaaatgggtatcaaa660

attttcacaaactgtgcagcccgtggtttagaaacgcaagctggtgttatttctgatgtt720

gtaacagaaaaaggaccaattaaaacctctcgtgttgttgtcgccggtggtgttgggtca780

cgtttatttatgcagaacctaaatgttgatgtaccaacattacctgcttatcaatcacag840

caattaattagcgcagcaccaaatgcgccaggtggaaacgttgctttacccggcggaatt900

ttctttcgtgatcaagcggatggaacgtatgcaacttctcctcgtgtcattgttgctccg960

gtagtaaaagaatcatttacttacggctataaatatttacctctgctggctttacctgat1020

ttcccagtacatatttcgttaaatgagcagttgattaattcctttatgcaatcaacacat1080

tgggatcttaatgaagagtcgccatttgaaaaatatcgtgatatgaccgctctgcctgat1140

ctgccagaattaaatgcctcactggaaaaactgaaaaaagagttcccagcatttaaagaa1200

tcaacgttaattgatcagtggagtggtgcgatggcgattgcaccagatgaaaacccaatt1260

atctctgatgttaaagagtatccaggtctagttattaatactgcaacaggttggggaatg1320

actgaaagccctgtatcagcagaaattacagcagatttattattaggcaaaaaaccagta1380

ttagatgccaaaccatttagtctgtatcgtttctaa1416

<210>3

<211>1416

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<220>

<222>(1)..(1416)

<223>突变株trp120leudna序列

<400>3

atggcaataagtagaagaaaatttattcttggtggcacagtggttgctgttgctgcaggc60

gctggggttttaacacctatgttaacgcgagaagggcgttttgttcctggtacgccgaga120

catggttttgttgagggaactggcggtccattaccgaaacaagatgatgttgttgtaatt180

ggtgcgggtattttaggtatcatgaccgcgattaaccttgctgagcgtggcttatctgtc240

acaatcgttgaaaaaggaaatattgccggcgaacaatcatctcgattctatggtcaagct300

attagctataaaatgccagatgaaaccttcttattacatcacctcgggaagcaccgcctg360